Разработка метода индикации бактериофагов, лизирующих молочнокислые бактерии

Актуальность проблемы. Развитие рыночных отношений в нашей стране, перспективы вступления во Всемирную торговую организацию все более настойчиво ставят вопросы повышения качества и конкурентоспособности продукции, в особенности продукции пищевой промышленности. В связи со сложной экологической обстановкой в настоящее время получение качественного продукта представляет собой достаточно непростую задачу. Состав микрофлоры, участвующей в биотехнологическом цикле, играет важную роль в получении ферментированных молочных продуктов с требуемыми показателями качества и безопасности. В результате развития полезной микрофлоры в молочном сырье происходит ряд биохимических реакций, при которых формируются органолептические, физико-химические и микробиологические показатели готовых продуктов. Направленность биотехнологических процессов в производстве молочных продуктов во многом определяется активностью развития стартовых культур в применяемом сырье.

Одной из важнейших причин снижения активности молочнокислого процесса является поражение микрофлоры заквасок бактериофагами. Попадание бактериофагов в сырье возможно на любой стадии производства, что приводит к торможению или полному прекращению процесса ферментации молочного сырья, нарушению консистенции, потере аромата, возникновению порока позднее вспучивание сыров или ухудшению других показателей качества. Нарушение молочнокислого процесса при получении ферментируемых продуктов приводит к материальным потерям, а также увеличению возможности возникновения пищевых инфекций за счет развития остаточной микрофлоры и микрофлоры вторичного обсеменения, в том числе условно-патогенных микроорганизмов и их токсинов.

Теоретические и практические основы в изучении явления бактериофагии в молочной промышленности заложены в трудах В.З.

Ахвердяна, J1.A. Банниковой, В. И. Ганиной, A.B. Гудкова, Н. С. Королевой, Н. Ф. Кувалдиной, Л. Г. Мытник, Г. Д. Перфильева, В. Ф. Семенихиной, Д. А. Яковлева, Н. Ackermann, V. Braun, A. Coffey, С. Hill, A. Jarvis, T. R. Klaenhammer, P. Laux, S. Moineau, H. Neve, B. Terzaghi, M. Teuber, D. Tremblay и др. Изучением явления бактериофагии ученые занимаются несколько десятилетий, тем не менее, существует ряд нерешенных проблем.

Важнейшим этапом предотвращения фаголизиса на предприятиях является оценка фаговой ситуации путем проведения мониторинга бактериофагов. На отечественных молочных предприятиях практически не проводится фаговый мониторинг, который позволял бы систематически устанавливать наиболее опасные критические контрольные точки и вовремя разрабатывать и осуществлять профилактические мероприятия. Такое положение в нашей стране связано с несовершенством методов по выявлению бактериофагов. Существующие методы, которые применяются в настоящее время на предприятиях, позволяют выявлять бактериофаги, лизирующие лактококки. В то время как на предприятиях молочной промышленности с резким увеличением ассортимента выпускаемых продуктов, по-видимому, расширился спектр фагов, которые способны инактивировать молочнокислые бактерии разных таксономических групп.

В этой связи актуальным и целесообразным является разработка метода индикации и выделения бактериофагов, способствующего установлению критических контрольных точек на всех этапах биотехнологического процесса, снижению риска обострения инфекции бактериофагами в условиях предприятий молочной промышленности и осуществлению фундаментальных исследований.

Цель исследований. Целью настоящей диссертационной работы являлось разработка метода индикации бактериофагов, способных лизировать различные виды молочнокислых бактерий, а также позволяющего выделять чистые бактериофаги для использования при отборе фагоустойчивых стартовых культур и усовершенствовать мероприятия по профилактике явления бактериофагии.

Научная новизна работы. Обоснованы рациональные режимы подготовки проб, позволяющие выявлять наличие бактериофагов в молочном сырье, продуктах, смывах с оборудования. Экспериментально установлены сочетания жидких и плотных стандартизованных питательных сред для выявления бактериофагов, лизирующих разные таксоны молочнокислых бактерий.

На основании изучения спектра литического действия выявлены чувствительные тест-культуры для обнаружения бактериофагов, лизирующих термофильные молочнокислые стрептококки и палочки.

Проведено изучение свойств и идентификация вновь выделенных бактериофагов с применением полимеразной цепной реакции, что позволило осуществить их депонирование в ФГУП ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов под номером РЬ-1622, РЬ-1623, РЬ-1624, РЬ-1625.

С применением разработанного метода впервые установлено, что на предприятиях молочной промышленности присутствуют бактериофаги, лизирующие не только лактококки, но и термофильные стрептококки и молочнокислые палочки.

Получены новые данные о влиянии различных веществ на адсорбцию бактериофагов на клетки молочнокислых бактерий. Научно и экспериментально обоснован состав антифаговой питательной среды, способствующей подавлению действия бактериофагов.

Практическая ценность работы. Разработан метод индикации бактериофагов, лизирующих различные виды молочнокислых бактерий, проведена его проверка в лабораторных и производственных условиях, показана эффективность применения разработанного метода для выявления бактериофагов, лизирующих молочнокислые бактерии разных таксонов. Разработаны этапы мониторинга бактериофагов и стартовых культур на предприятиях молочной промышленности.

Выделенные бактериофаги используются при исследовании фагочувствительности производственных штаммов, заквасок.

Разработана и утверждена Инструкция по проведению мобильного мониторинга бактериофагов и контролю стартовых культур.

На способ получения антифаговой питательной среды подана заявка на патент за № 2 006 141 278 от 22.12.2006.

Полученные результаты используются в учебном процессе при проведении лабораторных работ, выполнении научных дипломных работ и на факультете повышения квалификации специалистов молочной промышленности. Разработаны и изданы методические указания к выполнению лабораторных работ для магистров техники и технологий по направлению 260 100 — Технология продуктов питания и студентов специальности 260 303 — Технология молока и молочных продуктов.

Диссертационная работа выполнялась по теме № 2−8-03 «Разработка механизма мобильного мониторинга бактериофагов и стартовых культур в биотехнологических процессах молочных продуктов», осуществляемой в рамках приоритетных направлений развития науки, технологий и техники Российской Федерации «Живые системы».

Апробация работы. Результаты научной работы доложены и обсуждены на студенческой конференции технологического факультета МГУПБ (2004 г), на IV и V Международных научных конференциях студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (2005, 2006 г. г.). В 2004 г. работа была отмечена грантом по конкурсу ассоциации «Университетский комплекс прикладной биотехнологии» (2004 г). Работа была отмечена дипломом на V Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи.

Москва, ВВЦ, 29 июня — 3 июля 2005 г), а также дипломом и медалью на Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (12−16 марта 2007 г).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, аналитического обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, приложений. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц и 24 рисунка. Библиография представлена 155 источниками, в том числе 88 зарубежных авторов, количество приложений 9.

выводы.

1. Установлены рациональные технологические режимы подготовки проб перед их исследованием на наличие или отсутствие бактериофагов: температура нагрева анализируемого образца молочного продукта, сыворотки, смывов с оборудования — (50±-2)°С с выдержкой в течение 1 мин при pH- 4,2+0,2. Затем образцы фильтруют в стерильную посуду, используя стерильные фильтры Millipore, или центрифугируют при 3600 об/мин в течение 15 мин.

2. Экспериментально установлены сочетания жидких и плотных стандартизованных питательных сред и чувствительные тест-культуры для выявления бактериофагов, лизирующих разные таксоны молочнокислых бактерий.

3. Выделены и идентифицированы с помощью ПЦР-фингерпринта новые бактериофаги, которые приняты на национальное патентное депонирование во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов и зарегистрированы за номером ВКПМ Ph-1622, Ph- 1623, Ph- 1624, Ph- 1625. Показано, что ПЦР-фингерпринт бактериофагов можно проводить с применением коротких неспецифических праймеров.

4. Изучено действие растворов кислоты, щелочи, дезинфицирующих средств, УФ-излучения на вновь выделенные бактериофаги. Показано, что для снижения титра бактериофагов следует использовать комбинированное воздействие инактивирующих факторов. Наибольший эффект достигали при использовании средства «Divosan Forte» и проведении обеззараживания воздуха.

5. Научно обоснован и разработан состав антифаговой питательной среды для снижения адсорбции фаговых частиц на клетках молочнокислых бактерий. Подана заявка на изобретение за № 2 006 141 278 от 22.12.2006.

6. Разработан метод индикации и этапы мониторинга бактериофагов, лизирующих различные виды молочнокислых бактерий, на основе осуществленных комплексных исследований.

7. Разработана и внедрена в промышленности Инструкция по проведению мобильного мониторинга бактериофагов и контролю стартовых культур, включающая схему проведения фагового мониторинга и метод индикации бактериофагов.

1.7.

Заключение

.

На основании проведенного анализа отечественных и зарубежных источников информации по изучаемому направлению можно сделать следующее заключение.

Анализ состояния производства показывает, что одним из факторов снижения качества и безопасности кисломолочных продуктов и сыров, является снижение интенсивности и направленности микробиологических процессов, вызываемое бактериофагами. Исследования, проводимые учеными разных стран мира до настоящего времени, свидетельствуют о сложности проблемы бактериофагии.

В настоящее время на предприятиях наиболее часто выявление бактериофагов осуществляют косвенными методами: по торможению процесса ферментации и не типичной микроскопической картине заквасочной микрофлоры. На некоторых предприятиях используют прямой метод обнаружения бактериофагов в заквасках, который изложен в.

Технологической инструкции по приготовлению и применению заквасок и бактериальных концентратов для кисломолочных продуктов на предприятиях молочной промышленности, который позволяет выявлять бактериофаги, лизирующие лактококки. В настоящее время на предприятиях молочной промышленности с резким увеличением ассортимента выпускаемых продуктов, по-видимому, расширился спектр фагов, которые способны инактивировать молочнокислые бактерии разных таксономических групп. Кроме того, несовершенство существующих методов обусловлено применением мезофильных молочнокислых бактерий тест-культур, ограниченного числа питательных сред и низкой чувствительностью методов.

На основании вышеизложенного сформулирована цель диссертационной работы — разработка метода индикации бактериофагов, способных лизировать различные виды молочнокислых бактерий, а также позволяющего выделять чистые бактериофаги для использования при отборе фагоустойчивых стартовых культур и усовершенствовать мероприятия по профилактике явления бактериофагии.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

— подобрать режимы подготовки проб для выявления бактериофагов;

— обосновать выбор жидких и плотных стандартизованных питательных сред для выявления бактериофагов молочнокислых бактерий разных видов;

— разработать метод индикации бактериофагов и осуществить его проверку в лабораторных и производственных условиях;

— исследовать современное состояние фагового фона на предприятиях, вырабатывающих ферментируемые молочные продукты;

— разработать мероприятия по профилактике бактериофагии и этапы мониторинга бактериофагов на предприятии;

— разработать Инструкцию по проведению мобильного мониторинга бактериофагов и контролю стартовых культур на предприятиях молочной промышленности.

2. ОРГАНИЗАЦИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА, ИЗУЧАЕМЫЕ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Организация эксперимента.

Микробиологические, биохимические исследования проводили на кафедре «Технологии молока и молочных продуктов» Московского государственного университета прикладной биотехнологии.

Идентификацию выделенных в ходе работы бактериофагов проводили совместно с ФГУП ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

При проведении исследований использовали стандартные и унифицированные микробиологические, биохимические, генетические, спектрофотометрические и математические методы.

Схема проведения исследований представлена на рис. 2.1.

2.2. Объекты исследований.

Объектами исследований служили: образцы молочного сырья и готовых продуктов, вторичного молочного сырья, отобранные на предприятиях молочной промышленности, на которых имелись случаи замедления процессов ферментацииобразцы смывов, отобранных с технологического оборудованиявоздух производственных помещенийзакваски традиционные и прямого внесения: отечественного и импортного производства, применяемые на молочных предприятияхкультуры молочнокислых бактерий из коллекции кафедры «Технологии молока и молочных продуктов» МГУПБ: 5 штаммов Streptococcus salivarius subsp. thermophilus- 1 штамм Lactobacillus bulgaricus- 2 штамма Lactobacillus acidophilus- 8 штаммов Lactococcus lactis разных подвидовсерийно-выпускаемая тест-культура для выявления бактериофагов лактококковжидкие и плотные питательные средыколлекционные и вновь выделенные бактериофаги.

Рис. 2.1. Схема проведения исследований.

Показатели: 1 — титруемая кислотность- 2 — активная кислотность- 3 — активность сквашивания- 4 — органолептические показатели- 5 — микроскопический препарат- 6 -количество клеток молочнокислых бактерий- 7 — количество фаговых частиц- 8 -однопраймерная ПЦР- 9 — ПЦР со специфическими праймерами- 10 — наличие фаголизиса культуры- 11 — спектр литического действия бактериофагов- 12 — продолжительность выдержки- 13 — температура- 14 — оптическая плотность- 15 — морфология бляшек бактериофагов.

2.3. Материалы и питательные среды.

Для приготовления стерильного обезжиренного молока сухое обезжиренное молоко смешивали при 45 °C с водой в соотношении 100 г сухого молока на 1 дм воды. Затем выдерживали молоко 30−60 мин для набухания белков, фильтровали и стерилизовали при давлении 0,1 МПа в течение 15 мин при температуре 121 °C.

Для приготовления гидролизованного молока стерильное обезжиренное.

П 1 молоко охлаждали до 45 С, устанавливали рН 7,6−7,8. Затем к 1 дм молока добавляли 0,5−1,0 г порошка панкреатина и 5 см хлороформа. Колбу закрывали корковой пробкой и выдерживали в течение 48−72 ч при температуре 42−45 °С. В течение первых часов молоко несколько раз перемешивали, приоткрывали пробку, чтобы пары хлороформа вышли. После выдержки колбу вынимали из термостата, гидролизованное молоко фильтровали через двойной бумажный фильтр, разводили водой в 2 раза, устанавливали рН 7,0−7,2 и стерилизовали при 121 °C в течение 15 мин. В работе использовали разбавленное гидролизованное молоко и агар с гидролизованным молоком (к разбавленному гидролизованному молоку, добавляли 1,5−2,0% агара, стерилизовали при 121 °C 15 мин).

Для культивирования молочнокислых бактерий и их количественного учета использовали питательные среды: среду для определения термофильных стрептококков (Ml7), среду для определения лактобактерий MRS, среду для определения количества мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ), среду для культивирования бифидобактерий (ГМК-2), тиогликолевую среду для контроля стерильности, приготовленные в соответствии с инструкциями по их приготовлению.

Физиологический раствор готовили по ГОСТ 10 444.11.

Для проверки на стерильность питательные среды выборочно помещали в термостат t=(37±l) °С выдерживали до 3-х суток. Стерильность определяли по микроскопии препарата или по образованию помутнения среды при выдержке ее в течение трех суток при (37±1) °С.

2.4. Методы исследований.

2.4.1. Биохимические методы исследований Определение титруемой кислотности проводили методом титрования по ГОСТ 3624–92, ГОСТ 13 264–88.

Определение активной кислотностирН проводили потенциометрическим методом по ГОСТ 19 881 с использованием рН-метра марки рН-150.

2.4.2. Микробиологические методы исследований.

При проведении исследований применяли стандартные микробиологические методы.

Контроль штаммов на чистоту проводили микроскопированием. Микроскопирование препаратов осуществляли в соответствии с ГОСТ 922 584 и Инструкцией по микробиологическому контролю на предприятиях молочной промышленности.

Отбор проб и подготовка к анализу осуществляли по ГОСТ 9225.

Для получения бактериальных культур в логарифмической фазе роста.

3 9 вносили 1 см исследуемой «ночной» культуры (КОЕ=Ю), закваски, бактериального концентрата в стерильные жидкие питательные среды (100 см3), колбы термостатировали при температуре, зависящей от видового состава: лактококки — (28±1) °С, термофильные стрептококки — (37±1) °С, молочнокислые термофильные палочки — (37±1) °С. Наступление собственно логарифмической фазы роста культур определяли по наличию в пробирках с культурой увеличения оптической плотности по сравнению с исходным материалом.

Для количественного учета молочнокислых бактерий (ГОСТ 30 705−2000) готовили ряд десятикратных разведений, для посева отбирали не менее трех последовательных разведений (ГОСТ 9225−84).

Для выявления наличия бактериофагов в исследуемых образцах применяли метод поверхностного посева (ГОСТ 26 670−85) на чашки Петри, который заключается в следующем: на чашки Петри с подсушенной средой наносили 0,1 см³ индикаторной тест-культуры в фазе логарифмического роста, растирали на поверхности шпателем Дригальского и оставляли на 1015 мин для впитывания влаги в агар. Затем на чашку наносили каплю образца, закрывали крышкой и оставляли на 10−15 мин при комнатной температуре. После чего чашки переворачивали и термостатировали в течение 16−18 ч при температуре (28±-1)°С при выявлении бактериофагов лактококков и при (37±-1)°С при выявлении бактериофагов, лизирующих термофильные молочнокислые стрептококки и термофильные палочки. Если после указанного времени термостатирования наблюдали зону угнетения роста в месте нанесения исследуемого образца, то устанавливали перевиваемость литического агента.

Для этого в пробирку с 3 см³ стерильного физиологического раствора помещали кусочек агара, взятый из зоны лизиса, добавляли 0,3 см³ хлороформа, тщательно взбалтывали и оставляли на 24 ч при температуре (4±-2)°С для более полного выхода частиц фага из агара. Затем каплю суспензии из пробирки наносили на свежеприготовленный газон индикаторной культуры и термостатировали 16−18 ч. В случае появления негативной (прозрачной) зоны вновь, считали, что угнетение роста культуры вызвано действием бактериофага.

Для количественного учета бактериофагов использовали метод определения титра фага (двухслойный метод). Для определения титра фага 3 см³ полужидкой среды (0,75%), 1 см³ тест-культуры в фазе.

3 о логарифмического роста, 1 см разведения фага перемешивали при 42 С. Затем выливали на чашку Петри с подсушенной плотной питательной средой.

1,5%). Термостатировали в течение 16−18 ч при температуре (28±-1)°С при выявлении бактериофагов лактококков и при (37±-1)°С при выявлении бактериофагов, лизирующих термофильные молочнокислые стрептококки и палочки. На следующий день по числу негативных колоний с учетом разведений определяли титр фага. л.

Для накопления бактериофагов в 10 см стерильного гидролизованного молока (разведенного водой 1:1, рН 6,8−7,0), либо среды М17 вносили 1−2 о л «2 петли чувствительной культуры (КОЕ=Ю -10 в 1 см), термостатировали до получения культуры в фазе логарифмического роста. Затем в эту же пробирку вносили кусочек агара с зоной лизиса, либо 0,1 см³ лизата.

8 3 бактериофага (10 БОЕ в 1 см) — термостатировали в течение 16−18 чцентрифугировали в стерильных стаканчиках при 3600 об/мин в течение 20 мин. или фильтровали через установку «Стерифил 250» с фильтром (размер пор 0,46 мкм), задерживающим бактерии и пропускающим вирусы, а затем полученные лизаты переносили в стерильные пробирки.

Действие УФ-излучения на фаги в лабораторных условиях определяли по наличию или отсутствию зон лизиса в смыве, взятом после обработки поверхности пластины, изготовленной из нержавеющей стали и имитирующей поверхность оборудования.

Действие дезинфицирующих веществ, уровней рН и температуры на фаги в лабораторных условиях определяли по изменению титра бактериофагов в образце после воздействия.

Для определения влияния различных веществ на адсорбцию фагов на л клетки молочнокислых бактерий 200 см каждой питательной среды л л подогревали до температуры (30±2) С. В образцы добавляли 10 см.

7 3 фильтрата, содержащий бактериофаг с титром 10' БОЕ/см и 3% свежеприготовленной культуры. В качестве контроля для сравнения использовали приготовленные таким же образом образцы, в которые не был внесен бактериофаг, а также обезжиренное молоко с фагом и без добавления фага. Далее термостатировали при (30±2) °С, определяли в течение каждого часа титруемую и активную кислотность.

Для поддержания стартовых культур в активном жизнеспособном состоянии производили их периодические пассажи. Поскольку в работе применяли молочнокислые бактерии, то в качестве среды использовали стерильное обезжиренное молоко. Культуры молочнокислых бактерий перевивали петлей в 10 см³ стерилизованного обезжиренного молока, термостатировали (при температуре лактококки — (28±1) °С, термофильные стрептококки и палочки (37±1 °С)) до свертывания молока, после чего полученные культуры хранили при температуре (4±-2)°С. Интервал между перевивками составлял не более 20 дней.

Для длительного хранения клеток молочнокислые бактерии перевивали в обезжиренном молоке и хранили при -20 °С в течение полугода. Коллекцию фагов поддерживали в лизатах на среде Ml7 с добавлением 0,1% хлороформа при температуре (4±2) °С и в лиофилизированном состоянии.

Контроль штаммов на чистоту проводили микроскопированием. Фаги проверяли по своей видовой специфичности (спектр литического действия) и по морфологии бляшек.

2.4.3. Спектрофотометрические методы исследований.

Оптическую плотность бактериальных суспензий определяли при помощи прибора колориметр фотоэлектрический концентрационный КФК-2 согласно инструкции по применению.

2.4.4. Генетические методы исследований.

Получение генетически чистой культуры. Охлажденной стерильной бактериальной петлей захватывали отдельную хорошо изолированную колонию, выросшую на поверхности плотной питательной среды. Затем У переносили прилипшие к петле бактерии в пробирку, содержащую 1 см жидкой среды, перемешивали с помощью смесителя Vortex. Далее снова стерилизовали петлю, охлаждали ее и погружали в полученную суспензию бактерий, наносили прилипшие к петле бактерии штрихом на сегмент чашки с агаризованной М17 средой. Далее снова петлю стерилизовали, охлаждали и проводили петлей поперек из концов первичного штриха и рассевали прилипшие бактерии по свежей области агаризованной среды. Этот этап повторяли еще 3 раза. Затем накрывали чашку крышкой и культивировали при оптимальной температуре для данного вида бактерий в течение 16−18 ч. После культивирования выделяли отдельную колонию и вносили ее в стерильное обезжиренное молоко, культивировали при оптимальной температуре до образования сгустка.

Очистка бляшек бактериофага. Для получения генетически чистого бактериофага, титровали выделенные из промышленных образцов смеси фагов. Далее добавляли 1 см бактериальной культуры к 3 см полужидкого агара и выливали суспензию в мягком агаре на чашку с плотной питательной средой. Затем погружали прямую стерильную проволочку в препарат бактериофага, полученный из отдельной бляшки, и осторожно наносили штрихи на поверхности застывшей агаризованной среды. Переворачивали чашки и инкубировали при оптимальной температуре в течение 16−18 ч. После получения полос лизиса бактериальных культур вырезали при помощи шпателя кусочек агара из зоны лизиса, не затрагивая бактериальные клетки, вносили его в 100 цл дистиллированной воды, далее вносили 0,1 см хлороформа, перемешивали с помощью смесителя Vortex и оставляли при (4±1) °С на ночь для более полного выхода фаговых частиц.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) [144,147]. ПЦР была проведена в 30 i, содержащих 3 ц 2'шМ дезоксинуклеозид трифосфата (dNTP), 2 jil праймера М13 [144], 1.25 U Taq-полимеразы, 3 Taq-буфера Х-10, 3 fil раствора 15 mM MgCl2, 14 бидистилированной воды, 5ц1 образца. В смесь добавляли 2 капли минерального масла. Для проведения ПЦР использовали амлификатор ДНК «Терцик» (ТУ 9452−001−46 482 062;98).

Условия ПЦР были оптимизированы в ампфликаторе: 5 мин 94 °C с последующими 30 циклами (30 с 95 °C, 30 с при 45 °C, 2 мин при 72 °С) и итоговый этап 3 мин при 72 °C. После окончания амплификации проводили электрофорез в 1,5% агарозном геле в ТАЕ-буфере (40 шМ ТпБ-ацетата, 1 тМ ЕОТА), затем гель окрашивали раствором бромистого этидия в течение 15 мин, после чего продукты ПЦР были просмотрены при УФ-свете.

ПЦР была проведена таким же образом при использовании праймера 1254.

ПЦР со специфическими праймерами [128]. ПЦР была проведена в 30 содержащих 3 ц1 2 шМ дезоксинуклеозид трифосфата (сЮТР), по 0,5 ц1 специфических праймеров 936 А, 936 В, с2А, с2 В, Р335 А, Р335 В, 1.25 и Тац-полимеразы, 3 ц1 Тац-буфера Х-10, 3)11 раствора 15 шМ 1У^С12, 14 р.1 бидистилированной воды, 5ц1 образца.

Условия ПЦР были оптимизированы в ампфликаторе: 5 мин 94 °C с последующими 30 циклами (30 с 95 °C, 30 с при 68 °C, 2 мин при 72 °С) и итоговый этап 3 мин при 72 °C. ПЦР продукты были отделены на 1,5% агарозегеле в ТАЕбуфере (40 шМ ТпБ-ацетата, 1 шМ БЭТА), окрашены раствором бромистого этидия и просмотрены при УФ-свете.

2.4.5. Математические методы.

Эксперименты проводили в 3−7 кратной повторности. Достоверность экспериментальных данных оценивали общепринятыми методами математической статистики с использованием пакета компьютерных программ при доверительной вероятности > 95% [18,19,20,29].

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ РАЦИОНАЛЬНЫХ ПАРАМЕТРОВ МЕТОДА ИНДИКАЦИИ БАКТЕРИОФАГОВ, ЛИДИРУЮЩИХ МОЛОЧНОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ РАЗНЫХ ТАКСОНОВ.

3.1. Изучение влияния подготовки проб на выявление бактериофагов.

Анализ имеющихся литературных данных свидетельствует о целесообразности для обнаружения фагов применять прозрачные питательные среды, поскольку на них лучше видны прозрачные зоны лизиса культуры. В биотехнологии молочных продуктов основным является молочное сырье, содержащее белок, что значительно затрудняет обнаружение бактериофагов, поэтому было предложено перед выявлением бактериофагов проводить предварительную обработку образцов.

Исходя из имеющейся информации о кислотои термоустойчивости фагов, способных инактивировать молочнокислые бактерии, изучали возможность совместного использования химических, физических и механических факторов на промышленные образцы для удаления из них белков. С этой целью всего было отобрано 250 образцов с четырех предприятий молочной промышленности при производстве разных видов молочных продуктов по ходу технологии. В качестве химических факторов использовали понижение активной кислотности образца (при добавлении 20%- ной серной или молочной кислот), физических — нагрев образца, механических — микрофильтрацию образца с помощью мембран МПНроге (размер пор 0,46 мкм) или центрифугирование 15 мин при скорости 3600 об/мин. Подготовку проб осуществляли в следующей последовательности: 1) подбор уровня активной кислотности для наиболее эффективного осаждения белков- 2) подбор температуры нагрева проб для интенсификации процесса отделения сыворотки и частичного осаждения белков- 3) определение эффективности механической обработки.

Подбор уровня рН активной кислотности.

Для осаждения белков молока понижали уровень активной кислотности испытуемых проб до рН (3,2±0,2), (4,2±0,2) и (5,2±0,2). Белки (казеин, часть сывороточных белков) были осаждены при рН (3,2±0,2), (4,2±0,2). При рН (5,2±0,2) была осаждена лишь часть сывороточных белков, поэтому сыворотка из проб не выделялась. Следует отметить, что при рН (4,2±0,2) бактериофаги были выделены в 57% изученных проб, при рН (3,2±0,2) этот показатель был ниже и составлял 48%, что можно объяснить инактивацией бактериофагов (рис. 3.1).

Для интенсификации процесса отделения сыворотки и частичной денатурации белков далее нагревали пробы.

Подбор температуры нагрева проб молочного сырья, сыворотки, готовых продуктов, смывов с оборудования.

Исследования были проведены при трех температурных режимах: при температуре (40±2) °С, (50±2) °С и (60±2) °С, выдержка составила 1 мин. Необходимо было выбрать такой температурный режим, который бы обеспечивал хорошее отделение сыворотки от пробы, при котором бактериофаги сохраняли бы жизнеспособность, и не происходила их инактивация.

По результатам эксперимента установлено, что наиболее эффективно бактериофаги были выделены из образцов при нагреве до температуры (50±2) °С с выдержкой в течение 1 мин (рис. 3.2).

Режим (60±2) °С обеспечивал выявление бактериофагов в 51% исследуемых проб, что свидетельствует о температурной инактивации бактериофагов и понижении эффективности выявления бактериофагов на 13% по сравнению с режимом (50±2) °С.

При (40±2) °С в 9% проб не были получены четкие результаты из-за плохого отделения сыворотки от сгустка. X и Ш С О а: го 3 -8т о? о? |1.

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 рН=3,2±-0,2 рН=4,2±-0,2 рН=5,2±-0,2.

Уровень активной кислотности количество образцов, по которым не получено четкого результата количество образцов, в которых выявлены бактериофаги И количество образцов, в которых бактериофаги не выявлены 34.

52 1 ш.

Рис. 3.1. Влияние величины уровня активной кислотности проб молочного сырья, сыворотки, смывов с оборудования на эффективность выявления бактериофагов.

40±2 град. С 50±2 град. С 60±2 град. С.

Температура нагрева проб количество образцов, по которым не получено четкого результата количество образцов, в которых выявлены бактериофаги.

И количество образцов, в которых бактериофаги не выявлены.

Рис. 3.2. Влияние температуры нагрева проб молочного сырья, сыворотки, смывов с оборудования на эффективность выявления бактериофагов.

Далее пробы с целью отделения сыворотки подвергали механической обработке.

Подбор механической обработки.

Для отделения сыворотки, физиологического раствора (в случае исследования смывов с оборудования) от сгустков белка, микробиальных клеток использовали механическую обработку: центрифугирование при скорости 3600 об/мин в течение 15 минут или микрофильтрацию с применением фильтров МИНроге (размер пор 0,46 мкм).

На рис. 3.3 показана эффективность мембранной обработки для обнаружения бактериофагов. Следует отметить, что при использовании фильтров МИНроге бактериофаги были выявлены в 70%, при использовании центрифугирования — в 68% случаев. Эффективность мембранной обработки определялась отсутствием роста посторонней микрофлоры на зоне лизиса культуры (клетки бактерий были отделены от пробы с помощью фильтров). с центриф. с мембранной фильтрацией.

Вид механической обработки количество образцов, в которых выявлены бактериофаги И количество образцов, в которых не выявлены бактериофаги.

Рис. 3.3. Влияние механической обработки проб молочного сырья, сыворотки, смывов с оборудования на эффективность выявления бактериофагов.

Таким образом, были установлены рациональные технологические режимы подготовки проб молочного сырья и молочных продуктов перед их исследованием на наличие или отсутствие бактериофагов и проведены исследования при определении совместного влияния физических, химических и механических факторов на исследуемые пробы.

Полученные данные, приведенные в табл. 3.1 и рис. 3.4 свидетельствуют о повышении эффективности обнаружения бактериофагов на 20% при проведении подготовки проб по сравнению с определением фагов в пробах без их предварительной обработки.