Пороговые свойства системы свертывания крови in vitro при активации тканевым фактором

Система гемостаза обеспечивает целостность кровеносной системы в организме человека. Выделяются три составляющих: тромбоцитарный гемостаз, плазменный гемостаз и сосудистый гемостаз. Все три составляющие необходимы для эффективного предотвращения кровопотери: агрегировавшие в месте повреждения тромбоциты обеспечивают прочность сгустка, образованная в результате работы плазменной системы свертывания фибриновая полимерная сеть скрепляет клетки и предотвращает просачивание жидкости, вазоконстрикция сосудов перераспределяет ток крови, уменьшая его в месте повреждения. Важной особенностью протекания реакций свертывания является пространственная гетерогенность этого процесса — свертывание запускается от места повреждения, а реакции проходят в объеме крови на фосфолипидных мембранах.

На данный момент хорошо изучены все компоненты системы свертывания с точки зрения биохимии — известны константы реакции, условия протекания реакций и др. Однако, так как система состоит более чем из 30 элементов, связанных между собой множеством реакций, сложно предсказать ее работу в целом и влияние на нее отдельных параметров. В медицинском аспекте это проявляется в том, что до сих пор неясно, почему, например, дефицит одного белка системы приводит к сильнейшей кровоточивости, а другого — остается незамеченным организмом. Более половины смертей в мире имеют в качестве непосредственной причины нарушения свертывания крови тромбозы или кровотечения [1−4]. Поэтому изучение работы этой системы является важной биофизической и медицинской задачей.

Система свертывания должна обладать пороговыми свойствами, чтобы избежать случайного возникновения тромбов и запускаться только в случае наличия повреждения. Под порогом по активации свертывания здесь и далее понимается минимальное ненулевое количество активатора свертывания, вызывающего образование фибринового сгустка. Существуют указания на такое свойство в системе свертывания крови [5−7]. Однако до сих пор не были проведены эксперименты, в которых зарегистрировали пороговые значения активатора свертывания. Во всех проведенных ранее исследованиях в образце цельной крови или плазмы без добавления активатора свертывания происходило формирование сгустка.

Пороговое поведение системы свертывания связывают с наличием в ней положительных обратных связей. Положительная обратная связь позволяет ускорить образование продукта реакции за счет того, что он влияет на собственное производство. В системе свертывания основным таким регулятором является тромбин — последний фермент каскада реакций, превращающий растворимый белок фибриноген в 7 нерастворимый полимеризующийся фибрин. Тромбин вступает в реакции, приводящие к еще большей наработке самого тромбина в системе. В математических моделях, описывающих работу систем типа системы свертывания, активно изучается функция таких обратных связей [8−15]. Было показано, что они позволяют ускорить на порядки работу системы и обеспечить выборочную чувствительность системы к запускающему сигналу — свертывание начинается только при получении сигнала, выше определенного уровня. Однако, из клинических примеров хорошо известно, что отсутствие того или иного фактора системы свертывания, участвующего в своей положительной обратной связи, по-разному влияет на здоровье человека. Так, при тяжелой форме гемофилии, А больные нуждаются в постоянном восполнении недостающего элемента системы свертывания [16−18], а при гемофилии С заболевание проявляет себя только при серьезных травмах [19], редко встречающийся дефицит фактора V иногда ассоциирован с тромбоэмболиями [20,21], а дефицит фактора VII парадоксальным образом может сопровождаться тяжелыми тромбозами [22]. При этом степень кровоточивости не всегда коррелирует с уровнем дефицитного фактора, так что пациенты с одинаковым исходным уровнем фактора нуждаются в индивидуальном подборе терапии.

В данной работе изучались пороговые свойства системы свертывания человека и исследована роль положительных обратных связей с использованием экспериментов in vitro и математического моделирования. Целью работы являлось изучение пороговых свойств системы свертывания крови и роли положительных обратных связей активации факторов V, VII, VIII в активации свертывания и формировании фибринового сгустка в системе in vitro. Отличительной особенностью работы является исследование пороговых свойств в системах in vitro с различной пространственной организацией: активация свертывания в объеме (однородная система), на поверхности и от единичных клеток (пространственно-распределенные системы). Пространственно-распределенная система свертывания in vitro имитирует рост сгустка от стенки сосуда. В такой системе реакции свертывания запускаются на поверхности с тканевым фактором и распространяются вглубь тонкого неперемешиваемого слоя плазмы. Поверхность с клетками, вызывающими свертывание крови, позволяет выяснить роль единичных клеток в формировании фибринового сгустка. Математическая модель системы свертывания позволила обнаружить вероятные элементы регуляции в системе и спроектировать эксперименты, проверяющие теоретические представления. Клинически наиболее актуальной частью работы было исследование влияния замещающей терапии факторами свертывания VIII при гемофилии А.

Цель работы: Изучить пороговые свойства свертывания крови и роль положительных обратных связей в формировании фибринового сгустка в системе in vitro.

Задачи исследования:

1. Исследовать пороговые свойства при активации свертывания свободной от тромбоцитов плазмы крови в пространственно-однородной системе.

2. Исследовать пороговые свойства при активации свертывания свободной от тромбоцитов плазмы крови в пространственно-распределенной системе при активации поверхностью с равномерно иммобилизованным тканевым фактором.

3. Сравнить формирование фибринового сгустка при активации свертывания от равномерно иммобилизованного на поверхности тканевого фактора и от клеток, экспрессирующих тканевый фактор.

4. Выявить роль положительных обратных связей в процессе активации и формирования фибринового сгустка.

5. Изучить динамику формирования сгустка у пациентов с гемофилией, А при введении им фактора VIII.

Научная новизна. Показано существование порога в свободной от тромбоцитов плазме крови по концентрации тканевого фактора (в пространственно-однородной системе) и плотности тканевого активатора на поверхности (в пространственно-распределенной системе). В работе впервые экспериментально измерена величина порога по активации свертывания. Показано, что положительная обратная связь активации фактора V тромбином позволяет системе свертывания осуществить быстрый переход из неактивного состояния к образованию плотного фибринового сгустка при небольших изменениях концентрации и плотности тканевого фактора. При переходе от пространственно-однородной постановки к пространственно-распределенной меняется вклад отдельных реакций в процесс свертывания плазмы крови. Впервые измерена зависимость параметров роста сгустка в пространстве от плотности и распределения тканевого фактора. Показано, что рост сгустка зависит от локальной плотности активатора, а не от его количества. При этом даже единичный фибробласт — клетка с большой плотностью тканевого фактора на мембране — способен эффективно активировать свертывание крови. Впервые экспериментально показана значимость положительной обратной связи активации VII фактора фактором Ха. В экспериментах с плазмой больных гемофилией, А показано, что при введении пациентам фактора VIII изменяются параметры роста сгустка в пространственно-распределенной системе. Динамика этих изменений, по-видимому, коррелирует с клиническим проявлением заболевания.

Научно-практическое значение. Полученные в работе данные о регуляции работы системы свертывания могут впоследствии быть применены в области лечения и создания новых препаратов для пациентов с дефицитами факторов свертывания. В работе показано, что метод, созданный на основе пространственно-распределенной модели, может быть использован для оценки и подбора терапии при восполнении недостающих компонентов системы свертывания. Это позволяет поддерживать систему свертывания пациентов вблизи нормальных показателей свертывания на протяжении всего времени между двумя инъекциями препарата.

Положения, выносимые на защиту:

1. Система свертывания крови обладает порогом при активации тканевым фактором, равномерно распределенным по объему и по поверхности.

2. Тканевый фактор, сосредоточенный на пятнах, вызывает свертывание, а то же его количество, распределенное равномерно по поверхности — не вызывает свертывания.

3. Порог при активации свертывания в пространственно-однородной системе регулируется положительной обратной связью активации фУ тромбином, а порог по активации и чувствительность к распределению активатора в пространственно-распределенной системе регулируются положительными обратными связями активации фУ тромбином и фУП фактором Ха.

4. Скорость роста сгустка в пространстве коррелирует с клиническим течением гемофилии А.

Выводы.

1. Система свертывания крови обладает порогом при активации тканевым фактором равномерно распределенным по объему.

2. Порог при активации свертывания в гомогенной системе регулируется положительной обратной связью активации фактора V тромбином.

3. Система свертывания крови обладает порогом при активации тканевым фактором равномерно распределенным по поверхности.

4. Система свертывания чувствительна к локальной плотности тканевого фактора, но не к его общему количеству в системе.

5. Порог по активации и чувствительность к распределению активатора в пространственно-распределенной системе регулируются положительными обратными связями активации фактора V тромбином и фактора VII фактором Ха.

6. Скорость роста сгустка в пространстве коррелирует с клиническим течением гемофилии А.

Благодарности.

Автор выражает глубокую и искреннюю благодарность людям, без которых эта работа была бы невозможна:

Сотрудникам лаборатории физической биохимии:

Алексею Михайловичу Шибеко за помощь в разработке и реализацию математической модели свертывания.

Висилию Ивановичу Сарбашу и Сергею Сергеевичу Карамзину за создание установки по исследованию пространственного роста сгустка.

Игорю Игоревичу Шмыреву и Ольге Александровне Фадеевой за создание поверхностей с иммобилизованным тканевым фактором.

Елене Ивановне Синауридзе, Андрею Александровичу Бутылину, Борису Ефимовичу Мовшеву и многим другим сотрудникам лаборатории за советы, помощь и поддержку.

Сотрудникам отделения реконструктивно-восстановительной ортопедии для больных гемофилией:

Константину Геннадиевичу Копылову и Марии Алексеевне Кумсковой за активное участие, поддержку и постоянный интерес к работе.

Сотрудникам станции переливания крови за предоставленную возможность работать с кровью доноров.

Людмиле Ивановне Ульяновой за ее многолетний самоотверженный труд по культивированию клеток.

Особая благодарность моему научному руководителю.

Фазоилу Иноятовичу Атауллаханову, за его помощь, поддержку и внимание, а также за создание замечательной атмосферы для работы в его лаборатории и Михаилу Александровичу Пантелееву, чей вклад в эту работу неоценим.