Рост, микроклубнеобразование и активность антиоксидантных ферментов у устойчивых к засолению генотипов картофеля in vitro

Актуальность работы.

Различные факторы окружающей среды постоянно оказывают влияние на живые организмы. К ним относятся, как и биотические (прямые и косвенные) факторы, так и абиотические (климатические, почвенные, орографические) факторы. Соответственно, разные организмы реагируют по-разному на изменения окружающей среды. Данным воздействиям особенно подвержены растения, так как имеют прикрепленный образ жизни.

Крайне неблагоприятные для растений условия проживания характерны для многих стран. Наиболее распространенными неблагоприятными факторами являются засуха, низкие и высокие температуры, переувлажнение. Еще одним из таких неблагоприятных факторов, широко распространенных в окружающей среде, является гипоксия, другими словами недостаток кислорода. Чаще всего гипоксия наблюдается при переувлажнении или даже затоплении почв, вызванными обильными поливами и сильными дождями, быстрым таянием снегов (Кузнецов, Дмитриева, 2006), при образовании ледяной корки на поверхности почвы и т. д. Однако при нормальной влажности почвы растения не испытывают недостатка кислорода, но при переувлажнении вода заполняет почвенное пространство (особенно на глинистых почвах) тем самым вытесняя воздух. При высокой температуре корни растений быстро используют вес имеющийся кислород, что в результате и приводит к недостатку кислорода (гипоксии) или даже к его полному отсутствию (аноксии), что в свою очередь влияет на физиологические процессы или даже приводит к гибели растения (Кузнецов, Дмитриева, 2006). С гипоксическим или аноксическим воздействием также связано влияние другого неблагоприятного фактора — окислительного стресса.

В настоящее время биотехнологизация сельскохозяйственных растений/культур рассматривается как один из главных подходов в решении проблем повышении урожайности и создания стрессоустойчивых растений. Особое место в этом направлении занимает получение растений, обладающих устойчивостью к засолению и засухе. В будущем одним из факторов лимитирующих продуктивность культурных растений является засоление почвы. Подсчитано, что количество засоленных почв с каждым годом возрастает и через 25−30 лет достигнет угрожающего уровня. Примерно 40% пахотных земель будут непригодными для сельскохозяйственного возделывания растений. Поэтому особую актуальность приобретает изучение физиологических и молекулярных механизмов устойчивости культурных растений к стрессорным природным факторам.

Стрессорные природные факторы, такие как засуха, высокая температура, засоление почвы провоцируют в клетках растений сверхпродукцию активных форм кислорода (АФК), как проявление окислительного стресса (Mittler, 2002). Вместе с тем, роль образующегося при стрессе перекиси водорода двойственна. Во многих случаях перекись водорода участвует в передачах сигналов как вторичный мессенджер, который защищает растение от стресса, активируя синтез ферментов-антиоксидантов (Van Breusegem et all, 2001).

Показано, что высокая концентрация хлористого натрия (NaCl) вызывает индукцию окислительного стресса, сопровождающегося разрушением мембран и деградацией хлорофилла (Meloni et al., 2003). При этом происходит образование малонового диальдегида (МДА) — продукта перекисного окисления липидов мембран (Dionisio-Sese, Tobita, 1998).

Было установлено, что растения томата, хлопчатника и пшеницы обладают большей устойчивостью к повреждению в условиях стресса, особенно при засолении, благодаря высокой активности антиоксидантной системы (Shalata et. al., 2001). Анализ данных показал, что растения пшеницы, выращенные на питательной среде с аммонием, более устойчивы к развитию окислительного стресса в листьях, чем растения, выращенные на среде с нитратами (Полесская и др., 2006). Накопление МДА в условиях солевого стресса в листьях было четко выражено в N0— и N-дефицитных растениях и не наблюдалось у растений, выращенных на среде с NH^.

В литературе обсуждается роль ионов азота как сигнальных соединений, оказывающих влияние на экспрессию генов, контролирующих активность фотосинтеза и усвоение азота (Полесская и др., 2004). Поэтому выборочное использование форм азота в культуре in vitro позволяет более точно ответить на вопрос о роли антиоксидантных систем клетки в усилении или уменьшении устойчивости растений к солевому стрессу.

В связи с этим определенный интерес представляют изыскания регуляторных веществ, ослабляющих действие стресса на растение, главным образом солевого стресса. Нами ранее было показано, что паклобутразол (ГГБ) -синтетический регулятор роста, ингибируя ростовые процессы пробирочных растений, резко стимулировал образование микроклубней in vitro (Шукурова и др., 2007). Другие исследователи показали, что ПБ ослабляет действие солевого стресса на растения гуавы, в частности виноградной лозы (Mehomachi et al., 1996) и пшеницы, на стадии опыления (Хайихамеми и др., 2009), но данных о его воздействии на растения картофеля практически отсутствуют.

Паклобутразол ((2RS, ЗЕ18)-1-(4-хлорфенил)-4,4-диметил-(1, 2, 4-триазол) — пентан-3-ол) является триазольным регулятором роста растений. Известно, что триазол в растениях катализирует микросомальные окислительные реакции и таким образом ингибирует биосинтез гиббереллиновой кислоты (ГК) и катаболизм абцисовой кислоты (АБК) (Abou et al., 1997). Возможно, ПБ блокирует биосинтез ГК, и поэтому ингибирует рост и развитие растений (Abou et al., 1997; Murashige, Skoog, 1962; Шукурова и др., 2010; Fletcher et al., 2000).

Поэтому возможность регулирования регуляторами роста физиологического потенциала, заложенного в генотипе растения, можно использовать для повышения толерантности растений к стрессовым факторам среды.

Цель и задачи работы. Целью данной работы являлось изучение реакции разночувствительных гибридов картофеля к засолению в условиях in vitroвозможности повышения устойчивости растений-регенерантов путем использования регуляторов роста, фитогормонов и разных форм азота, а также выявление роли ростовых процессов, активности антиоксидантных фермен тов и перекисного окисления липидов (ПОЛ) в формировании устойчивости растений к солевому стрессу.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

• оценить устойчивость растений-регенерантов к засолению;

• выбрать индуцированную систему и определить концентрацию инициирующих факторов;

• разработать условия микроклубнеобразования и оптимизации получения исходного материала in vitroизучить роль антиоксидантных ферментов в формировании устойчивости гибридов картофеля к солевому стрессу;

• изучить влияние фитогормонов на устойчивость генотипов картофеля к засолению;

Научная новизна работы. Показано, что применение паклобутразола и кинетина в определенных концентрациях в качестве регуляторных факторов способствует улучшению процесса микроклубнеобразования in vitro и повышению устойчивости растений картофеля к засолению.

Выявлено нарушение взаимовлияния цитокининов и ауксинов в регуляции морфофизиологических процессов у длительно культивируемых растений картофеля in vitro. При длительном культивировании растений in vitro происходит ослабление эпигенетических процессов, регулирующих рост, развитие регенерантов и стрессоляторных систем клетки, в отличие от вновь введенных в культуру меристемных и/или столоновых растений.

Получены результаты, которые дают основание утверждать, что интенсификация перекисного окисления липидов (ПОЛ) и снижение антиоксидантного потенциала у растений-регенерантов в условиях нитратного питания (N0-) приводит к формированию «окислительного стресса», который более выражен у неустойчивых генотипов, чем у устойчивых, и является одним из физиологических механизмов, понижающих толерантность растений к стрессу.

Практическая ценность. Получение растений из меристемных и столоновых культур in vitro позволяет ускорить создание системы получения оздоровленного базисного семенного картофеля. Использование регуляторов роста и различных форм азота в системе in vitro может служить методом для изучения физиологических механизмов устойчивости к стрессорным факторам, а также может быть рекомендовано для тестирования толерантных форм картофеля и других культурных видов растений на солеустойчивость. Выявление гибридов картофеля с высокой активностью СОД может расширить набор пищевых диетических продуктов для человека как источников антиоксидантов.

Апробация работы.

Материалы диссертации представлены на следующих конференциях, симпозиумах, совещаниях:

• Научная конференция памяти академика Ю. С. Насырова «Достижения современной физиологии растений: теоретические и прикладные аспекты». 2008. Душанбе.

• Международный тренинг «Использование ботанических семян для обеспечения населения продовольствием». Март, 2009. Душанбе. Институт физиологии растений и генетики АН РТ;

• Международный семинар «Обеспечение улучшения продовольствия и увеличение доходов в Юго-Западной и Центральной Азии (8¥-СА) через сорта картофеля с улучшенной устойчивостью к абиотическому стрессу», 29−30 ноября 2010 г. Индия (Гуджарат);

• VI Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития" — 21−25 марта 20И г. Москва (Россия).

• На совместном семинаре лабораторий молекулярной биологии и биотехнологии, биохимии, генетики фотосинтеза и генетики растений Института ботаники, физиологии и генетики растений Академии наук Республики Таджикистан.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем работы.

Диссертационная работа изложена на 94 страницах машинописного текста и состоит из: введения- 4-х главвыводовсписка литературы, приложения. Работа содержит 8 рисунков, 1 1 таблиц. Список цитируемой литературы включает 129 наименований, из которых 90 на иностранных языках.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Подобранные условия культивирования столонов картофеля (Solanum tuberosum L.) in vitro, позволяют интенсифицировать образование микроклубней, пригодных к использованию в качестве базисного семенного материала. Показано влияние азота на размер микроклубней. Оптимальной концентрацией азота, влияющей на формирование размера микроклубней, оказалась концентрация 120 мМ в культуральной среде in vitro, при которой размер одного микроклубня достигал 1.14 см (приложения, рис. 1).

Обнаружена стимулирующая роль комбинированного использования кинетина и регулятора роста растений пакробутразола (ПБ) на сырой вес и размер микроклубней in vitro. Оптимальной оказалась концентрация кинетина 0.5 мг/л и ПБ 50 мкг/л. ПБ без кинетина также оказывал влияние на размер и сырой вес микроклубней. Наибольший эффект оказала концентрация ИВ, равная 75 мкг/л.

Действие экстремальных стрессовых факторов на растение заключается в развитии стресс-реакций. Один из механизмов стресса связан с нарушением динамического равновесия в системе прооксидантов и антиоксидантов, запускающих активацию процессов перекисного окисления липидов, и их активность может служить одним из косвенных показателей уровня устойчивости растения к стрессовым воздействиям. Пластиды как составная часть единой окислительной системы клетки во многом могут определять активность окислительных ферментов.

Для оценки воздействия соли (NaCl) на систему окислительных процессов и содержания фотосинтетических пигментов, как показателей физиологической активности растительной клетки, было проведено сравнительное изучение антиоксидантных систем у разных по устойчивости генотипов картофеля к засолению, с добавлением в среду культивирования разных форм азота (NH, M NOи N-дефицитный).

Было определено, что по уровню накопления МДА и содержанию фотосинтетических пигментов у разных по устойчивости к засолению генотипов, растения-регенеранты, выращенные в условиях in vitro на среде с NH*, оказались более устойчивыми, чем растения, выращенные на среде с NO~. Определено, что фотосинтетические пигменты по разному реагируют на засоление. Хлорофилл, а оказался более устойчивым к действию соли как у устойчивых, так и у неустойчивых к засолению генотипов. При этом содержание хлорофилла b снижалось в большей степени, чем содержание хлорофилла, а особенно при NO3-типе питания. В результате солевого стресса содержание каротиноидов также имело тенденцию к снижению во всех вариантах опыта.

Устойчивость растений-регенерантов в NH" -варианте кореллировала с увеличением активности СОД. А у растений-регенерантов, выращенных in vitro на среде с нитратами (NO3-вариант) наоборот — увеличивалось содержание МДА, т. е. признаки окислительного стресса были более выражены. Увеличение содержания МДА при солевом стрессе не коррелировало с возрастанием активности СОД у чувствительных генотипов, что является важным признаком резистентности к экстремальным воздействиям.

Были проведены опыты по изучению действия регулятора роста ГГБ при засолении на параметры роста картофеля сорта Пикассо и сорта Файзабад. Результаты опыта показали, что при различных концентрациях соли ростовые процессы данных гибридов ингибировались по-разному. Наиболее чувствительным к действию соли оказался сорт Пикассо. У данного сорта ингибирование роста побегов наблюдалось уже при концентрации 0.5% NaCl, а при увеличении концентрации до 1.0% полностью прекратился и составил примерно 9−10%). У сорта Файзабад в отличие от сорта Пикассо ингибирование побегов наблюдалось при всех использованных в эксперименте концентрациях NaCl. Высокую степень ингибирования роста побега можно было наблюдать при 1% концентрации NaCl. При 1% концентрации NaCl снижение роста составляло примерно 50% от контроля. И практический прекратился рост при концентрации 1.5% NaCl.

Однако при добавлении в культуральную среду ПБ на фоне NaCl картина несколько менялась. ПБ на фоне NaCl также приводил к снижению роста побегов у обоих сортов картофеля, но при этом заметно увеличилась сырая масса побегов и длина корней. Оптимальной концентраций ПБ для корнеобразования и увеличения массы побегов роста оказалась концентрация 50 мкг/л. Более чувствительной к действию ПБ оказалась длина междоузлий. У обоих сортов длина междоузлий уменьшалась с повышением концентрации ПБ в культуральной среде in vitro. Различие было лишь в том, что у сорта Пикассо образование междоузлий прекратилось при концентрации 0.5% NaCl, а у сор та Файзабад при 1.0% NaCl.

ПБ также оказал влияние на увеличение сырой массы микроклубней in vitro. Средняя масса 1 клубня увеличилась примерно в 2,5 раза от контроля.

Такое изменение ростовых параметров возможно связано с изменением ауксин-цитокининового баланса под действием ПБ. По данным (Murashige, Skoog, 1962), снижение ростовых процессов растений происходит в результате триазол-индуцированного ингибирования биосинтеза гиббереллина, что приводит к подавлению высоты растений посредством торможения растяжения междоузлий, что и наблюдалось в ходе проведенных нами опытов, т. е. ПБ приводил к укорачиванию междоузлий растений картофеля. Очевидно, и на уровне пробирочных растений в условиях in vitro ПБ регулирует биосинтез ростовых веществ и гормонов.

Механизмы повышения солеустойчивости, вызванное ПБ, могут быть подобны механизмам физиологических систем солеустойчивости растений. ПБ способен повысить солеустойчивость даже у солевосприимчивых генотипов картофеля, но в меньшей степени. Торможение ростовых процессов при солевом стрессе имеет генотипическую специфику, что дает возможность на уровне пробирочных растений, в условиях in vitro, более точно оценивать устойчивость генотипов к солевому стрессу и другим экстремальным факторам.

Показана роль воздействия Сахаров при засолении на активность антиокидантных ферментов у клон-гибрида № 25 (солечувствительный) и сорта Файзабад (солеустойчивый). При краткосрочном засолении (60, 120 и 180 мин воздействия NaCl) наблюдалась заметное снижение содержания Сахаров у обоих генотипов, особенно у сорта Файзабад после 180 минутного воздействия NaCl.

При выращивании растений с различными концентрациями сахарозы заметно изменялся уровень активности антиоксидантных ферментов — каталазы и СОД. При чем, по мере увеличения концентрации сахарозы у сорта Файзабад увеличивалась активность каталазы, а у сорта Пикассо — активность СОД.

Однако при добавлении в культуральную среду NaCl в концентрациях от 0.5% до 1.5% наблюдались другие результаты. Активность каталазы была высокой у сорта Пикассо при контрольной среде (без NaCl) и 0.5% NaCl, чем у сорта Файзабад, но, по мере увеличения концентрации соли она понижалась у сорта Пикассо и увеличивалась у сорта Файзабад.

Активность СОД была одинакова у обоих генотипов в нормальных условиях выращивания (без NaCl) и при минимальной концентрации NaCl в среде выращивания. Но при мере увеличении концентрации NaCl в среде выращивания, активности СОД резкое снизалась у сорта Пикассо, а у сорта Файзабад наоборот увеличилась в два раза. Спустя сутки после возвращения растений в нормальные условия, у сорта Пикассо активность ферментов почти восстановилась до уровня контроля (без NaCl), а у сорта Файзабад осталась повышенной.

Таким образом, мы считаем, что низкий уровень содержания сахара у восприимчивых к солевому стрессу растений, связан, очевидно, с ингибированием и/или низкой активностью ферментов углеводного метаболизма, а устойчивость растений к стрессорным воздействиям засолению), связана с эффективной работой актиоксидантной системы защиты растений.

Микроклубнеобразование у восприимчивых к солевому стрессу генотипов более зависимо от концентрации гормонов, особенно у растений, прошедших длительное культивирование in vitro. Это очень важный факт, указывающий на возможность существования особого механизма адаптации растений к изменяющимся условиям среды и на различный уровень эпигенетической регуляции активности генов, ответственных за продукционный процесс. Косвенным подтверждением этому, могут быть результаты действия гормонов у различных по устойчивости генотипов картофеля к засолению.

Полученные нами результаты показывают, что у восприимчивых генотипов содержание гормона заметно ниже у длительно культивируемых растений по сравнению с вновь введенными в культуру. У устойчивых к засолению генотипов такого явного изменение содержания гормонов при длительном культивировании, не наблюдалось, что свидетельствует о способности устойчивых генотипов продуцировать гормоны независимо от условий среды выращивания, для поддержания физиологического статуса растений, без существенного снижения продуктивности.

Обнаружен тот факт, что длительное культивирование in vitro растений приводило к снижению продуктивности как при культивировании растений в пробирке, так и в почве, в отличие от вновь оздоровленных растений-регенерантов. Поскольку этот параметр не зависел от условий выращивания, вероятно, он генетически детерминирован, что может свидетельствовать о понижении способности продуцировать цитокинины в процессе длительного культивирования. Особенно это заметно у чувствительных к солевому стрессу генотипов картофеля.

Полученные результаты показывают, что у чувствительных к засолению генотипов при длительном культивировании заметно ухудшалось корнеобразование, и пересадка растений в почву приводило к возрастанию потери массы клубней, что связано с гормональным балансом. Ауксины также играют важную роль в процессе микроклубнеобразования in vitro. Согласно данным (Evans, 1985), ростои корнестимулирующее действие ауксинов играет существенную роль в адаптации растений в почве. Именно в этих условиях, видимо, проявляется отрицательное действие длительного культивирования на способность растений обеспечить себя ауксинами, что незамедлительно оказывает влияние на ростовые процессы и продуктивность в условиях почвы.

Понижение уровня ауксинов у длительно культивируемых in vitro растений может быть связано с невысоким уровнем цитокининов, поскольку имеются данные о том, что цитокинины влияют на продукцию ауксинов (Evans, 1985). По этим причинам, возможно, при пересадке в почву длительно культивируемых растений имеет место снижение выживаемости по сравнению с вновь введенными в культуру растениями. В этих условиях цитокинины, возможно, играют более значимую функциональную роль, в регуляции координации генетических, эпигенетических и физиологических функций у растений в соответствии с условиями обитания. Не исключено, что способность длительно культивируемых растений продуцировать цитокинин может быть одной из причин, обуславливающих их неспособность адаптироваться в условиях почвы.

Таким образом, анализ полученных результатов показали, что при длительном культивировании растений in vitro происходит снижение эпигенетической активности, регулирующей рост, развитие и стрессоляторные системы растений, незамедлительно оказывающего отрицательное влияние на выживаемость и продуктивность растений, что не наблюдается у вновь введенных в культуру меристемных и столоновых растений-регенерантов in vitro.