Синтез и некоторые фармакологические свойства низкомолекулярных цинксодержащих иммуноактивных пептидов

Актуальность проблемы. В последние годы все большее количество исследований в области биологической химии и фармакологии посвящается поиску веществ, способных влиять на состояние иммунитета — регуляторов и корректоров иммунной системы организма. Это связано с тем" что большинство заболеваний человека и животных сопровождается нарушениями нормального функционирования иммунной системы организма. Среди веществ, способных влиять на состояние иммунной системы организма, имеются соединения пептидной, гетероциклической, полисахаридной природы, создании иммуномодулирующих препаратов ведущее место среди соединений пептидной природы принадлежит тимусным гормонам, непосредственно участвующим в процессах регуляции и становления иммунного ответа. К успехам биологической химии в этой области можно отнести выделение и охарактеризование такиЗс тимусных гормонов, как тимозины, тимопоэтины, сывороточный тимусный фактор. При изучении их биологических свойств было показано, что при введении в организм они оказывают иммуномодули-рутощее действие. Однако их широкое применение в лечебной практике ограничено небольшим содержанием в животных организмах, сложностью выделения и химического синтеза. Поэтому наиболее перспективным является применение для этой цели низкомолекулярных пептидов, обладающих активностью тимусных гормонов.

Также большое значение для живого организма имеет такой металл, как цинк. При недостатке цинка в организме нарушается мен белков, и нуклеиновых кислот, изменяется обмен метионина, цистеина, пролина, глицина, усиливается выделение почками таурина, цистеамина и еорганического сульфита, снижается активность таких ферментов как тимидин — киназа, РНКи Д Н Кполимеразы, 5 нарушается синтез ДНК и белка в клетках печени, почек, соединительной ткани. При недостатке цинка в организме у людей отмечается карликовость, гепатомегалйя, сплиномегалия, половое недоразвитие, гипогонадизм, изъязвление кожи и выпадение волос, энтеропатический акродерматит и другие заболевания.

В связи с вышеизложенным поиск путей получения и изучение биологических свойств координационных соединений цинка с низкомолекулярными иммуноактивными пептидами позволит значительно расширить спектр применения последних. Поэтому поиск эффективных методов синтеза низкомолекулярных пептидов обладающих активностью тимусных гормонов и координатционых соединений их с цинком, а также изучение их биологических свойств с целью дальнейшего применения в качестве лекарственных препаратов является весьма актуальным.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы являлся поиск низкомолекулярных пептидов, обладающих активностью тимусных гормонов, получение координатцюнных соединений их с трюком, изучение биологических свойств полученных пептидов и координационных соединений для дальнейшего применения в ветеринарии.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

— разработать оптимальные методы получения низкомолекулярных пептидов, обладающих активностью тимусных гормонов и их координатцюнных соединений с ионом ;

• У.

— изучить физико-химические и биологические свойства полученных соединений- 6.

— разработать способ применения иммуноактивных цинксодержащих пептидов при профилактике и лечении тейлериоза крупного рогатого скота.

Научная новизна. Получен ряд новых триптофансодержащих дипептидов и аналогов фрагментов 32−34 и 32−35 тимопоэтина. Впервые получены координационные соединения триптофансодержащих дипептидов о ионом 2п2+. Показано, что.

• / координация с ионом Хп2+ приводит к усилению иммуностимулирующей активности исходных дипептидов. Показано, что применение триптофансодержащих дипептидов, координационых соединений их с ионом + и аналогов фрагментов 32−34 и 32−35 тимопоэтина обладающих биологической активностью с живой противотейлериозной вакциной способствует усилению антителообразования у иммунизированных животных.

Практическая значимость. Предложен способ получения координационных соединений иммуноактивных пептидов с ионом Ъ^. Разработан способ повышения эфективности лечения и профилактики инфекционных и паразитарных заболеваний крупного рогатого скота. Предложен оптимальный способ применения иммуностимулирущего препарата тимоцин при вакциопрофилактике и лечении тейлериоза крупного рогатого скота.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.1. Выделение и биологические функции тимусных гормонов и поиск низкомолекулярных иммуноактивных пептидов.

Центральная роль тимуса в становлении и регуляции иммунного ответа была установлена только в середине 60-х годов (Петров, 1987). При этом оказалось, что главную роль здесь играют тимусные гормоны, имеющие пептидную природу. В настоящее время существует две теории о пройсхождении тимусных гормонов. По.

7, предположению А. Гольдштейна в тимусе синтезируется несколько факторов участвую-щих в регулировании процессов созревания и дифференцировки Т-кле-ток (Goldstein, 1977). Согласно другой теории (Comsa, 1965), в тимусе синтезируется только один фактор, выполняющий все иммунологичес-кие функции тимуса (Морозов, Хавинсон, 1981).

Первым биологически активным препаратом, выделенным из тиму-са, была так называемая тимозин фракция 5 (тимозин Ф5), являющаяся смесью полипептидов с молекулярным весом’от 1000 до 15 000 дальтон (Rajnavolgul, 1986) содержащая более 30 компонентов (Wang et al, 1981) и активная во многих иммунологических тестах (Low et al., 1979).

Тимозин Ф5 частично или полностью восстанавливает иммунную деятельность у животных и людей с онкологическими заболеваниями и имуннодефицитами (Bach et al., 1977;Low al., 1979;Rajnavolgul etal., 1986).

Другая фракция — активный фактор тимуса 6 (АТФ-6 или Т/ активин) содержит пептиды с молекулярной массой от 1500 до 6000 дальтон (Арион, 1981,1981), обладает высокой биологической активностью и дает хороший клинический эффект при ряде заболеваний (Арион, 1981;Арион и др., 1985;Иванушкин и др., 1981; Лопухин, 1982; Лопухин и др., 1981; Петров, 1987).

Тимозин ai был первым гормоном, выделенным из бычьей, свинной и человеческой тимозин Ф5 (Chen et al., 1993; Moclure et al., 1982; Low et al., 1983;Vang, 1981). Оказалось, что этот гормон состоит из 28 аминокислот, имеет блокированную ацетильную N-концевую аминогруппу (рис.1) и молекулярный вес 3108 дальтон (Low et al., 1989). Тимозина ai в 10−1000 раз более активен, чем тимозин Ф5 и пре-мущественно действует на протимоциты с образованием Т8 хелперных клеток (Ahmed et al., 1979; Low et el., 1979). Было показано, что тимозина! дейстивителъно синтезируется в тимусе (Friere et al., 1978).

После определения его аминокислотной последовательности тимозин ai сразу был синтезирован в нескольких лабораториях как классическими методами пептидной химии в растворе (Abiko et al., 1980; Birr et al., 1979,1979; Felix et al., 1985; Hooper et al., 1975; Wang et al., 1978), так и методами твердофазного синтеза пептидов (Hofman, 1962; Wang et al., 1978,1980). Были разработаны схемы крупномасштабного (до кг) синтеза этого пептида (Felix/et al., 1985; Нао et al., 1986; Hooper et al., 1975) классическими методами пептидной химии в растворе. Сообщалось о синтезе тимозина ai методами генной инженерии (Swiderski et al., 1982; Vetzel et al., 1980). При изучении биологической активности синтетического тимозина было показано, что его активность подобна природному тимозина ai и, что ацетильная группа на N-конце пептида не оказывает влияния на его биологическую активность. Сообщалось (Vang, Dloomfield, 1987), wo (Asn) аналог тимозина ai также проявляет биологическую.

• / активность при дифференциации Т — клеток.

Из тимозин фракции 5 были выделены тимозины as и а?, имеющие изоэлектрические точки равные 3,5 и молекулярные веса 3000 и 2000 дальтон, соответственно (Морозов.Хавинсон, 1981). Эти гормоны являются возможными индукторамисупрессорных клеток у мышей и активаторами при индуцировании Т-клеточных маркеров (Low et al., 1979).Было показано, что тимозин ai супрессирует продукцию у-интерферона in vivo у мышей (Low et al., 1979) и влияет на протимоциты, которые затем превращаются в лимфоциты с супрессорной функцией (Low et al., 1979). 9.

Сообщалось выделении двух полипептидов, имеющих высокую степень гомологии с тимозином ai названых тимозинами an (Felix et al., 1983) и a22(Haritos et al., 1984). Из тимозин фракций 5 и 5А были выделены тимозины (З3 и р4 (Low.Goldstein. 1982). Тимозин р4 состоит из 43 аминокислотных остатков (рис.1), эти гормоны подобно тимозин Ф5 влияют на стволовые клетки, превращая их в протимоциты (Ни et. al., 1987), а (34 тимозин также ингибирует миграцию макрофагов (Golgschneider et al., 1981). Тимозин р4 также был обнаружен в селезенке, головном мозге, легких, печени и сердечной мышце у крыс и мышей (Hannapel., 1982). В 1983 г. тимозин р4 был синтезирован твердофазным методом (Low et al.

1983), идентичность которого натуральному была доказана аминокислотным анализом и триптическим пептидным картированием. Синтетический пептид обладал биологической активностью подобной природному. Абико и Секино (Ablko, Sekino., 1983) сообщали о синтезе дезацетилтимозина (34 и показали, что синтетический пептид увеличивал количество хелперных Т — клеток при инкубации с кровью, взятой у больных с хронической почечной недостаточностью. О твердофазном синтезе этого гормона сообщали также Уанг и др. (Wang et al., 1981).

Высокогомологичными тимозину р4 по аминокислотной последовательности являются тимозины pg и Р9, выделенные из тимозин фракции 5 (Wang et al., 1980). Из 38 аминокислотных остатков ти-мозина р8 31 идентичен соответствующим остаткам тимозина (34. Тимозин р9 идентичен тимозину р8, но у него на С-конце имеется добавочный дипептид Ala-Lys (рис.1). Высокогомологичными тимозину р8 являются тимозины Рю, Pio-arg и Pu (Erickson-Viitanen et al., 1983; Horecker, 1984; Ruggleri et. al., 1983) (рис.1). Синтетический.

10 тимозин р9 увеличивал число периферических Е-розет-кообраэующих клеток, синтетический дезацетилтимозин (Зю увеличивал число периферических Т-клеток и хеллерных Тклеток у больных с уремией и туберкулезом, но не действовал на супрессорные Тклетки. Абико и у.

Секино (Ablko, Sekino, 1983) сообщали о синтезе бычьего тимозина. (38.

Другой гормон, названный сывороточным тимусным фактором, был выделен из свиной (Bach et al., 1975; Imalzumi et al., 1977) и человеческой (Морозов, Хавинсон, 1981) сыворотки крови. С помощью моноклональных антител было доказано присутствие этого гормона в тимусе (Auger et al., 1982; Jambon et al., 1981). Этот гормон представляет собой нонапептид с последовательностью H-Glu-ALa-Lys-Ser-Gln-GlyGly-Ser-Asn-OH, причем аминокислотные последовательности гормонов, выделенных от свинец, телят и человека, идентичны (Ьасоуага, Utermohlen, 1993). Было показано,(Dardenne et al., 1982; Gastinel et al., 1984), что в состав биологически активной формы этого гормона входит цинк. Сывороточный тимусный фактор (тимулин) усиливает генерацию эффекторных Т-клеток и ингибирует контактную чувствительность у мышей (Strachan et al., 1979).

Данный гормон был получен с использованием методов синтеза в растворе (Bach et al, 1978) и твердофазным методом (Strachan et al., 1979). Было показано, что синтетический сывороточный тимусный фактор (FTS) был способен восстанавливать некоторые Т-клеточные.

• / недостатки у тимектомированных мышей (Strachan et al., 1979).

Тимопоэтины I и II были выделены и охарактеризованы Г. Гольдттейном и др. (Goldstein, 1975Schlesinger, Goldstein, 1975). Они состоят 49 аминокислотных остатков (рис. 2) и отличаются только по двум остаткам — в положениях 1 и 43 (Jambon et al., 1981; Savino et al., 1982; Schlesinger. GolgsteIn, 1975).Пepвoнaчaльнo они были идентифицированы в экстрактах тимуса по подавлению нервно-мышечной проводимости у крыс (Goldstein, 1974). Затем было показано, что они индуцируют in vitpo экспрессию некоторых антигенов Т.

• / лимфоцитов на поверхности стволовых клеток и усиливают реакции лимфоцитов на митогены (Goldstein, 1975; Savino et al., 1982). Из бычьей селезенки был выделен еще один гормон, названный тимопоэтином III или спленином (Abiko, Sekino, 1981,1982; Abiko et al., 1979,1980). При изучении его биологической активности оказалось, что он влияет на дифференцировку В-лимфоцитов, а не Т-лимфоцитов (Savino et al., 1982). Он также, как и тимопоятим II состоит из 49 аминокислот, но отличается от него по двум остаткам в положениях 34 (рис. 2)(Audhua et al., 1981). Однако^тих малых изменений оказалось достаточно, чтобы изменить специфичность гормона.

О синтезе полных молекул тимопоэтинов сообщали Фуджино и flp.(Fujino et al, 1977), Близнаков др. Bliznakov et. а1., 1978), Абико и flp.(Abiko.Sekino, 1985,1988;Abiko et al., 1986). Эти же авторы (Abiko.Sekino, 1987) сообщали о синтезе Pro l. Gly 2, Ser 43, Leu 47-аналога тимопоэтина II.

Рис. 2. Аминокислотные последовательности тимозинов.

Из тимуса также был выделен полипептид тимарин (Морозов и др. 1977), состоящий из 38 аминокислот и присутствующй в тинозин фракции 5 (Морозов, Хавинсон, 1978). Этот пептид влияет на экспрессию рецепторов Т-лимфоцитов, усиливает реакцию трансплантант против хозяина, продукцию антител, противоопухолевую резистентность, стимулирует репаративные процессы (Морозов, Хавинсон, 1978,1981 -Морозов и др., 1978).

В последние годы установлено, что под влиянием тимусных гормонов находятся половое созревание.

Bezedowskl, SorkIn, 1974).CHHTe3 ДНК в соматических клетках (Piantanelli, Fabris, 1975), функции гипофиза, надпочечников и. возможно, щитовидной железы (Pierpaoli, Bezedowskl, 1975).

Из тимуса также был выделен лимфостимулирущий гормон (LSH), усиливастпий лимфоцитоз (Безвершенко и др., 1974). Тимусом также вырабатывается гомеостатический тимусный гормон (НТН), являющийся гликопептидом и обладающий лимфоцитопоэтическим действием (Милку, Потоп. 1977).

В 1962 г Гофманом (Hofmann, 1962) была высказана идея о том, что в каждой белковой молекуле имеется активный центр небольшой участок молекулы, обладающий биологической активностью целой молекулы. Поэтому проводились интенсивные исследования по определению местоположения активных центров молекул тимусных гормонов.

При разработке схем синтеза тимозина и изучении отдельных пептидных фрагментов его молекулы (Felix et al., 1984,1985; Нао et al., 1987; Krueck, 1984), a так же на основе расчета вторичной структуры его молекулы (Birr et al., 1979) было показано, что участок 20−24 с последовательностью H-Lys-GLu-Val-Val-Gln-OH является активным центром молекулы тимозина oil. Этот синтезированный.

15 фрагмент оказывал дифференцирующее влияние на Т-клетки предшественники костного мозга и крови человека (Мартынов и др., 1986).

Для определения активного центра сывороточного тимусного фактора было синтезировано большое количество его аналогов и фрагментов. В 1978 г. Бач и др.(ВасЬ е1 а1., 1978) предположили, что гептапептид 3−9 с последовательностью Н-Ьуз-8ег-01п-01у-С1у-8ег-Азп-ОН является ответственным за биологическую активность сывороточного тимусного фактора .

С целью определения наименьшего фрагмента, обладающего биологической активностью, был предпринят синтез сывороточного тимусного фактора и различным его фрагментов (Мартынов и др., 1986; АЫко, 8ек1по, 1982; вюЬку е1 а1., 1983; Ьпшгшт & а1., 1981).

Эти пептиды проверялись на их способность обращать азати-опринчувствительные клетки в ТЪу-1 положительные Е-розеткообразущие клетки. В этих экспериментах было показано, что наиболее коротким фрагментом сывороточного тимусного фактора является пентапептид с последовательностью Н-Ьу8−8ег-01п-01у-01у-ОН (фрагмент 3−7). При исследовании биологической активности пептидов Н-Ьуз-8ег-01п-0Н, Н-Ьуз-8ег-01п-01у-01у-8ег-0Н, Н-Ьуэ-8ег-01п-01у-01у-0Н и Н-Ьу3−8ег-С1п-01у-С1у-0Н в Е-розеткоанализе было определено, что тетрапептид с последовательностю Н-Ьуз-8ег-01п-01у-01у-0Н, представляющий собой фрагмент 3−6, является ' минимальной достаточной стуктурой для экспрессии восстановления активности Е-розеткообразующих клеток в случае хронической почечной недостаточности.

В исследованиях, проведенных с синтетическим сывороточным тимусным фактором, было показано, что он участвует в моделиро.

16 вании киллерной активности (Bardos et al., 1979). Механизм влияния тимулина на натуральную киллерную активность до настоящего времени еще не изучен, но эти результаты предполагают, натуральные киллерные клетки происходят из Т-клеток.

Блазек и Ленфант (Blassek.Lenfant, 1983) описали стимуляторное действие сывороточного тимусного фактора на спонтанный ДНК синтез мышиных тимоцитов и клеток бычьего костного мозга. Эти данные вместе с обнаруженным ранее фактом, что активный комплекс тимулина с цинком селективно транспортирует цинк в тимоциты (Bach, 1981), открывают новые возможности для объяснения молекулярного механизма действия сывороточного тимусного фактора. По мнению авторов, роль таких металлопептидных комплексов может заключаться в том, что они катализируют ферментативные реакции, приводящие к авто или гетеросинтетической активности и поддержке такого синтеза.

В целой серии экспериментов (Abiko, Sekino, 1981;Abiko et al., 1979,1981; Goldstein al., 1979; Rowinski et al., 1972) было показано, что активным центром тимопоэтина является фрагмент 3236 с последовательностью H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH, названный тимопентином. N-концевые три-и тетрапептиды тимопентина (TP 3 и TP 4) также обладают биологической активностью, свойственной тимопоэтину (Rajnavolgui et al., 1986).

Самыми короткими пептидами, обладающими биологической активностью тимусных гормонов, являются дипептиды, выделенные из тимолиновой фракции экстрактов тимуса, аналогичные дипептиду Н.

• /.

GIu-Trp-OH и обладающие активностью тимозина а^Дейгин и др., 1987).

Полученные к настоящему времени результаты позволяют надеяться на то, что синтетические пептиды, имитирующие природные.

17 тимусные гормоны или их активные центры, будут применяться в медицинской практике в качестве иммунодулирующих препаратов при лечении заболеваний сопровождающихся нарушениями функционирования иммунной системы организма.

ВЫВОДЫ.

1. Изучены различные методы получения низкомолекулярных иммуноактивных пептидов, применение которых совместно с традиционными лекарственными препаратами способствует повышению эффективности вакцинопрофилактики и лечения сельскохозяйственных животных.

2. Биологическая активность, проявлемая пептидами in vitro в тесте Е-розеткообразования клетки соответствует таковой, проявляемой in vivo при совместном применении с живой противотейлериозной вакциной.

3. При взаимодействии триптофансодержаших дипептидов с ионом Zn2+ происходит образование координационных соединений, в результате чего увеличивается биологическая активность исходного дипептида.

4. Разработанный на основе координационных соединений триптофансодержащих дипептидов с ионом Zn2+ иммуностимулирующий препарат тимоцин сохраняет свои физико-химические и биологические свойства в течение 2 лет.

5. Применение тимоцина совместно с ассоциированной вакциной против рота-, коронавирусных антеритов и колибактериоза и живой культуральной противотейлериозной вакциной способствует значительному усилению первичного иммуного ответа у вакцинированных животных.

6. Применение тимоцина совместно с химиотерапевтическими препаратами значительно сокращает срок и повышает эффективность лечения пневмоэнтеритов молодняка крупного рогатого скота.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют об огромном внимании исследователей, проявляемой к низкомолекулярным пептидам, обладающим активностью тимусных гормонов, в частности, аналогам дипептида глутамил-триптофан, обладающего активностью тимозина а^.

С целью поиска аналогов дипептида глутамил-триптофан, обладающих более высокой биологической активностью, были синтезированы новые триптофансодержащие дипептиды аргинил-трипто-фан, аспарагинил-триптофан, метионил-триптофан, триптофил-триптофан.

Для получения дипептидов был использован способ, который заключается в конденсации активированных пентафторфениловых эфиров Nзащищенных ТЧ-концевых аминокислот с метиловым эфиром триптофана.

Промежуточные активированные эфиры были получены карбо-диимидным методом с использованием в качестве конденсирующего реагента дициклогексилкарбодиимида и в реакцию конденсации с аминокомпонентом вводились без выделения из реакционной смеси / сразу после отфильтровывания выпавшей дициклогексилмочевины.

Использованная тактика максимальной защиты позволила очищать полученные защищенные пептиды обычным способом путем обработ-ки реакционной смеси кислыми и основными реагентами и сразу после этого проводить реакцию деблокирования защищенных пептидов.

Вследствие наличия у остатка триптофана легко окисляемой индольной группы при разработке схемы синтеза триптофан-содержащих пептидов необходимо подбирать защитные группы.

85 таким образом, чтобы условия их удаления обеспечивали неизменность индолъной группы остатка триптофана. Из литературных данных (Герткович, Кибирев, 1987;

Гринтгейн, Виниц, 19б7). известно, что индольная группа легко окисляется в кислых условиях и не затрагивается в условиях каталитического гидрирования. Поэтому для защиты а-аминои гуанидиновой группы аргинина была использована карбобензоксигруппа, которую в конце синтеза удаляли каталическим гидрированием в присутствии 10%-ного Рё/С катализатора, а а-карбоксильную группу триптофана защищали сложноэфирной метальной группой, которую в конце синтеза снимали щелочным гидролизом в мягких условиях обработкой 10%-ным раствором карбоната натрия в течение 1 часа при комнатной температуре. После деблокирования свободные дипептиды были очищены переосажденнем из метанола эфиром или ацетоном. Окончательный выход свободных дипептидов достигал 70−85%.

В данном случае замена 1-гидроксибензотриазода, использованного в работах (Бобиев, 199бДейгин и др., 1987), на пентафторфенол, не привела к увеличению выхода свободных пептидов, что связано с тем, что ТчГ-концевыми аминокислотами в нашем случае являлись аргинин, метионин, триптофан и аспарагин и реакция конденсации с их участием не всегда проходит с достаточно высоким выходом.

С целью изучения возможности использования при синтезе подобных дипептидов остатка триптофана со свободными индольной и а-карбоксильной группами, был предпринят новый синтез известных депептидов Н-С1и-Тгр-ОН, Н-11е-Тгр-ОН, Н-Азр-Тгр-ОН, Н-Уа1-Тгр-ОН. Обладающих биологическими свойствами тимозина, а и имеющих известные физико-химические константы.

Для защиты функциональных групп концевых аминокислот были использованы группы, удаляемые каталическим гидрированием — карбобензоксигруппа (для защиты а-аминогрупп) и бензильная группа (для защиты ш-карбоксильных групп глутаминовой и аспарагиновой кислот), поскольку при их удалении не затрагивается индольная группа С-концевого остатка триптофана (Бобиеви ДР., 1998).

Применение для синтеза пентафторфениловых эфиров дипентафторфенилкарбоната и остатка триптофана в виде натриевой соли позволило получать конечные свободные дипептиды без выделения из реакционной смеси и дополнительной очистки промежуточных активированных эфиров. Выход свободных дипептидов достигал 80−90%. Путем сравнения физико-химических характеристик получаемых пептидов с известными была определена возможность синтеза пептидов разработанным способом.

Таким образом, применение для синтеза пентафторфениловых эфиров, получаемых с помощью дипентафторфенилкарбоната, позволяет получать конечные свободные дипептиды без выделения из реакционной смеси и дополнительной очистки промежуточных активированных эфиров, использовать остаток триптофана со свободными индольной и, а карбоксильной группами, а также исключить использование высокоэффективной жидкостной хроматографии для очистки свободных пептидов как метода, требущего специального оборудования. Все это вместе взятое позволяет значительно упростить процесс синтеза подобных пептидов по сравнению с (Бо-биев, 1996;Дейгин и др., 1987).

С помощью подобного подхода были синтезированы фрагменты 32−34 и 32−35 молекулы тимопоатина и их аналоги (Бобиев и др., 1998). Однако в этом случае была использована тактика мак.

87 симальной защиты. Применение для зашитыаминои боковых функциональных групп карбобензоксии бензильной групп позволило окончательное деблокирование конечных трии тетрапепти-дов осуществлять в одну стадию путем каталитического гидрирования в присутствии 10%-ного палладия на активированном угле. Активированные (пентафторфениловые) афиры^{защищенных} аминокислот были получены по стандартной' методике взаимодействием дипентафторфенилкарбоната с триатиламмониевой солью И-защищен-ной аминокислоты в этилацетате и в реакцию конденсатцта с ами-нокомпонентом вводились без выделения из реакционной смеси сразу после упаривания этилацетата.

Защищенные ди-, трии тетрапептиды были отчищены путем обыч-ной обработки реакттаонной смеси кислыми и основными реагентами.

При синтезе пептидов, содержащих С-концевые остатки аспарагина и глутамина (Н-А^-ЬуБ-Азп-ОН и Н-А^-ЬуБ-СЫ-ОН) последние вводились в реакттаю конденсации с Вос-ЬуБ в виде натриевой соли. В этом случае защищенные конечные пептиды были очщены промыванием этилацетатом водных растворов солей пептидов с последующей экстракцией этилацетатом из подкисленных водных растворов.

Использование тактики максимальной защиты, подобного выбора защитных групп, ступенчатого наращивания пептидной цепи начиная с С-конца позволили проводить синтез пептидов без выделения из.

• / реактционной смеси и дополнительной очистки промежуточных активированных эфиров и защищенных пептидов.

В данном случае выход конечных свободных пептидов был выше, чем при использовании п-нигрофениловых (АЬ1ко, 8ек1по, 1981;АЫко еХ а!., 1979) и Ы-оксисукцинимидных (Бобиев.1996: Дейгин и др., 1987).

88 активированных эфиров. а также был упрощен процесс очистки свободных пептидов, который осуществляли без использования ВЭЖХ, как в случае Бобиев 1996: Дейгин и др., 1997 и фракционирования на сефадексе. как в работах (АЫко, 8ек1по, 1981; АЫко ег а1,1979).

С целью расширения спектра действия и увеличения биологической активности низкомолекулярных иммуноактивных пептидов были получены координатщонные соединения их с ионом.

Бобиев и др., 1999), синтез которых вели при рН 6,0, 110−120°С, без доступа воздуха и света. Сравнение УФ-спектров дипептида -11е-Тгр-ОН, его координатщонного соединения с ионами Бе (Бобиев, 1999; Бобиев и др. Д997,1998) и Ъи позволило предположить, что при растворении в воде дипептид принимает такую конформацию, при которой ароматическую компоненту триптофана почти не видно. При координации с ионом металла эта конформация нарушается. что приводит к появлению на УФ-спектре координационного соединения максимума поглощения в области 250−290 нм. Отчасти в пользу этого предположения говорят данные А. А. Шевченко и др. (1994), которыми было показано, что при изменении структуры белка происходит изменение интенсивности пиков поглощения, соответствующих ароматическим аминокислотам, во вторых производных УФ-спектров.

Использование метода вторых производных Уф-спектров для исследования низкомолекулярных пептидов в литературе почти не описано. Только в монографии А. П. Демченко (1981) приведены примеры вторых производных спектров трипептидов Н-61у-Тгр-01у-ОН Н-(31у-Р11е-01у-0Н.

Для получения более подробной спектральной информации нами были рассчитаны вторые производные УФ-спектров дипептида Н-Пе.

2+.

Тгр-ОН и его коордикадакнмх соединений с ионом Zn при д D равном 1 нм. Применение вторых производных УФ-спектров в нашем случае позволило выделить ароматическую компоненту триптофанапик при 291 нм, что соответствует литературным данным (Демченко, 1981; Демченко и др.: 1978; Шевченко и др., 1994). Изменения во второй производной УФ-спектра координационного соединения по сравнению с дипептидом (увеличение интенсивностио пиков при 260 и 291 нм, сдвиг в длиннволновую область пиковпри 250, 256 нм и появление новых пиков при 255,264,269,282,285,294 и 299 нм) позволяют сделать заключение о том, что при взаимодействии дипептида с ионом Zn остатке триптофана происходит перераспределение электронной плотности, что может происходить при участии остатка триптофана в образовании координатпюнных соединений.

Сравнивая полученные результаты с данными литературы (Бобиев, 1991; Бобиев и др., 1997,1998; Щербакова, Панкратова, 1991), было сделано предположение, что ион Zn2+ образует ионную связь с карбоксильной группой остатка триптофана, а наиболее вероятными местами координатой будут атом ' кислорода карбоксильной группы остатка триптофана и алектронодонорные атомы пептидной связи.

Исходя из структуры пептида и природы металла-комплексообразователя были предложены возможные реакции образования координаттионных соединений, которые согласуются с реакциями, предложенными для образования координационных соединений иона Си и некоторых дии трипептидов (Бобиев и др., 1998; Борисова, 1966; Пороптин и др., 1971; Турсунов и др., 1971). Согласно.

90 предложенным реакциям образование координационных соединений может проходить в две стадии. На первой стадии происходит присоединение к иону цинка одной молекулы дипептида с образованием положительно заряженного комплекса. На второй стадии происходит присоединение второй молекулы пептида с образованием нейтрального комплекса.

Изучение иммуностимулирующей активности полученных координатцюнных соединений и исходных дипептидов по усилению антителообразования у иммунизированных животных при совместном применении с противотейлериозной вакциной показало, что после координации с ионом Zn2+ увеличивается иммуностимулирующая активность полученных координационных соединений по сравнению с исходными дипептидами.

Пептиды, не проявившие активности in vitro в тесте Е-розеткообразования клетки (Дейгин и др., 1987), не проявили биологической активности in vivo при совместном применении с противотейлериозной вакциной. Применение координатцюнных соединений данных дипептидов, например дипептида валил-триптофан, вызывало двухкратное увеличение титра противотейлерийных антител. Биологическая активность пептидов, проявляемая in vitro в тесте Е-розеткообразования клетки, соответствует их активности, проявляемой in vivo при совместном применении с противотейлериозной вакциной. Свободные дипептиды H-GIu-Trp-OH и Н-Пе-Тгр-ОН, проявивтие in vitro в тесте Е-розеткообразования клетки 100%-ную биологическую активность, вызывали увеличение титра антител в 2−3 и в 4 раза, соответственно. Применение дипептида H-Asp-Trp-OH, проявившего в тесте Е-розеткообрааования клетки 30% активности дипептида H-GIu-Trp-OH, вызывало увеличение титра.

91 противотейлерийных антител на 40−100%. Координационные соединения дипептида Н-Пе-Тгр-ОН с ионом Ъп+ вызывали увеличение титра противотейлерийных антител в 4−8 раз по сравнению с исходным дипептидом. После координации с ионом Хп2+ отмечалось 1,5−2-кратное увеличение иммуностимулирующей активности по сравнению с исходными дипептидами. Полученные результаты согласуются с данными (Бобиев, 1999; Бобиев и др., 1997,1998; Крисе и др., 1990; МгаЬе! ег а1., 1992), показывающими, что координация с ионами металлов приводит к усилению специфической биологической активности лиганда. По данным (Бобиев, 1999;Бобиев и др., 1997,1998) при координации с ионом железа происходит двукратное увеличение титра противотейлерийных антител. В нашем случае наблюдается 2−8-кратное увеличение титра антител. Из этого можно заключить, что цинк, как более активный металл, вызывает большее увеличение специфической биологической активности.

Таким образом, координация триптофансодержаших дипептидов с ионом + способствует повышению иммуностимулирующей активности исходных дипептидов, причем это повышение зависит от биологической активности исходного пептида.

После установления высокой иммуностимулирующей активности координационных соединений низкомолекулярных иммуноактивных пептидов, на их основе был разработан препарат тимоцин, представляющий собой 0,04%-ный водный раствор координационного соединения такого пептида с ионом Zn2+.

Проверка стерильности данного препарата, осуществленная путем высева на различные среды (МПА, мПБ, мППБ, среда Сабуро) показала, что данный препарат является стерильным по отношению к аэробным и анаэробным бактериям и контаминации.

92 грибами. Изучение стабильности препарата тимоцин в условиях длительного хранения позволило установить его срок годности равным 2 года Исупов и др., 1999).

После этого были изучены токсические свойства тимотцина (Бобиев и др., 1998).Изучение острой токсичности, проведенное на белых мышах кроликах, овцдх и телятах показало, что однократное применение тимоцина белым мышам в доае 15−100мл/кг (1050−7000 терапевтических доз), кроликам -5-го мл/кг (350−1400 терапевтических доз), овцам и телятам в дозах 5−15мл/кг (360−1050 терапевтических доз) не оказывает отрицательного воздействия и не вызывает признаков отравления у лабораторных и сельскохозяйственных животных.

При изучении хронической токсичности было показано, что длительное (в течение 10 суток) применение тимоцина белым мышам в дозах 5−25 мл /кг (357−1785 терапевтических доз) и кроликам в дозах 5−10 мл/кг (357−714 терапевтических доз) не вызывает у них признак овотравления.

При проведении патоморфологических исследований изменений паренхиматозных органов и других систем организма обнаружено не было. При исследовании функтптонадьного состояния сердечнососудистой и дыхательной систем у кроликов режим сокращения сердца в среднем составлял 128 ударов в минуту, дыхательных движений — 56, температура тела подопытных кроликов в период опыта составляла 39,2−39,5°С, что находится в пределах физиологической нормы.

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что тимоцин при введении в организм лабораторных и сельскохозяйственных животных (однократном и длительном) не оказывает повреждающего действия, не вызывает побочных явлений.

93 месячного и общего характера и, следовательно, является для них практически нетоксичным препаратом.

Исходя из наших данных и данных других исследователей (Бобиев, 1999; Бобиев и др., 1997,1998; Добрынина, 1992; Киреева и др., 1978; Крисо и др., 1990; Перелъдин и др., 1979; МгаЬег е1 а1., 1992) координация с ионами металлов не приводит к появлению токсических свойств или их увеличению у биологически активных лигандов. '.

О нормальном функционировании иммунной системы организма судят по уровню гуморального и клеточного иммунного ответа и факторов неспецифической резистентности организма. Показателем гуморального иммунного ответа является уровень антител, вырабатываемых организмом на введение антигена, а факторов неспецифической резистентности организма — лизоцимная и бактерицидная активность сыворотки крови.

В связи с этим иммуностимулирующую активность тимоцина оценивали по его влиянию на усиление антителообразования и факторы неспецифической резистентности организма при его совместном применении с ассоциированной гидрооксьалюминиевой формолвакциной против рота-, коронавирусных антеритов и колибактериоза телят (Бобиев и др., 1998).

При этом опытных животных первой группы иммунизировали вакциной совместно с тимоцином, второй — только вакциной, животные третьей группы служили контролем и иммунизации не подвергались.

— /.

Проведенные иследования показали, что до иммунизации в сыворотке крови коров содержались антитела к ротавирусу (определяемые иммунофентным анализом) в титре 2.5-+0.15 1о§-2, коронавирусу (определяемые реактцюй торможения.

• / гемагглютинатцто) в титре 3,0-+0,2 log2 и к эшерихии коли (опеделяемые реакцией аг-глютинации) -1:50−25.

После иммунизации в сыворотке крови животных отмечалось увеличение количества специфических антител. Титр антител к ротавирусу у животных первой и второй групп достигал 8.4-+0.25 и 6.5-+0.2 log2 к коронавирусу — 9,8″ +0,3 и 7.5-+0.2 log2 и к эшерихии коли-1:1800−200 и 1:800−100,соответственно. Бактеритцедная и лизоцимная активность сыворотки крови животных первой, второй и третьей групп до иммунизатщи составляла б5,0-+0,5 и 3,1-+0,15%, соответственно. Через 21 день после ревакцинации бактерицидная и лизоцимная активность сыворотки крови у животных первой, второй групп сооставляла, соответственно, 80,2-+0,8, 4,9*0,2 и 69,0-+0,75 и 3.3-+0.05%. При иммунизации только вакциной увеличение титра антител к рота-, коронавирусу и эшерихии коли составляло 2,6, 2,5 и 16 раз, соответственно, при иммунизации вакциной совместно с тимоцином 3,36, 3,27 и 36 раз, соответственно. При иммунизации только вакциной увеличение бактеритцедной и лизоцимной активности составляло 4 и 0,2%, при иммунизациц вактцшой совместно с тимоцином -15,2 и 1,8%, соответственно. Следовательно, применение тимоцина способствует увеличении титра антител к ротавирусу в 1,29 раза, коронавирусу — 1,3 раза, эшерихии коли — 2,25 раза, лизоцимной активности — 1,58 раза, бактерицидной — 1,39 раза по сравнению с группой животных, которых иммунизировали только вакциной.

Таким образом, проведенные исследования показали, что применение тимоцина в комплексе с ассоциированной вакциной способствует увеличению уровня гуморального иммунного ответа и факторов неспецифической резистентности организма, что свиде.

95 тельствует о наличии у тимоцита ярко выраженной иммуностимулирующей активности. .

После этого была разработана оптимальная схема совместного применения тимотцина и ассотцшрованной вакцины. Тимоцин применяли в дозах 0,01−0,03 мл/кг живого веса животного один раз в сутки в течение 1−5 дней. Проведенные исследования показали, что однократное применение тимоцина в дозах 0,01, 0,02 и 0,03 мл/кг не оказало существенного влияния на увеличение титраспецифических антител. Применение тимоцина в течение 3 дней в дозе 0,03 мл/кг привело и незначительному увеличению титра специфических антител к коронавирусу (5,0-+0,27 о%2, контроль 3.4-+0.16 1о§-2 Наиболее сильное увеличение титра антител к коронавирусу наблюдалось при применении тимоцина в дозе 0,02 мл/кг в течение 5 дней (5.2-+0.3 1о§-2). Наиболее сильное увеличение титра антител к ротавирусу отмечено при применении тимоцина в дозе 0,03 мл/кг в течение 3 дней (4,8±0,3 og2, в контроле — 3,2-+0,15 1о§ 2).Применение тимоцина в дозе 0,3 мл/кг в течение 3 дней и 0,02 мл/кг в течение 5 дней вызывало двукратное увеличение титра специфических антител к эшерехии коли.

Таким образом, наиболее оптимальным является применение тимоцина в дозах 0,02−0,03 мл/кг в течение 3−5 дней совместно с ассоциированной вакциной против рота-, коронавирусных антеритов и колибактериоза телят.

Разработанный оптимальный способ применения тимоцина, также как и тимофера, представляющего собой координатционное соединение триптофансодержащего дипептида с железом (Бобиев, 1999), предусматривает 3−5-кратное применение препарата для максимальной стимуляции иммунной системы организма животных при вакцинации.

Производственные испытания эффективности вакцинации при совместном применении тимоцина и ассоциированной вакцины показали, при этом значительно увеличивается антителогенез по отношению к каждому вакциному антигену: ротавирусу — на 47%, коронавирусу — на 44%, эшерхии колина 100% После того, как в лабораторных и производственых условиях было показано наличие у тимоцина иммуностимулирующей активности, изучалось его влияние на эфективнность лечения пневмоэнтиритов молодняка крупного рогатого скота (Бобиев и др., 1998).

Тимоцин применяли в комплексе с химиотерапевтическими препаратами ПВЭНТИ и регидропектатом. Тимоцин применяли в дозах 0,02, 0,03 и 0,05 мл/кг живого веса животного один раз в сутки.

•? в течение 3, б и 9 дней подкожно или внутримышечно. Контролем служили животные которых лечили только химиотерапевтическими препаратами.

Полученные результаты цоказали, что наибольшая эффективность лечения отмечалась в тех группах животных, в которых тимоцин применяли в дозах 0.02, 0,03 и 0,05 мл/кг один раз в сутки в течение 6 дней. Эффективность лечения в этих группах была на 20% выше, чем в контрольной группе. В этих группах выздоровление больных животных наступало на 6−7 сутки, тогда как больные животные контрольной группы выздоравливали на 13−14 сутки. При этом было установлено, что увеличение эффективности лечения не зависело от способа введения тимоцинаподкожного или внутримышечного.

После установления этого факта были проведены производственные испытания тимоцина при лечении вышеуказанного заболевания.

В опытной группе больных животных тимоцин применяли в комплексе с химиотерапевтическими препаратами ПВЭНТИ и.

97 регидропектататом в дозах 0,02−0,03 мл/кг живого веса один раз в сутки в течение 5 дней. Животных контрольной группы лечили с помощью известных препаратов Т-активина, иодинола и регидрата.

Результаты производственных испытаний показали, что в опытной группе эффективность лечения составляла 94,27%, срод лечения-7 дней, в контрольной-83,4% и 12 дней, соответственно. Таким образом, было показано, что применение тимоцина в комплексе с химиотерапевтическими препаратами способствует повышению эффективности и сокращению срока лечения пневмоэнтеритов молодняка крупного рогатого скота.

Также было изучено влияние тимоцина на антителогенез у молодняка крупного рогатого скота при совместном применении живой культуральной противотейлериозной вакциной (Бобиев и др., 1998). Животных опытной и контрольной групп иммунизировали вакциной в дозе 1 мл (0,1 млн живых клеток) на голову. Тимоцин вводили внутримышечно трехкратно с интервалом через день в дозах 1 мл на 100 кг живого веса животного (1 группа), 2 мл (2 группа), Змл (3 группа), 4мл (4 группа). Контрольной группе иммунизированных животных тимоцин не вводили.

Результаты проведенных исследований показали, что у телят первой группы титр противотейдерийных антител, определяемых иммуноферментным анализом, составлял 1:50−1:200, второй-1:100−1:800,третьей-1:400−1:1600, четвертой-1:200−1:1600, в контрольной группе титр антител состовлял у двух телят 1:501:200, у одного -1:400 и у одного-1: 800. Из этих данных видно, что приминение тимоцина в дозе 1 и 2 мл не оказало сушественного влияния на увеличение титра противотейлерийных антител. Наибольшее увеличение титра антител (2−3 раз) отмечалось при применении тимоцина в дозе 3 мл на 100 кг живого веса животного.

Таким образом, применение тимоцина способствовало значительному увеличению титра специфических антител у молодняка крупного рогатого скота, иммунизированного противотейлериозной вакциной.

После получения положительного результата в акспериментальных условиях были проведены производственные испытания тимоцина при совместном применении с противотейлериозной вакциной.

Результаты этих испытаний показали, что четырехкратное применение тимоцина с интервалом через день в дозе 3 мл на 100 кг живого веса животного вызывало образование специфических противотейлерийных антител у 85% опытных животных в титре 1:400 -1:800, у оставшихся 15% титр антител достиг уровня 1:1600. В контрольной группе в сыворотке крови 50% телят титр антител составлял 1:50−1:200, у 30%-1: 200−1:400, 20% - достиг уровня 1: 800.

Поствакцинальная реакция на введение вакцины у телят опытной группы прошла без осложнения, вынужденного убоя падежа животных, продолжительность ее составила 5−7 дней. Температура тела животных при этом повышалась до 40,0−41,1°С. Отмечалось умеренное увеличение в основном предлопаточных лимфатических узлов. В мазках крови обнаруживалось до 92 тейдерий в 100 полях зрения микроскопа.

У телят контрольной группы длительность поствакцинальной реакции составила 7−10 дней, температура тела повышалось до 40,1−41,5°С, отмечалось значительное увеличение лимфатических узлов. В мазках крови пораженность эритроцитов тейлериями дохбдила до 148 паразитов в 100 полях зрения микроскопа. У 50 телят отмечалось ослабление аппетита.

Полученные результаты показывают, что тимоцин обладает такой же или чуть большей иммуностимулирующей активностью по и сравнению с тимофером. Тимоцин вызывает 4−8 краткое увеличение.

• /.