Помощь в написании студенческих работ
Антистрессовый сервис

Субтилизиноподобная протеиназа Bacillus Intermedius, секретируемая рекомбинантным штаммом Bacillus Subtilis на разных фазах роста

Диссертация: Субтилизиноподобная протеиназа Bacillus Intermedius, секретируемая рекомбинантным штаммом Bacillus Subtilis на разных фазах роста
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Концентрация акриламида в геле составляла 12,5%, бисакриламида -0,12%. Электродный буфер содержал 20,6 мМ т-НС1 и 0,24 М глицина, рН 8,3 -8,4. В верхний буфер добавляли SDS до концентрации 0,1%. Пробу готовили следующим образом: к раствору белка добавляли равный объем раствора, содержащего 24% глицерина, 4% SDS, 10% меркаптоэтанола и инкубировали 5 мин при 100 °C. Оптимальное количество белка… Читать ещё >

Субтилизиноподобная протеиназа Bacillus Intermedius, секретируемая рекомбинантным штаммом Bacillus Subtilis на разных фазах роста (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Содержание

  • СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
  • 1. Основные принципы классификации протеолитических И ферментов
  • 2. Сериновые протеиназы
    • 2. 1. Классификация сериновых протеиназ
    • 2. 2. Эволюция сериновых протеиназ
    • 2. 3. Субтилазы — субтилизиноподобные сериновые протеиназы
    • 2. 4. Структура и механизм катализа субтилизиноподобных протеиназ
    • 2. 5. Свойства субтилизиноподобных протеиназ
    • 2. 6. Многообразие физиологических функций сериновых протеиназ
  • 4. Применение субтилизиноподобных протеаз
  • 5. Генная инженерия субтилизиноподобных протеаз бацилл
  • Заключение
  • ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
  • 1. Объект исследования и условия его культивирования
  • 2. Определение протеолитической активности
  • 3. Выделение и очистка протеиназы рекомбинантного штамма
  • 4. Электрофорез в ПААГ
  • 5. Масс-спектрометрический анализ (MALDI-TOF)
  • 6. Аминокислотный анализ
  • 7. Определение субстратной специфичности
  • 8. Влияние ингибиторов на активность субтилизиноподобной 60 протеиназы
  • 9. Физико-химические и энзиматические свойства 60 субтилизиноподобной протеиназы
  • 10. Спектральный анализ препаратов субтилизиноподобной 62 протеиназы
  • 11. Гель-фильтрация
  • 12. Биоинформационный анализ
  • 13. Математическая обработка результатов 63 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
  • 1. Подбор питательной среды для эффективной продукции 64 протеиназы Bacillus intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis
  • 2. Выделение и очистка и субтилизиноподобной протеиназы В. intermedius, соответствующей разным стадиям роста рекомбинантного штамма
  • 3. Масс-спектрометрический анализ
  • 4. Анализ первичной структуры протеиназы
  • 5. Влияние ингибиторов на активность протеиназы AprB
  • 6. Субстратная специфичность препаратов фермента
  • 7. Кинетические параметры
  • 8. Температурный оптимум и термостабильность
  • 9. рН-оптимум и рН-стабильность протеиназ
  • 10. Стабильность препаратов протеиназы в присутствие различных 92 агентов
  • 11. Спектральный анализ препаратов протеиназы В. intermedius, 93 соответствующей разным стадиям роста
  • 12. Влияние ионов двухвалентных металлов на препараты 99 протеиназы
  • 13. Гель-фильтрация препаратов протеиназы, соответствующих 101 разным стадиям роста
  • 14. Электрофорез препаратов протеиназы в нативных условиях
  • 15. Гель-фильтрация после исчерпывающего обессоливания 104 препаратов протеиназы В. intermedius
  • 16. Построение модели третичной структуры субтилизиноподобной Ю протеиназы В. intermedins
  • ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
  • I. Подбор среды культивирования, выделение и очистка 108 протеиназы, соответствующей разным стадий роста
  • II. Свойства препаратов протеиназы разных стадий роста ИЗ
  • III. Особенности структуры протеиназы, секретируемой на разных 124 стадиях роста
  • ВЫВОДЫ

Актуальность проблемы. Субтилизиноподобные сериновые протеазы — группа протеолитических ферментов, которые обнаружены на всех ступенях эволюционной лестницы: вирусах, бактериях, археях, грибах и высших эукариотах [Rawlings, Barett, 1994]. Несмотря на высокую степень филогенетической удаленности организмов, синтезируемые ими протеиназы имеют немало общего в строении и функциях, что позволяет сделать заключение об эволюционном родстве этих ферментов. Для многих субтилаз известна третичная структура. Распространенность субтилаз в природе свидетельствует о том, что они являются жизненно-важными ферментами. Разнообразие этих белков находит отражение в функционировании субтилаз. Круг процессов, в которые вовлечены эти ферменты, обширен благодаря отсутствию узкой специфичности, сохранению каталитической активности в широких пределах рН и температур, а также различной клеточной локализации. Доказано их участие в процессах эмбриогенеза эукариот, а также в различных патологических состояниях: от болезни Альцгеймера и рака до лихорадки Эбола и ВИЧ [Henrich et al., 2003; Thomas, 2002]. Современная наука располагает данными более чем о 550 прокариотических субтилизиноподобных протеиназ, их число постоянно растет [Siezen et al., 2007]. В клетках прокариот они участвуют в разнообразных физиологических процессах, включая клеточную дифференцировку. Тем не менее, сведения о механизмах вовлечения протеаз в различные процессы, и, в частности, в формирование клеточного ответа в стационарной фазе роста, ограничены. Дальнейшие исследования в этой области будут способствовать пониманию молекулярных механизмов участия этих ферментов в реакциях адаптации микроорганизмов к меняющимся условиям среды.

Ранее показано, что бактерии Bacillus intermedius секретируют различные протеиназы, среди которых доминирует субтилизиноподобная сериновая протеиназа (AprBi) — ее доля составляет до 80% от пула внеклеточных протеиназ, выделяемых этими бактериями в среду [Шарипова с соавт., 2000]. Ген субтилизиноподобной протеиназы клонирован в мультикопийную плазмиду pCS9, его экспрессия изучена в рекомбинантном штамме Bacillus subtilis [Sharipova et al., 2007]. Показано, что накопление фермента Bacillus intermedins в культуральной жидкости рекомбинантного штамма достигает максимального значения на 28 (ранняя протеиназа) и 48 ч (поздняя протеиназа) роста. Установлено, что в процессе роста культуры происходит смена механизмов регуляции экспрессии гена протеиназы.

Целью работы явились выделение и характеристика субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedins, секретируемой рекомбинантным штаммом Bacillus snbtilis в ранней и поздней стационарной фазе роста.

Основные задачи исследования:

1. Подбор условий культивирования для выделения протеиназы Bacillus intermedins из рекомбинантного штамма Bacillus subtilis на ранней (ранняя протеиназа) и поздней (поздняя протеиназа) стационарной фазе роста культуры.

2. Очистка субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedins, секретируемой рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis на ранней и поздней стационарной фазе роста культуры.

3. MALDI-TOF и BLAST анализ аминокислотных последовательностей протеиназы раннего и позднего стационара.

4. Исследование физико-химических свойств субтилизиноподобной протеиназы, соответствующей разным стадиям роста рекомбинантного штамма.

5. Выяснение роли ионов кальция в стабилизации структуры протеиназы, соответствующей разным стадиям культивирования рекомбинантных бактерий.

Научная новизна. Впервые выделена и охарактеризована внеклеточная субтилизиноподобная протеиназа В. intermedins, соответствующая разным стадиям роста рекомбинантного штамма В. subtilis. Впервые проведена сравнительная характеристика свойств протеиназы, секретируемой бациллами в начале и конце стационарной фазы. Установлено, что, обладая идентичной аминокислотной последовательностью, ферменты различаются по каталитическим свойствам. Получены приоритетные данные о способности протеиназы, секретируемой в позднюю стационарную фазу, образовывать димеры. Предполагается, что ведущая роль в формировании димеров принадлежит ионам кальция в кальций-связывающих центрах на поверхности белковой глобулы. На основании аминокислотной последовательности протеиназы предложена модель третичной структуры.

Практическая значимость результатов: Подобраны условия культивирования бактерий для эффективной продукции фермента, секретируемого на ранней и поздней стационарной фазе роста и разработаны условия очистки этих ферментов. Результаты могут быть использованы при разработке стратегии синтеза ферментов промышленными штаммами бактерий. Получение гомогенных препаратов ферментов увеличивает арсенал белков, используемых в научных исследованиях и в практических целях. Данные по стабильности белка открывают возможность применения протеиназы AprBi в качестве добавок к различным детергентам, фармацевтике и в генноинженерных исследованиях.

Связь работы с научными программами: Работа выполнялась в соответствии с планом НИР КГУ (№ гос. регистрации 01.02.00 104 982 «Биосинтез, биогенез, классификация, физиологические функции новых микробных ферментов и возможные области их практического применения»). Исследования поддержаны грантами РФФИ 05−04−48 182-а, Академии наук РТ № 03−3.5−20 и Аналитической Ведомственной Целевой Федеральной Программы РНП 2.11.1005. Положения, выносимые на защиту.

1. Выделена и охарактеризована субтилизиноподобная сериновая протеиназа Bacillus intermedius рекомбинантного штамма Bacillus subtilis, секретируемая в раннюю и позднюю стационарную фазу роста.

2. Ранняя и поздняя протеиназы рекомбинантного штамма Bacillus subtilis имеют идентичную аминокислотную последовательность и близкие энзиматические свойства, но отличаются по каталитическим характеристикам.

3. Поздняя протеиназа Bacillus subtilis, в отличие от ранней, образует димеры, в формировании которых участвуют ионы кальция. Апробация работы: Матерйалы диссертации доложены и обсуждены на международных, всероссийских и региональных конференциях: «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2005, 2006, 2007), школах-конференциях молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2005, 2006), Всероссийской научной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2004), Всероссийской научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005), V республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Наука. Инновации. Бизнес» (Казань, 2005), Международной конференции аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», (Москва, 2005, 2006, 2007), Материалах XLIII международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» секция биология (Новосибирск, 2005), BGRS-2006: Proceedings of the fifth international conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (Novosibirsk, 2006), VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 19 научных работ.

Структура и объем диссертации

: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований и обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, включает 10 таблиц, 21 рисунок. Библиография содержит 293 наименований российских и зарубежных авторов.

выводы.

1. Подобран состав питательной среды, обеспечивающий высокий уровень активности ранней (28 ч роста) и поздней (48 ч роста) протеиназы Bacillus intermedius в культуральной жидкости рекомбинантного штамма Bacillus subtilis.

2. Из культуральной жидкости рекомбинантного штамма Bacillus subtilis выделена субтилизиноподобная протеиназа Bacillus intermedius, соответствующая разным часам роста, со степенью очистки, составляющей 711 для ранней и 745 — для поздней протеиназы и выходом по активности 9,6 и 16,4%, соответственно.

3. Методом масс-спектрометрии установлено, что ранняя и поздняя протеиназа AprBi имеют идентичную последовательность аминокислот, их Nи Сконцы совпадают.

4. Выявлены различия в каталитических свойствах протеиназы AprBi, секретируемой в раннюю и позднюю стационарную фазу роста.

5. Установлено, что поздний фермент образует димеры, в формировании которых участвуют ионы кальция.

Заключение

.

Субтилизиноподобные сериновые протеазы, обнаруженные у животных и растений, архей и грибов, бактерий и вирусов, представляют собой интереснейший объект как с точки зрения физиологии, так и промышленного применения. Потребность в этих белках у прои эукариот, а также широкий спектр, выполняемых ими функций, характеризуют субтилизиноподобные протеазы как эволюционно древние ферменты. В течение миллиардов лет физиологическая и молекулярная адаптация прокариотических организмов обеспечили им возможность выживания в любой экологической нише, даже там, где никакие другие формы жизни не могли бы существовать. Определенную роль в этом событии сыграли субтилазы. Участие в патологических состояниях, процессах образования спор и других покоящихся форм могут сделать субтилизиноподобные ферменты незаменимым помощником в решении многих проблем современной биологии и медицины. Обладая разнообразием свойств: широкой субстратной специфичностью, стабильностью при высоких и низких температурах, высокой каталитической активностью в щелочных средах, субтилазы представляют собой основу для создания биотехнологических производств. Микробы — наиболее предпочтительный источник этих ферментов ввиду их быстрого роста, методов культивирования и возможности создания генно-инженерных штаммов и белков. Открытие за последние десятилетия огромного количества прокариотических субтилаз, изучение механизмов экспрессии генов и биохимических свойств этих протеаз, тем не менее, оставляют немало вопросов относительно физиологической роли этих ферментов. Именно поэтому, изучение структурных особенностей субтилизиноподобных протеиназ и механизмов их участия в различных метаболических процессах, включая клеточный ответ в период стационарной фазы, необходимо для понимания функционирования этих белков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 1. Объект исследования и условия его культивирования.

Объектом исследования являлся рекомбинантный штамм Bacillus subtilis. Он получен путем трансформации плазмиды pCS9 в протеазо-дефицитный штамм В. subtilis AJ73, из хромосомы которого делегированы гены внеклеточных протеиназ (штамм любезно предоставлен проф. Ю Йомантасом). Мультикопийная плазмида pCS9, сконструированная на основе вектора рСВ22, несет полный ген субтилизиноподобной сериновой протеиназы В. intermedius под собственным промотором (плазмида pCS9 получена в ИМГ, РАН и предоставлена для работы проф. С.В. Костровым).

Pstl (6) НтШ (14).

Ndel (231).

Hindlll (12 102).

Ват HI (11 276).

Hindlll (11 223).

REP 19 035.

Ndel (10 211) J aprBi pCS9.

13 666 bp.

Nco I (9970) Bsp 1191(9583) promoter aprBi.

7249(d1) coRV (8281).

Hindlll (7796).

EcoRV (7231) coRI (2649).

Eel 13 611 (2657) Kpn I (2665) Sma 1(2667).

EcoRl (3024) Hindlll (3055).

Hindlll (4859) ?coRV (5017).

EcoRI (6258).

Sal I (6504).

Рис. 1. Плазмида pCS9 Трансформацию клеток В. subtilis плазмидной ДНК проводили по методу [Anagnostopolous et al., 1961]. Рекомбинатный штамм В. subtilis культивировали в колбах объемом 100 мл при соотношении объема среды к объему колбы 1:5 на качалке 200 об/мин при 30 °C. Для культивирования клеток В. subtilis AJ73 (pCS9) были использованы среды следующего состава о): бактериологический пептон («Sigma») — 2, СаС12−2Н20 — 0,06,.

MgS04−7H20 — 0,05, NaCl — 0,3, NH4CI — 0,02, MnS04 — 0,01, Na2HP04 — 0,035, pH — 8,5 (пептон-содержащая среда) — L-бульон (среда LB, Лурия-Бертани): триптон -10 г/лдрожжевой экстракт -5 г/лNaCl -5 г/лрН 8,5 [Sambrook et al., 1989]. Для получения максимальной продукции субтилизиноподобной протеиназы использовали колламин в концентрации 1, 2% в качестве добавки к среде LB и пептон-содержащей среде. Также производили замену пептона («Sigma») на ферментативный пептон в концентрациях 10−30 г/л. В среды культивирования непосредственно перед посевом добавляли эритромицин в концентрации 20 мкг/мл, так как плазмида pCS9 несет ген устойчивости к данному антибиотику. Посевным материалом служила 18-часовая культура. Среды стерилизовали при 1 атм. Раствор неорганического фосфата стерилизовали при том же давлении и вносили в среды культивирования непосредственно перед посевом.

Контроль за ростом культуры осуществляли, определяя изменение оптической плотности (DonT) культуры. Прирост биомассы определяли нефелометрически на ФЭК-56 ПМ со светофильтром 9 при длине волны 590 нм. За единицу биомассы принимали поглощение в 1-см кювете.

Белок определяли спектрофотометрически (Экспериментальные методы исследования белка и нуклеиновых кислот, 1985), считая, что концентрация белка 1 мг/мл соответствует A2so = 1 оптической единице (опт. ед.) в кювете толщиной 1 см, а также по методу Брэдфорд [Bradford, 1976]. 2. Определение протеолитической активности Определение казеинолитической активности.

Протеолитическую активность определяли, используя в качестве субстрата казеин по методу Каверзневой [Каверзнева, 1971]: Казеин в концентрации 2% растворяли в 0,1 М Трис-HCl буфере, рН 9,0. Смесь из 1 мл казеина и 1мл культуральной жидкости инкубировали 15 мин при 37 °C, затем добавляли 2 мл 5%-ной ТХУ и инкубировали при той же температуре еще 20 мин. Смесь пропускали через фильтр. К 1 мл фильтрата добавляли 5 мл 6%-ной Ыа2СОз и 1 мл реактива Фолина. Смесь ставили на 20 мин в темноту для полного проявления окраски, а затем измеряли оптическую плотность при длине волны 670 нм на ФЭКе. Параллельно ставили контроль на свободный тирозин следующим образом: смешивали 1 мл культуральной жидкости и 2 мл 5%-ной ТХУ и инкубировали 20 мин при 37 °C, после чего добавляли 1 мл 2%-ного казеина и выдерживали еще 15 мин при той же температуре. С фильтратом поступали, как описано выше. Протеолитическую активность рассчитывали по формуле:

ПА = (да, где.

Do-Dk — разность поглощения опытной и контрольной пробы при 670 нм- 28 — коэффициент, учитывающий все разведения в процессе определения активности,.

Р — предварительное разведение ферментного раствора, 15 — время инкубации, мин.

За единицу казеинолитической активности принимали количество фермента, необходимое для образования 1 мкМ тирозина за 1 мин на 1 мл ферментного раствора.

Определение протеолитической активности на азоказеине.

Активность на азоказеине определяли по отщеплению красителя от азоказеина («Sigma», США). Субстратом являлся 1% раствор в 0, 05 М Т-НС1 буфере, рН 8,5. К 200 мл фермента добавляли 400 мкл субстрата. Смесь инкубировали при 37 °C. Реакцию останавливали 5% ТХУ и выдерживали в ледяной бане в течение 5 мин. Далее центрифугировали при 13 000 об/мин в течение 3 мин. Затем к 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл 4Н NaOH и измеряли поглощение при длине волны 410 нм. Расчет проводили по формуле: -2-дс-ЮОО.

A=-iisгде.

30−200.

2 — пересчет на 1 см кювету.

1000 — коэффициент пересчета на 1 мл ферментного раствора 30 — время инкубации, мин х — предварительное разведение.

За единицу активности принимали количество фермента, гидролизующего в данных условиях 1 мкл субстрата за 1 мин.

Определение специфической протеолитической активности.

Специфическую активность субтилизиноподобных протеиназ определяли по расщеплению хромогенного субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNa по методу Люблинской и др. [Люблинская с соавт., 1987]. Реакционная смесь состояла из 500 мкл субстрата (0,5 мг/мл) Z-Ala-Ala-Leu-pNa, растворенного в диметилформамиде, 2 мл 0,05 М Трис-HCl буфера, рН 8,5 и 50 мкл раствора фермента. Смесь инкубировали при 37 °C от 2 до 60 минут до появления соломенно-желтого окрашивания. Реакцию останавливали добавлением 200 мкл 50%-й уксусной кислоты. В контрольную пробу, содержащую 500 мкл субстрата и 200 мкл уксусной кислоты, после инкубации при 37 °C одновременно с опытной пробой добавляли 50 мкл фермента, и измеряли на спектрофотометре SmartSpec Plus (BioRad, USA) оптическую плотность опытной пробы против контрольной при 410 нм в 1 см кювете.

Активность рассчитывали по формуле: где ПА — активность, мкМ/мин на 1 мл ферментного раствораD — поглощение раствора при 410 нмР = 1000 (расчет на 1 мл раствора фермента) — К = 0,37 — коэффициент, учитывающий молярную экстинкцию субстрата;

В — объём пробы фермента в реакционной смесиТ — время инкубации, мин. За единицу активности принимали количество фермента, гидролизующего в условиях эксперимента 1 мкмоль субстрата за 1 мин. Удельную активность выражали в ед/мг белка.

3. Выделение и очистка протеиназы рекомбинантного штамма.

Выделение субтилизиноподобной протеиназы В. intermedins, на разных фазах роста культуры, из 1 л культуральной жидкости В. subtilis проводили с помощью ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе и в системе FPLC на колонке Mono S. В культуральной жидкости рН доводили до 6,3. Культуральную жидкость освобождали от клеток центрифугированием в течение 50 мин при 3000 об/мин на центрифуге К-70 (Janetzki, Польша). Супернатант разбавляли дистиллированной водой в 10 раз и добавляли к КМ-целлюлозе, уравновешенной 0,015 М Na-ацетатным буфером, рН 6,3. Ионообменную хроматографию на КМ-целлюлозе проводили в объеме в течение 35−45 мин, постоянно перемешивая ионообменник. Затем КМ-целлюлозу помещали на колонку, промывали тем же буфером и элюировали белки 0,2 М Na-ацетатным буфером, рН 6,3. В собранных фракциях определяли количество белка и специфическую активность. Фракции с высокой протеолитической активностью объединяли, разбавляли водой в 12 раз и наносили на колонку Mono S 5/5 в системе FPLC «Pharmacia» (Швеция), уравновешенную Na-ацетатным буфером, рН 6,3, содержащим 0,5 мМ СаС12. Элюцию проводили линейным градиентом NaCl (0 — 0,5 М) в том же буфере со скоростью 1 мл/мин. В собранных фракциях определяли специфическую протеолитическую активность и количество белка.

4. Электрофорез в ПААГ Электрофорез в денатурирующих условиях.

Степень чистоты полученных белковых препаратов и их молекулярную массу определяли электрофоретически. Электрофорез проводили в 12,5% ПААГ в присутствии SDS по методу Лаэммли [Laemmli, 1970].

Концентрация акриламида в геле составляла 12,5%, бисакриламида -0,12%. Электродный буфер содержал 20,6 мМ т-НС1 и 0,24 М глицина, рН 8,3 -8,4. В верхний буфер добавляли SDS до концентрации 0,1%. Пробу готовили следующим образом: к раствору белка добавляли равный объем раствора, содержащего 24% глицерина, 4% SDS, 10% меркаптоэтанола и инкубировали 5 мин при 100 °C. Оптимальное количество белка, наносимого на одну дорожку геля, равно 5 мкг. Электрофорез проводили в следующем режиме: первые 30 мин сила тока была равна 20 мА, затем силу тока увеличили до 40 мА. Фиксировали гель в растворе, содержащем 45% этанола и 10% уксусной кислоты в течение часа. Затем гель окрашивали Кумасси ярко-голубым (0,2% Кумасси «Serva», 45% метанола или этанола, 10% уксусной кислоты) в течение 15−20 мин, после чего отмывали в 7% уксусной кислоте и высушивали. В качестве маркеров использовали РНКазу (Биназу) (12,3 кДа), лизоцим (14,4 кДа), РНКазу, А (15,7 кДа), ингибитор трипсина (21,5 кДа), пероксидазу (40 кДа) и БСА (бычий сывороточный альбумин) (66 кДа).

Электрофорез в нашивных условиях.

Электрофорез белков в нативных условиях проводили по методу, описанному на сайте http://wolfson.huji.ac.il/purification/Protocols/PAGEAcidic.html).

Электрофорез белков проводили в кислых условиях, так как изоэлектрическая точка лежит в щелочной области [Balaban et al., 2004]. Концентрация акриламида в геле составляла 10,0%, бисакриламида — 0,8%. Электродный буфер содержал 35 мМ /3-аланин, 14 мМ уксусную кислоту, рН 4,3. Верхний буфер содержал 1,5 М Na-ацетатный буфер, рН 4,3 и 50% глицерин. Пробу готовили следующим образом: к раствору белка добавляли равный объем раствора, содержащего 50% глицерина, 25 мМ Na-ацетатный буфер, рН 6,8 и метиленовый зеленый. Электрофорез проводили в режиме, аналогичном электрофорезу в денатурирующих условиях. В качестве маркеров использовали лизоцим (14,4 кДа), фосфатазу (56 кДа) и гемоглобин (68 кДа).

5. Масс-спектрометрический анализ (MALDI-TOF).

Очищенные белковые фракции, соответствующие разным стадиям роста культуры (28 и 48 ч), анализировали с помощью метода масс-спектрометрии. Растворы протеиназы В. intermedius обрабатывали трипсином по методике, изложенной на сайте (http://www.biochem.unitzh.ch /services/protocol/ ingeldigestion. pdf). Полученные пептиды различной молекулярной массы идентифицировали на масс-спектрометре Vision 2000 TOF («ThermoBioanalysis», Великобритания). Полученные данные обрабатывали с помощью программ Peptide Mass Fingerprint (http://www.matrixscience.com.) и Peptide Mass (http://cn.expasy.org).

6. Аминокислотный анализ.

Аминокислотный состав протеиназ определяли после гидролиза 5,7 Н HCI при 105° в течение 48 часов на аминокислотном анализаторе Hitachi 835 (Япония). Остатки полуцистина и метионина определяли после их окисления надмуравьиной кислотой, триптофан — после гидролиза белка метансульфоновой кислотой в присутствии 0,2%-ного триптамина.

7. Определение субстратной специфичности.

Субстратную специфичность полученных фракций ферментов определяли на синтетических и-нитроанилидных субстратах Glp-'Ala-Ala-Leu-pNa, Glp-Phe-Ala-Ala-pNa, Z-Ala-Ala-Val-pNa, Glp-Phe-Gly-pNa, Z-Ala-Ala-Leu-pNa, Z-Glu-pNa, растворенных в 20%-ном ДМФА в конечной концентрации 2 мг/мл, как описано ранее. Расщепление синтетических олигопептидов проводили в 0,05 М Трис-HCI буфере, рН 8,5 при 37 °C до появления соломенно-желтого окрашивания. Реакцию останавливали добавлением 200 мкл 50%-й уксусной кислоты.

Специфичность протеиназ изучали по действию на В-цепь окисленного инсулина овцы как описано в работе [Ицкович с соавт., 1997]. К растворам субстратов в концентрации 1 мг/мл в 0,025 М Трис-HCI, рН 8,5 с 5 мМ СаС12 добавляли 10 мкл раствора фермента (1 мкг/мл) в том же буфере и инкубировали 4 часа при 37 °C. Высушенные гидролизаты разделяли в режиме FPLC на колонке (4,6×250 мм) Ultrasphere Octyl, используя линейный градиент вода — 70% ацетонитрила в присутствии 0,1% CF3COOH. Элюаты регистрировали при 215 и 280 нм и анализировали на аминокислотном анализаторе Hitachi 835 (Япония) [Leshchinskaya et al., 1997].

8. Влияние ингибиторов на активность субтилизиноподобной протеиназы.

Влияние различных ингибиторов на активность субтилизиноподобной протеиназы изучали с помощью овомукоида, ингибитора из морской анемоны, ингибитора трипсина и о-фенантролина в соотношении фермент: ингибитор 1:10, а также PMSF, DTT, пХМБ, бензамидина, ЭДТА в соотношении 1:1000. Раствор белка инкубировали с ингибитором в течение 1 ч при 37 °C в Трис-HCl буфере, рН 8,5, специфическую протеолитическую активность определяли в отношении хромогенного субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNa, как описано выше.

9. Физико-химические и энзиматические свойства субтилизиноподобной протеиназы рН-оптимум и рН-стабильность.

Для определения рН-оптимума активность ферментов по отношению к Z-Ala-Ala-Leu-pNa определяли в 0,1 М универсальном буфере и 0,05 М Трис-HCl буфере. 0,1 М универсальный буфер содержал 0,04 М растворы СНзСООН, Н3Р04 и Н3ВО3, рН доводили 0,2 М NaOH. Для определения рН-стабильности проводили инкубацию растворов белков в универсальном буфере в течение 1 ч при 25 °C, далее добавляли раствор Z-Ala-Ala-Leu-pNa в 20%-ном ДМФА и определяли активность при 37 °C, как описано выше. Температурный оптимум и термостабилъностъ.

Для определения температурного оптимума активность ферментов по отношению к субстрату Z-Ala-Ala-Leu-pNa измеряли при температуре от 0 до 65 °C. Для изучения термостабильности растворы ферментов в 0,05 М Трис-HCl буфере, рН 8,5, инкубировали при температурах от 0 до 70 °C в течение 30 мин, затем добавляли раствор Z-Ala-Ala-Leu-pNa в 20%-ном ДМФА и определяли активность при 37 °C, как описано выше. Изучение влияния ионов Са2+ на термооптимум и термостабильность белковых фракций проводили в Трис-HCl буфере, содержащем 5 мМ СаС12, как описано выше. Кинетические константы.

Кт для полученных белковых фракций В. intermedius, секретируемых В. subtilis определяли по гидролизу специфического хромогенного субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNa с использованием двулучевого спектрофотометра Lambda 35 «Perkin Elmer» (США). Расчеты проводили при помощи графика, построенного в координатах Лайнуивера-Берка в программной среде «Excel». Каталитическую константу &-кат рассчитывали по формуле:кат — Vmax/[E] ¦> где [Е] - концентрация фермента. Влияние ионов металлов на активность субтилизиноподобной протеиназы.

Для изучения влияния ионов двухвалентных металлов на активность субтилизиноподобной протеиназы растворы ферментов инкубировали в 0,05 М Трис-HCl буфере, рН 8,5, содержащем Mn2+, Ni2+, Cu2+, Со2+, Са2+ и Mg2+ в концентрации от 5 до 20 мМ в течение 30 мин при 37 °C. Далее добавляли раствор Z-Ala-Ala-Leu-pNa в 20%-ном ДМФА и определяли активность при 37 °C, как описано выше. За 100% принята удельная активность фермента без внесения металлов.

Влияние Н2О2 на активность субтилизиноподобной протеиназы.

Для изучения влияния Н202 на активность препаратов фермента, соответствующего разным фазам роста, проводили прединкубацию растворов фермента в 0,05 М Трис-НС1-буфере, содержащем 10, 20 и 40 мМ Н202 в течение 1 и 24 ч при 37 °C, далее добавляли раствор Z-Ala-Ala-Leu-pNa в 20%-ном ДМФА и определяли активность, как описано выше. Влияние С2Н5ОН на активность субтилизиноподобной протеиназы.

Изучение влияния этанола на активность протеиназ проводили в 0,05 М Трис-НС1-буфере, содержащем 5, 10, 25 и 50% С2Н5ОН. После прединкубации ферментных растворов с растворами этанола, активность определяли, как описано выше.

Влияние NaCl на активность субтилизиноподобной протеиназы.

Для изучения влияния различных концентраций NaCl на стабильность препаратов протеиназы проводили прединкубацию ферментативных растворов в 0,05 М Трис-НС1-буфере, содержащем 0,5, 1, 2, 5, 10, 15 и 20% NaCl, в течение 1 и 24 ч при 37 °C, далее добавляли раствор субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNa в 20%-ном ДМФА и определяли активность, как описано выше.

10. Спектральный анализ фракций субтилизиноподобной протеиназы.

Спектры гомогенных препаратов белка снимали на двулучевом спектрофотометре Lambda 35 «Perkin Elmer» (США) в диапазоне от 200 до 500 нм.

11. Гель-фильтрация протеиназы.

Гель-фильтрацию ферментных растворов проводили на колонке с сефадексом G-100 («Pharmacia», Швеция). В качестве буфера использовали 50 мМ Трис-HCl, содержащий 120 мМ КС1, рН 8,5. В качестве маркеров использовали лизоцим (14,4 кДа), ингибитор трипсина (21,5 кДа), пероксидазу (40 кДа) и БСА (66 кДа). Свободный объем колонки детектировали с помощью голубого декстрана.

Диализ белковых растворов для удаления ионов Са из ферментных растворов проводили против 50 мМ Трис-HCl буфера, содержащего 1% ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), рН 8,5.

12. Биоинформационный анализ.

Выравнивание аминокислотной последовательности протеиназы AprBi с последовательностями других субтилизиноподобных протеиназ, а также построение филогенетического древа фермента проведено с помощью программы BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Процентное соотношение аминокислот в последовательности субтилизиноподобной протеиназы В. intermedius, а также Индекс нестабильности, алифатический индекс и GRAVY индекс рассчитаны с помощью программы ProtParam (www.expasy.org) [Ikai, 1980; Kyte, Doolittle, 1982; Guruprasad et al., 1990].

Модель третичной структуры построена на основании аминокислотной последовательности протеиназы AprBi в программах SwissProt (www.au.expasy.org/spdbv) и YASARA (www. yasara.org). 13. Математическая обработка результатов.

Результаты многофакторных экспериментов обрабатывали с помощью программы STATGRAPHICS для персональных компьютеров, позволяющей выводить на экран уравнение регрессии, степень достоверности модели и графические изображения поверхности отклика.

Математическую обработку результатов проводили с помощью программы Microsoft Excel путем расчета среднеквадратичного отклонения (а). Результаты считали достоверными при среднеквадратичном отклонении а< 10%. В качестве критерия достоверности получаемых разностей использовали критерий Стьюдента, принимая Р<0.05 за достоверный уровень значимости.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Подбор питательной среды для эффективной продукции протеиназы B. intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом В. subtilis.

После трансформации плазмиды pCS9, несущей ген сериновой протеиназы В. intermedius в протеазо-дефицитный штамм В. subtilis AJ73 изучали экспрессию гена в рекомбинантном штамме. Накопление протеиназы В. intermedius (протеиназы AprBi) в культуральной жидкости рекомбинантного штамма начинается в фазе замедления роста, достигает максимального значения на 28 и 48 ч роста и зависит от состава питательной среды. Проводили подбор питательной среды для эффективной продукции протеиназы, соответствующей этим часам роста. Для этого варьировали концентрации основных источников азота — пептона и триптона в составе среды культивирования. Наряду с ними использовали колламин в качестве более дешевой замены пептона и триптона в условиях масштабирования процесса очистки. Как видно из таблицы 1, максимальный уровень активности субтилизиноподобной протеиназы в культуральной жидкости отмечен для пептон-содержащей среды и среды LB без внесения дополнительных компонентов и замен одного источника азота на другой: пептона и триптона — на колламин, бактериологического пептона — на ферментативный пептон. Активность фермента в пептон-содержащей среде составила для ранней протеиназы — 0,54 ед/мг, для поздней протеиназы — 1,24 ед/мг, в среде LB — 0,51 и 1,17 ед/мг соответственно. Замена пептона на колламин, а также внесение последнего в качестве дополнительного источника питания снижали активность протеиназы, более чем в 2 раза (0,230,35 ед/мг — для ранней протеиназы, 0,5−0,64 ед/мг — для поздней протеиназы). Использование ферментативного пептона в концентрациях 1030 г/л вместо бактериологического пептона приводило к снижению активности субтилизиноподобной протеиназы, но в меньшей степени, чем при использовании колламина (0,38−0,42 ед/мг — для ранней протеиназы, 0,70,76 ед/мг — для поздней протеиназы). Таким образом, применение колламина и ферментативного пептона в составе питательной среды нецелесообразно. Поэтому для очистки субтилизиноподобной протеиназы из культуральной жидкости рекомбинантного штамма использовали среду LB и пептон-содержащую среду.

Показать весь текст

Список литературы

  1. Е.О. Гетерогенность популяции Escherichia coli в процессе индуцированного автолиза / Е. О. Акайзин, С. Е. Воскун, Л. А. Панова, С. Г. Смирнов // Микробиология. — 1990. — Т. 59. — С. 283−288.
  2. Биосинтез микроорганизмами нуклеаз и протеаз // Под ред. Имшенецкого А. А. М: Наука, 1979. — С. 125−148.
  3. Е.Л. Другое состояние неспорулирующих бактерий / Е. Л. Головлев // Микробиология. 1998. — Т. 67. — № 6. — С. 725−735.
  4. Э.А. Цистеиновые протеиназы при неопластической трансформации / Э. А. Дилакян // Материалы конференции «Структура и функции протеолитических ферментов» / Вопросы медицинской химии.- 2000. № 5. / http://www.medi.ru.
  5. В.А. Влияние аминокислот как единственного источника азота на биосинтез экзопротеаз Aspergillus candidus / В. А. Иваница, Н. С. Егоров, М.А. Аль-Нури // Микробиология. 1978. — Т. 74. — № 3. — С. 424−429.
  6. О.Н. Роль бактериальных ауторегуляторов роста группы алкилоксибензолов в ответе стафилококков на стрессовые воздействия /
  7. Н. Ильинская, А. И. Колпаков, М.А. М. А. Шмидт, Е. В. Дорошенко, А. Л. Мулюкин, Г. И. Эль-Регистан // Микробиология. 2002. — Т. 71. — № 1.-С. 23−29.
  8. Л.А. р-нитроанилиды пироглутамилпептидов -хромогенных субстратов сериновых протеиназ / Л. А. Люблинская, Т. Л. Воюшина, В. М. Степанов // Биоорганическая химия. 1987. — Т. 13. — № 6.-С. 748−753.
  9. Н.И. Эволюция протеолитических ферментов / Н. И. Немова, Л. А. Бондарева, Е. И. Кяйвяряйнен // VI Симпозиум «Химияпротеолитических ферментов». Тезисы докладов и стендовых сообщений. Москва, 2007. — С. 5.
  10. Т.М. Внеклеточная протеаза Bacillus alvei 5−724 / Т. М. Новикова, С. Н. Выборных, Н. С. Егоров // Прикладная биохимия и микробиология. 1986. — Т. 22. — № 6. — С. 772−777.
  11. Т.В. Энергозависимый внутриклеточный протеолиз // Материалы конференции «Структура и функции протеолитических ферментов» / Т. В. Ротанова // Вопросы медицинской химии. 2001. — № 1. / http://www.medi.ru.
  12. Г. Н. Новые подсемейства субтилизинов / Г. Н. Руденская // Биоорган, химия. 1994. — Т. 20. — № 5. — С. 475−484.
  13. М.Е. Особенности роста и продукции внеклеточных протеиназ Lactobacillusplantarum ИМ-9/138 / М. Е. Сафонова, Н. И. Астапович, И. А. Буряко // Микробиология. 1999. — Т.68. — № 4. — С. 396−403.
  14. Н.И. Матриксные металлопротеиназы: регуляция активности и роль в процессе онкогенеза // Материалы конференции «Структура и функции протеолитических ферментов» / Вопросы медицинской химии.- 2000. № 5. / http://www.medi.ru.
  15. В.М. Сериновая протеиназа из Thermoactinomyces vulgaris INMI-4a / В. М. Степанов, Г. Н. Руденская, Н. Г. Нестерова, Т. И. Куприянова, Ю. М. Хохлова, И. А. Усайте, Л. Г. Логинова, Е. А. Тимохина //Биохимия.- 1980. -Т.45.-№ 10.-С. 1871−1880.
  16. Н.В. Тиолзависимая сериновая протеиназа Streptomyces thermovulgaris / Н. В. Хайдарова, Г. Н. Руденская, Л. Р. Ревина, В.М.
  17. , Н.С. Егоров // Биохимия. 1990. — Т. 55. — № 6. — С. 11 101 118.
  18. К. Бациллы. Генетика и биотехнология. / К. Харвуд // М.: Мир, 1992. С.143−163.
  19. Г. Г., Тиолозависимые сериновые протеиназы / Г. Г. Честухина, А. С. Епремян А.С., Гайда А. В. // Биоорганическая химия. -1982. Т. 8. — № 12. — С. 1649−1658.
  20. М.Р. Локализация протеолитических ферментов в клетках Bacillus intermedius / М. Р. Шарипова, Е. В. Шакиров, Н. П. Балабан, Л. А. Габдрахманова, М. А. Шилова, Г. Н. Руденская, И. Б. Лещинская // Микробиология. 2000. — Т. 69. — № 5. — С. 660−667.
  21. М.Р. Гидролитические ферменты и спорообразование у Bacillus intermedius / М. Р. Шарипова, Н. П. Балабан, Л. А. Габдрахманова, М. А. Шилова, Ю. М. Кадырова, Г. Н. Руденская, И. Б. Лещинская // Микробиология. 2002. — Т. 71. — № 4. — С. 494−499.
  22. Aizenman E. An Escherichia coli chromosomal «addiction module» regulated by 3', 5'-bispyrophosphate: a model for programmed bacterial cell death / E. Aizenman, H. Engelberg-Kulka, G. Glaser // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1996.-V. 93.-P. 6059−6063.
  23. Altschul S.F. Basic local alignment search tool / S.F. Altschul, W. Gish, W. Miller, E.W. Myers, D.J. Lipman // J. Mol. Biol. 1990. — V. 215. — P. 403 410.
  24. Amann R.I. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. / R.I. Amann, W. Ludwig, K.H. Schleifer // Microbiol. Rev. 1995. — V. 59. — P. 143−169.
  25. Anagnostopolous C. Requirements for transformation in Bacillus subtilis / C. Anagnostopolous, J. Spizizen // J. Bacteriol. 1961. — V. 81. — P. 741−746.
  26. Aoyama M. Soybean-milk-coagulating activity of Bacillus pumilus derives from a serine proteinase / M. Aoyama, M. Yasuda, K. Nakachi, N. Kobamoto, H. Oku, F. Kato // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. — V. 53. — P. 390 395.
  27. Arima K. Isolation and characterization of a serine protease from the sprouts of Pleioblastus hindsii / K. Arima, T. Uchikoba, H. Yonezawa, M. Shimada, M. Kaneda // Nakai Phytochemistry. 2000. — V. 54. — № 6. — P. 559−565.
  28. Агтоп A. Consurf: An algorithmic tool for the identification of functional regions in proteins by surface mapping of phylogenetic information / A. Armon, D. Graur, N. Ben-Tal // J. Mol. Biol. 2001. — V. 307. — P. 447−463.
  29. Arnorsdottir J. Crystal structure of a subtilisin-like proteinase from a psychrotrophic Vibrio species revals structural aspects for cold adaptation / J. Arnorsdottir, M.M. Kristjansson, R. Ficner // FEBS J. 2005. — V. 272. — P. 832−845.
  30. Aronson A.J. Regulation of extracellular protease production in Bacillus cereus T. Characterization of mutants producing altered amounts of protease / A.J. Aronson, N. Angelo, S.C. Holt // J. Bacteriol. 1971. — V. 106. — P. 1016−1017.
  31. Asif-Ullaha M. Purification and characterization of a serine protease from Cucumis trigonus Roxburghi / M. Asif-Ullaha, K.-S. Kimb, Yu Y. Gyu // Phytochemistry. 2006. — V. 67. — № 9. — P. 870−875.
  32. Bagga S. Reconstructing the diversification of subtilisins in the pathogenic fungus Metarhizium anisopliae / S. Bagga, G. Hu, S.E. Screen, RJ.S. Leger // Gene.-2004.-V. 324.-P. 159−169.
  33. Baker D. Protease pro region required for folding is a potent inhibitor of the mature enzyme / D. Baker, J.L. Silen, D.A. Agard // Proteins: Struct. Funct. Genet. 1992. — V. 12. — P. 339−344.
  34. Barrett A.J. Proteolytic enzymes: serine and cystein peptidases / A.J. Barret // Methods Enzymol. 1994. — V. 244. — P. 1−15.
  35. Barett A.J. Proteolytic enzymes: aspartic and metallopeptidases / A.J. Barret // Methods Enzymol. 1995. — V. 248. — P. 183−196.
  36. Barrett A.J. Perspectives in biochemistry and biophysics. Familes and clans of serine peptidases / A.J. Barret, N.D. Rawlings // Arch. Biochem. Biophys. -1995. V. 318. — № 2. — P. 247−250.
  37. Barros R.J. Enhancement of immobilized protease catalyzed dipeptide synthesis by the presence of insoluble protonated nucleophile / R.J. Barros, Wehtje E., P. Adlercreutz // Enzyme Microb. Technol. 1999. — V. 24. — P. 480−488.
  38. Beg Q.K. De-repression and subsequent induction of protease synthesis by Bacillus mojavensis under fed-batch operations / Q.K. Beg, R.K. Saxena, R. Gupta // Process Biochem. 2002. — V. 37. — P. 1103−1109.
  39. Beg K.Q. Purification and characterization of an oxidation-stable, thiol-dependent serine alkaline protease from Bacillus mojavensis / Q.K. Beg, R. Gupta // Enzyme Microb. Technol. 2003. — V. 32. — P. 294−304.
  40. Berger D. A subtilisin-like serine protease involved in the regulation of stomatal density and distribution in Arabidopsis thaliana / D. Berger, T. Altmann // Genes Dev. 2000. — V. 14. — P. 1119−1131.
  41. Bergmann M. The role of specificity in the enzymic synthesis of proteins: synthesis with intracellular enzymes / M. Bergmann, H. Frankel-Conrat // J. Biol. Chem. 1937. — V. 119. — P. 707−720.
  42. Betzel C. Three-dimensional structure of proteinase К at 0.15-nm resolution / C. Betzel, G.P. Pal, W. Saenger // Biochemistry. 1988. — V. 27. — P. 155 171.
  43. Blundell T.L. Comparisons of the sequences, 3-D structures and mechanisms of pepsin-like and retroviral aspartic proteinases / T.L. Blundell, J.B. Cooper, A. Sali, Z. Zhu. // Adv. Exp. Med. Biol. 1991. — V. 306. — P.443−453.
  44. Bode W. Natural protein proteinase inhibitors and their interaction with proteinases / W. Bode, R. Huber // Eur. J. Biochem. 1992. — V. 204. — P. 433−451.
  45. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford // Anal Biochem. 1976. — V. 72. — P. 248−254.
  46. Bromme D. Substrate specificity of thermitase, a thermostable serine proteinase from Thermoactinomyces vulgaris / D. Bromme, R. Kleine // Curr. Microbiol. 1984.-V. 11.-P. 93−100.
  47. Brenner S. The molecular evolution of genes and proteins: a tale of two serines / S. Brenner // Nature. 1988. — V. 334. — P. 528−530.
  48. Burlini N. A heat stable serine proteinase from the extreme thermophilic archaebacterium Sulfolobus solfataricus / N. Burlini, P. Magnati, A. Villa, F. Macchi, P. Tortora, A. Guerritore // Biochem. Biophys. Acta. 1992. — V. 1122.-P. 283−292.
  49. Chan Ch.-K. Cytomegalovirus assemblin (pUL80a): Cleavage at internal site not essential for virus growth- Proteinase absent from virions / Ch.-K. Chan, E.J. Brignole, and W. Gibson // J. Virol. 2002. — V. 76. — № 17. — P. 86 678 674.
  50. Cheng Y.E. Alteration of sporecoat processing and protein turnover in Bacillus cereus mutants with defective postexponential intracellular protease / Y.E. Cheng, A.I. Aronson. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1977. — V. 74. -P. 1254−1258.
  51. Clapes P. Peptide bond formation by the industrial protease, neutrase, in organic media / P. Clapes, E. Pera, J.L. Torres // Biotechnol. Lett. 1997. -V. 19.-P. 1023−1026.
  52. Czapinska H. Structural and energetic determinants of the SI-site specificity in serine proteases / H. Czapinska, J. Otlewski // Eur. J. Biochem. 1999. -V. 260. -№ 3.- P. 571−595.
  53. Dalev P.G. Utilization of waste feathers from poultry slaughter for production of a protein concentrate / P.G. Dalev // Bioresour. Technol. 1994. — V. 48. -P. 265−267.
  54. Dancer B.N. Production and possible function of serine protease during sporulation of Bacillus subtilis / B.N. Dancer, J. Mandelstam // J. Bacterid. -1975.-V. 121.-P. 406−410.
  55. Durham D.D. Novel alkaline and heat-stable serine proteases from alkalophilic Bacillus sp. Strain 6638 / D.D. Durham, D. Stewart, E.J. Stellawg // J. Bacteriol. 1987. — V. 169. — P. 2762−2768.
  56. Durham D.R. The Elastolytic properties of subtilisin GX from alkalophilic Bacillus sp. strain 6644 provides a means of differentiation from other subtilisins / D.D. Durham // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. — V. 194.-№ 3.-P. 1365−1370.
  57. Eder J. Folding of subtilisin BPN': role of the pro-sequence / J. Eder, M. Rheinnecker, A.R. Fersht // Mol. Biology. 1993. — V. 233. — P. 293−304.
  58. Errington J. Bacillus subtilis sporulation: regulation of gene expressionand control of morphogenesia / J. Errington // Microbiol. Rev. 1993. — V. 57. -P. 1−33.
  59. Esposito R.E. The molecular biology of the yeast Saccharomyces. Life cycle and inheritance. In J.N. Strathern, E.W. Jones, J.R. Broach (ed.) / R.E. Esposito, S. Klapholz // NY.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1981. P. 211−287.
  60. Exterkate F.A. Role of calcium in activity and stability of the Lactococcus lactis cell envelope proteinase: applied and environmental / F.A. Exterkate, A.C. Alting // Microbiology. 1999. — V. 65. — № 4. — P. 1390−1396.
  61. Enzyme Nomenclature / N.Y.: Academ. Press. 1984. — 862 P.
  62. Faraco V. A new subfamily of fungal subtilases: structural and functional analysis of a Pleurotus ostreatus member / V. Faraco, G. Palmieri, G. Festa, M. Monti, G. Sannia, P. Giardina 11 Microbiology. 2005. — V. 151. — P. 457 466.
  63. Fastrez J. Demonstration of the acyl-enzyme mechanism for the hydrolysis of peptides and anilides by chymotrypsin / J. Fastrez, A.R. Fersht // Biochemistry. 1973. — V. 12. — P. 2025−2034.
  64. Feller G. Psychrophilic enzymes: hot topics in cold adaptation / G. Feller, C. Gerday // Nat. Rev. Microbiol. 2003. — V. 1. — P. 200−208.
  65. Freeman S.-A. Characterization of a chelator-resistant proteinase from Thermus strain Rt4A2 / S.-A. Freeman, K. Peek, M. Prescott, R. Daniel // Biochem. J. 1993. — V. 295. — P. 463−469.
  66. Fontanini D. SEP-1 a subtilisin-like serine endopeptidase from germinated seeds of Hordeum vulgare L. / D. Fontanini, B.L. Jones // Planta. — 2002. — V. 215.-№ 6. -P. 885−893.
  67. Fox T. Potent slow-binding inhibition of cathepsin В by its propeptide / T. Fox, E. de Miguel, J.S. Mort, A.C. Storer // Biochemistry. 1992. — V. 31. -P. 12 571−12 576.
  68. Fujiwara N. Purification and properties of the highly thermostable alkaline protease from an alkaliphilic and thermophilic Bacillus sp. / N. Fujiwara, A. Masui, T. Imanaka // J. Biotechnol. 1993. — V. 30. — № 2. — P. 245−256.
  69. Georgieva D. Catalytic efficiencies of alkaline proteinases from microorganisms / D. Georgieva, N. Genov, W. Voelter, C. Betzel // Z. Naturforsch С. 2006. — V. 61. — № 5−6. — P. 445−452.
  70. Gerze A. Partial purification and characterization of protease enzyme from Bacillus subtilis megatherium / A. Gerze, D. Omay, Y. Guvenilir // Biochem. Biotechnol. 2005. — V. 121−124. — P. 335−345.
  71. Giddey K. Closely related dermatophyte species produce different patterns of secreted proteins / K. Giddey, B. Favre, M. Quadroni, M. Monod // FEMS Microbiol Lett. 2007. — V. 267. — № 1. — p. 95−101.
  72. Govind N.S. Protease and carotenogenesis in Blakeslea trispora / N.S. Govind, B. Mehta, M. Sharma, V.V. Modi. // Phytochemistry. 1981. — V. 20.-P. 2483−2485.
  73. Greer J. Comparative modeling methods: Application to the family of mammalian serine proteases / J. Greer // Proteins Struct. Funct. Genet. 1990. -V.73.-P. 317−334.
  74. Gron H. Extensive comparison of the substrate preferences of two subtilisins as determined with peptide substrates which are based on the principle of intramolecular quenching / H. Gron, M. Meldal, K. Breddam // Biochemistry. 1992.-V. 3.-P. 6011−6018.
  75. Gould G.W. Role of an expanded cortex in resistance of bacterial endospores. Spores VI / G.W. Gould, G.I. Dring // Washington D.C. Amer. Soc. Microbiol. 1975. — P. 541−546.
  76. Guinto E.R. Unexpected crucial role of residue 225 in serine proteases / E.R. Guinto, S. Caccia, T. Rose, K. Futterer, G. Waksman, E. Di Cera // Proc. Natl. Acad. Sci. 1999. — V. 96. — № 5. — P. 1852−1857.
  77. Gupta R. Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications / R. Gupta, Q.K. Beg, P. Lorenz // Applied Microbiology and Biotechnology. 2002. — V. 59. — P. 15−32.
  78. Hall M.R.T. Cytomegalovirus assemblin: the amino and carboxyl domains of the proteinase form active enzyme when separately cloned and coexpressed in eukaryotic / M.R.T. Hall, W. Gibson // Cells Journal of Virology. 1996. -V. 70.-№ 8.-P. 5395−5404.
  79. Hamilton J.M.U. Aral2 subtilisin-like protease from Arabidopsis thaliana: purification, substrate specificity and tissue localization / J.M.U. Hamilton,
  80. D.J. Simpson, S.C. Hyman, B.K. Ndimba, A.R. Slabas // Biochem. J. 2003. -V. 370.-P. 57−67.
  81. Han X.Q. Stability of protease Q against autolysis and in sodium dodecyl sulfate and urea solutions / X.Q. Han, S. Damodaran // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. — V. 240. — № 3. — P. 839−843.
  82. Hartley B.S. Proteolytic enzymes / B.S. Hartley // Annu. Rev. Biochem. -1960.-V. 29.-P. 45−72.
  83. Henner DJ. Expression of cloned protease genes in Bacillus subtilis / D.J. Henner, M. Yang, L. Band, J.A. Wells // Proceedings of the 9th International Spore Conference. 1985. — P. 95−103.
  84. Heusipp G. HreP, an in vivo-expressed protease of Yersinia enterocolitica, is a new member of the family of subtilisin/kexin-like proteases / G. Heusipp, G.M. Young, V.L. Miller // J. Bacterid. 2001. — V. 183. — № 12. — P. 35 563 563.
  85. Hibbs M.S. Biochemical and immunological characterization of the secreted forms of human neutrophil gelatinase / M.S. Hibbs, K.A. Hasty, J.M. Seyer, A.H. Kang, C.L. Mainardi // J. Biol. Chem. 1985. — V. 260. — P. 2493−2500.
  86. Hodgson J. The changing bulk catalysis market: recombinant DNA techniques have changed bulk enzyme production dramatically / J. Hodgson // Biotechnology. 1994. — V. 12. — P. 789−790.
  87. Hoffman B. Disruption of the subtilase gene, albinl, in Ophiostoma piliferum / B. Hoffman, C. Breuil // Applied and Environmental Microbiology. 2004. — V. 70. — № 7. — P. 3898−3903.
  88. Hu T.T. Cloning and diversity analysis of microorganism genes from alkalescence soil / T.T. Hu, C.J. Jiang, X. Liang, W.J. Long, B. Wu // Yi Chuan. 2006. — V. 28. — № 10. — P. 1287−93.
  89. Inouye M. Intramolecular chaperone: the role of the pro-peptide in protein Folding / M. Inouye // Enzyme. 1991. — V.45. — P. 314−321.
  90. Isono Y. Enzymic peptide synthesis using a microaqueous highly concentrated amino acid mixture / Y. Isono, M. Nakajima // Process Biochem. -2000.- V. 36.-P. 275−278.
  91. Jacobs M. Cloning, sequencing and expression of subtilisin Carlsberg from Bacillus licheniformis / M. Jacobs, M. Eliasson, M. Uhlen, J.-I. Flock // Nucleic Acids Res. 1985. — V. 13. — P. 8913−8926.
  92. Jacobson J.W. Composition for cleaning drains clogged with deposits containing hairs / J.W. Jacobson, J.L. Glick, K.L. Madello // US Patent. -1985.-4, 540,506.
  93. Jaeger K.-E. Directed evolution and the creation of enantioselective biocatalysis / K.-E. Jaeger, T. Eggert, A. Eipper, M.T. Reetz // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. — V. 55. — P. 519−530.
  94. Jany K.D. Amino acid sequence of proteinase К from the mold Tritirachium album Limber / K.D. Jany, G. Lederer, B. Mayer // FEBS Lett. 1986. — V. 199.-P. 139−144.
  95. Jang J.S. Molecular cloning of a subtilisin J gene from Bacillus stearothermophilus and its expression in Bacillus subtilis / J.S. Jang, D.O. Kang, M.J. Chun, S.M. Byun // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. -V. 184.-№ l.-P. 277−282.
  96. Jin Jang H. A novel subtilisin-like serine protease from Thermoanaerobacter yonseiensis KB-1: its cloning, expression, and biochemical properties / H. Jin Jang, B. Chan Kim, Y. Ryang Pyun, Y. Sam Kim // Extremophiles. 2002. -V. 6.-P. 233−243.
  97. Johansen G.T. The degradation of the B-chain of oxidized insulin by two subtilisins and their succinylated and N-carbamylated derivatives / G.T. Johansen, M. Ottesen, I. Svedsen, J. Wylrandt // C.R. Lab.Carlsberg. 1968. -V. 36.-P. 365−384.
  98. Johnson D.E. Noncaspase proteases in apoptosis / D.E. Johnson // Leukemia. -2000.-V. 14.-P. 1695−1703.
  99. Joo H.S. Optimization of the production of an extracellular alkaline protease from Bacillus horikoshi / H.S. Joo, C.G. Kumar, G.C. Park, K.T. Kim, R.P. Seung, C.S. Chang // Process Biochem. 2002. — V. 38. — P. 155−159.
  100. Joo H.S. Oxidant and SDS-stable alkaline protease from Bacillus clausii 152: production and some properties / H.S. Joo, C.G. Kumar, G.C. Park, S.R. Paik, C.S. Chang // J. Appl. Microbiol. 2003. — V. 95. — P. 267−272.
  101. Jorda L. Local and systemic induction of two defense-related subtilisin-like protease promoters in transgenic Arabidopsis plants. Luciferin induction of PR gene expression / L. Jorda, P. Vera // Plant Physiol. 2000. — V. 124. — № 3.-P. 1049−1058.
  102. Kazan D. Purification and characterization of a serine alkaline protease from Bacillus clausii GMBAE 42 / D. Kazan, A.A. Denizci, M.N.K. Oner, A. Erarslan // J. Indust. Microbiol. Biotechnol. 2005. — V. 32. — № 8. — P. 33 544.
  103. Kim K. Role of proteases in host cell invasion by Toxoplasma gondii and other Apicomplexa / K. Kim // Acta Trop. 2004. — V. 91. — № 1. — P. 69−81.
  104. Kim S.H. Purification and characterization of subtilisin DJ-4 secreted by Bacillus sp. st. DJ-4 screened from Doeng-Jang / S.H. Kim, N.S. Choi // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2000. — V. 64. — № 8. — P. 1722−1725.
  105. Kinal H. A Processing and secretion of a virally encoded antifungal toxin in trans-genic tobacco plants: evidence for a kex2p pathway in plants / H. Kinal, C.-M. Park, J.O. Berry, Y. Koltin, J.A. Bruenn // Plant Cell. 1995. — V. 7. -P. 677−688.
  106. Kise H. Protease-catalyzed synthetic reactions and immobilization-activation of the enzymes in hydrophilic organic solvents / H. Kise, A. Hayakawa, H. Noritomi // J. Biotechnol. 1990. — V. 14. — P. 239−254.
  107. Klenk H.D. Host cell proteases controlling virus pathogenicity / H.D. Klenk, W. Garten // Trends Microbiology. 1994. — V. 2. — P. 393.
  108. Koide Y. Cloning and sequencing of the major intracellular serine protease gene of Bacillus subtilis / Y. Koide, A. Nakamura, T. Uozumi, T. Beppu // J. Bacterid. 1986. — V. 167.-№ 1.-P. 110−116.
  109. Kojima M. Isolation and characterization of a feather-degrading enzyme from Bacillus pseudofirmus FA30−01 / M. Kojima, M. Kanai, M. Tominaga, S. Kitazume, A. Inoue, K. Horikoshi // Extremophiles. 2006. — V. 10. — P. 229−235.
  110. Kraus E. The specificity of proteinase К against oxidized insulin В chain / E. Kraus, H.-H. Kiltz, U.F. Femfert // Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem. 1976. -V. 357.-P. 233−237.
  111. Krem M.M. Molecular markers of serine protease evolution / M.M. Krem, E. Di Cera // EMBO J. 2001. — V. 20. — № 12. — P. 3036−3045.
  112. Krem M.M. Ser214 is crucial for substrate binding to serine proteases / M.M. Krem, S. Prasad, E. Di Cera // J. Biol. Chem. 2002. — V. 277. — № 43. — P. 40 260−40 264.
  113. Kumar C.G. Novel enzyme-based detergents: an Indian perspective / C.G. Kumar, R.K. Malik, M.P. Tiwari // Curr. Sci. 1998. — V. 75. — P. 1312−1318.
  114. Kumar C.G. Purification and characterization of a thermostable alkaline protease from alkalophilic Bacillus pumilus / C.G. Kumar // Letters in Applied Microbiology. 2002. — V. 34. — № 1. — p. 13−17.
  115. Kurotsu Т. Characterization of an intracellular serine protease from sporulating cells of Bacillus brevis / T. Kurotsu, M.A. Marahiel, K.-D. Muller, H. Kleinkauf // J. Bacterid. 1982. — V. 151. — № 3. — P. 1466−1472.
  116. Kyte J. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein / J. Kyte, R.F. Doolittle // J. Mol. Biol. 1982. — V. 157. — P. 105−132.
  117. Laemmli H.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / H.K. Laemmli // Nature. 1970. — V. 227. — P. 680−685.
  118. Landgraf R. Three-dimensional cluster analysis identifies interfaces and functional residue clusters in proteins / R. Landgraf, I. Xenarios, D. Eisenberg //J. Mol. Biol. -2001. -V. 307. P. 1487−1502.
  119. Laplaze L. Characterization of a Casuarina glauca nodule-specific subtilisin-like protease gene, a homolog oiAlnus glutinosa agl2 / L. Laplaze,
  120. A. Ribeiro, C. Franche, E. Duhoux, F. Auguy, D. Bogusz, K. Pawlowski // MPMI. -2000. V. 13.-№ l.-P. 113−117.
  121. Larcher G. A 33 kDa serine proteinase from Scedosporium apiospermum / G. Larcher, B. Cimon, F. Symoens, G. Tronchin, D. Chabasse, J.-P. Bouchara // Biochem. J. 1996. — V. 315. — P. 119−126.
  122. Leduc R. Activation of human furin precursor processing endoprotease occurs by an intramolecular autoproteolytic cleavage / R. Leduc, S.S. Moloy,
  123. B.A. Thorne, G. Thomas // Biological Chemistry. 1992. — V. 267. — P. 14 304−14 308.
  124. Leng W.C. Analysis of secreted proteases of Trichophyton rubrum / W.C. Leng, L.L. Wang, C.D. Wei, J. Yang, Q. Jin // Wei Sheng Wu Xue Bao. -2005. V. 45. — № 4. — P. 601−605.
  125. Leshchinskaya I.B. Glutamyl endopeptidase of Bacillus intermedius, strain 3−19 / I.B. Leshchinskaya, E.V. Shakirov, E.L. Itskovich et al. // FEBS Lett. -1997.-V. 404.-P. 241−244.
  126. Lesk A.M. Conservation and variability in the structures of serine proteinases of the chymotrypsin family / A.M. Lesk, W.D. Fordham // J. Mol. Biol. 1996. — V. 258. — P. 501−537.
  127. Lewis J.C. Dormancy. The bacterial spores / J.C. Lewis // London: Academic Press, 1969. P. 301−352.
  128. Lim H.A. Hydrolysis of polyesters by serine proteases / H.A. Lim, T. Raku, Y. Tokiwa // Biotechnol Lett. 2005. — V. 27. — № 7. — P. 459−64.
  129. Lipkind G.M. A model for the structure of the P domains in the subtilisin-like prohormone convertases / G.M. Lipkind, A. Zhou, D.F. Steiner // Proc. Natl. Acad. Sci. USA Biochemistry. 1998. — V. 95. — P. 7310−7315.
  130. Maeda H. Alkaline-resisitance model of subtilisin ALP I, a novel alkaline subtilisin / H. Maeda, O. Mizutani, Y. Yamagata, Ichishima E., T. Nakajima // J. Biochem. 2001. — V. 129. — P. 675−682.
  131. Markland F.S. Subtilisins: primary structure, chemical and physical properties. In: The Enzymes, vol. 3 / F.S. Markland, E.L. Smith // London: Academic Press, 1971. P. 561−608.
  132. Masui A. Stabilization and rational design of serine protease AprM under highly alkaline and higly temperature conditions / A. Masui, N. Fujiwara, T. Imanaka // Applied and Environmental Microbiology. 1994. — V. 60. — P. 1383−1391.
  133. Maxwell K.N. Overexpression of PCSK9 accelerates the degradation of the LDLR in a post-endoplasmic reticulum compartment / K.N. Maxwell, E.A. Fisher, J.L. Breslow // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. — V. 102. — № 6. -P. 2069−2074.
  134. McCune J.M. Endoproteolytic cleavahe of gpl60 is required for the activation of human immunidificiency virus / J.M. McCune, I.B. Rabin, M.B. Feinberg, M. Lieberman, J.C. Kosek, G.R. Reyes, I.I. Weissman // Cell. -1988.-V. 53.-P. 55−67.
  135. McPhalen C.A. Structural comparison of two serine proteinase-protein inhibitor complexes: Eglin-C-subtilisin Carlsberg and CI-2-subtilisin Novo / C.A. McPhalen, M.N.G. James // Biochemistry. 1988. — V. 27. — P. 65 826 598.
  136. Melander W.C. Salt effect on hydrophobic interactions in precipitation and chromatography of proteins: an interpretation of the lyotropic series / W.C. Melander, C. Horvath // Arch. Biochem. Biophys. Acta. 1977. — V. 183. — P. 200−215.
  137. Menon A.S. Protein substrates activate the ATP-dependent protease La by promoting nucleotide binding and release of bound ADP / A.S. Menon, A.L. Goldberg. // J. Biol. Chem. 1987. — V. 262. — P. 14 929−14 934.
  138. Miyaji T. Purification and molecular characterization of subtilisin-like alkaline protease BPP-A from Bacillus pumilus strain MS-1 / T. Miyaji, Y.
  139. Otta, Т. Nakagawa, Т. Watanabe, Y. Niimura, N. Tomizuka // Lett. Appl. Microbiol. 2006. — V. 42. — № 3. — P. 242−247.
  140. Morihara K. Using proteases in peptide synthesis / K. Morihara // Trends Biotechnol. 1987. -V. 5. — P. 164−170.
  141. Morinaga N. Two distinct cytoxic activities of subtilases cytoxin produced by shiga toxigenic Escherichia coli / N. Morinaga, K. Yahiro, G. Matsuura, M. Watanabe, F. Nomura, J. Moss, M. Noda // Infect. Immun. 2007. — V. 75. -№ 1.-P. 488−496.
  142. Morita Y. Properties of cold-active protease from psychrotrophic Flavobacterium balustinum PI04 / Y. Morita, Q. Hasan, T. Sakaguchi, Y. Murakami, K. Yokoyama, E. Tamiya // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. -V. 50.-P. 669−675.
  143. Mulder F.A. Altered flexibility in the substrate-binding site of related native and engineered high-alkaline Bacillus subtilisins / F.A. Mulder, D. Schipper, R. Bott, R. Boelens // J. Mol. Biol. 1999. — V. 292. — № 1. — P. 111−123.
  144. Nakagawa A. Method for cleaning a contact lens / A. Nakagawa // US Patent.- 1994.-5, 314, 823.
  145. Nakagawa M. Maspin expression and its clinical significance in non-small cell lung cancer / M. Nakagawa, H. Katakura, M. Adachi, К. Takenaka, K. Yanagihara, Y. Otake, H. Wada, F. Tanaka // Ann Surg Oncol. 2006. — V. 13.-№ 11.-P. 1517−1523.
  146. Nakamura T. Nucleotide sequence of the subtilisin NAT gene, aprN, of Bacillus subtilis (natto) / T. Nakamura, Y. Yamagata, E. Ichishima // Bioscience Biotechnology Biochemistry. 1992. — V. 56. — P. 1869−1871.
  147. Nakashima H. Compositional changes in RNA, DNA and proteins for bacterial adaptation to higher and lower temperatures / H. Nakashima, S. Fukuchi, K. Nishikawa // J. Biochem. 2003. — V. 133. — P. 507−513.
  148. Nakayama K. Furin: a mammalian subtilisin/Kex2p-like endoprotease involved in processing of a wide variety of precursor proteins / K. Nakayama // Biochemistry. 1997. — V. 327. — P. 625−635.
  149. Narinx E. Subtilisin from psychrophilic antarctic bacteria: characterization and site-directed mutagenesis of residues possibly involved in the adaptation to cold / E. Narinx, E. Baise, C. Gerday // Protein Eng. 1997. — V. 10. — P. 1271−1279.
  150. North M.J. Comparative biochemistry of the proteinases of eukaryotic microorganisms / M.J. North // Microbiol. Rev. 1982. — V. 46. — P. 308−340.
  151. Ollis D.L. The a/(3 hydrolase fold / D.L. Ollis, E. Cheah, M. Cygler, B. Dijkstra, F. Frolow, S.M. Franken, M. Harel, S.J. Remington, I. Silman, J. Schrag // Protein Eng. 1992. — V. 5. — P. 197−211.
  152. Orhan E. Partial purification and characterization of protease enzyme from Bacillus subtilis and Bacillus cereus / E. Orhan, D. Omay, Y. Guvenilir // Appl. Biochem. Biotechnol. 2005. — V. 121−124. — P. 183−194.
  153. Реек К. Purification and characterization of a thermostable proteinase isolated from Thermus sp. strain Rt41A / K. Peek, R.M. Daniel, C. Monk, L. Parker, T. Coolbear // Eur. J. Biochem. 1992. — V. 207. — P. 1035−1044.
  154. Perea A. Preparation and characterization of whey protein hydrolysates: application in industrial whey bioconversion processes / A. Perea, U. Ugalde, I. Rodriguez, J.L. Serra // Enzyme Microb. Technol. 1993. — V. 15. — P. 418−423.
  155. Perona J.J. Structural basis of substrate specificity in the serine proteases / J.J. Perona, C.S. Craik // Protein Sci. 1995. — V. 4. — P. 337−360.
  156. Phadatare S.U. Evidence for the involvement of serine protease in the conidial discharge of Conidiobolus coronatus / S.U. Phadatare, M.C. Srinivasan, M.V. Deshpande // Arch. Microbiol. 1989. — V. 153. — P. 47−49.
  157. Postemsky C.J. Isolation and characterization of Bacillus megaterium mutants containing decreased levels of spore protease / C.J. Postemsky, S.S. Dignam, P. Setlow // J. Bacterid. 1978. — V. 135. — P. 841−850.1. Л I
  158. Rawlings N.D. Evolutionary families of peptidases / N.D. Rawlings, A.J. Barrett // Biochem. J. 1993. — V. 290. — P. 205−218.
  159. Rawlings N.D. Introduction: clan SB containing the subtilisin family. In A.J. Barrett, N.D. Rawlings, J.F. Woessner (eds), Handbook of Proteolytic Enzymes // San Diego: Academic Press, 1998. P. 284−288.
  160. Rao M.B. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases / M.B. Rao, A.M. Tanksale, M.S. Ghatge, V.V. Deshpande // Microbiology and molecular biology reviews. 1998. — V.62. — № 3. — P.597−635.
  161. Rose Th. Substrate recognition drives the evolution of serine proteases / Th. Rose, E. Di Cera // J.Biol.Chem. 2002. — V. 277. — № 22. — P. 19 243−19 246.
  162. Ruppen M.E. of Intracellular Serine Protease Expression in Bacillus subtilis / M.E. Ruppen, G.L. Van Alstine, L. Band // J. Bacterid. 1988. — V. 170. -№ l.-P. 136−140.
  163. Sadoff H.L. Heat resistance of spore enzymes / H.L. Sadoff // J. Appl. Bacterid. 1970. — V. 33. — P. 130−140.
  164. Saeki K. Novel oxidatively stable subtilisin-like proteases from alkaliphilic Bacillus spp.: enzymatic properties, sequences, and evolutionary relationships / K. Saeki, M. Okuda, Y. Hatada, T. Kobayashi, S. Itu, H. Takami, K.
  165. Siezen R.J. Subtilases: The superfamily of subtilisin-like proteases / R.J. Siezen, J.A. Leunissen // Prot. Sci. 1997. — V. 6. — P. 501−523.
  166. Siezen R.J. Evolution of prokaryotic subtilases: Genome-wide analysis reveals novel subfamilies with different catalytic residues / R.J. Siezen, B. Renckens, J. Boekhorst // Proteins. 2007. — V. 67. — № 3. — P. 681−94.
  167. Silva-Lopez R.E. Leishmania (Leishmania) amazonensis: purification and characterization of a promastigote serine protease / R.E. da Silva-Lopez, S. Giovanni-De-Simone // Experimental Parasitology. 2004. — V. 107. — № 34.-P. 173−182.
  168. Shannon J.D. Amino acid sequence of a Crotalus atrox venom metalloprotease which cleaves type IV collagen and gelatin / J.D. Shannon, E.N. Baramova, J.B. Bjarnason, J.W. Fox // J. Biol. Chem. 1989. — V. 264. -P. 11 575−11 583.
  169. Shinde U. Intramolecular chaperones and protein folding / U. Shinde, M. Inouye / // Trends Biochem. Science. 1993. — V. 18. — P. 442−446.
  170. Schuliger J.W. Purification and characterization of a novel amylolytic enzyme from ES4, a marine hyperthermophilic archaeum / J.W. Schuliger,
  171. H. Brown, J.A. Baross, R.M. Kelly // Mol. Marine Biol. Biotechnol. 1993. -V. 2.-P. 76−87.
  172. So J.E. Protease-catalyzed tripeptide (RGD) synthesis / J.E. So, J.S. Shin, B.G. Kim // Enzyme Microb. Technol. 2000. — V. 26. — P. 108−114.
  173. Stabile M.R. Probing the specificity of the SI binding site of M222 mutants of subtilisin B. lentus with boronic acid inhibitors / M.R. Stabile, W.G. Lai, G. DeSantis, M. Gold, J.B. Jones. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1996. — V. 6. -P. 2501−2506.
  174. Stepanov V.M. A serine proteinase of an archaebacterium Halobacterium mediterranei / V.M. Stepanov, G.N. Rudenskaya, L.P. Revina, Y.B. Gryaznova, E.N. Lysogorskaya, I.Y. Filippova, I.I. Ivanova // Biochem J. -1992.-V. 285.-P. 281−286.
  175. Strausberg S.L. Directed coevolution of stability and catalytic activity in calcium-free subtilisin / S.L. Strausberg, B. Ruan, K.E. Fisher, P.A. Alexander, P.N. Bryan // Biochemistry. 2005. — V. 44. — № 9. — P. 32 723 279.
  176. Strongin A.I. Intercellular serine proteinases from spore-forming bacilli / A.I. Strongin, V.M. Stepanov // Biokhimiia. 1981. — V. 46. — P. 1347−1363.
  177. Su N.-Y. Pen с 1, a novel enzymic allergen protein from Penicillium citrinum. Purification, characterization, cloning and expression / N.-Y. Su,
  178. Suzuki M. A novel member of the subtilisi-like protease family from Streptomyces albogriseolus / M. Suzuki, S. Taguchi, S. Yamada, S. Kojima, K.I. Miura, H. Momose // J. Bacterid. 1997. — V. 179. — P. 430−438.
  179. Taguchi S. Engineering of a cold-adapted protease by sequential random mutagenesis and a screening system / S. Taguchi, A. Ozaki, H. Momose // Appl. Environ. Microbiol. 1998. — V. 64. — P. 492−495.
  180. Taguchi S. The complete amino acid substitutions at position 131 that are positively involved in cold adaptation of subtilisin BPN / S. Taguchi, S. Komada, H. Momose // Appl. Environ. Microbiol. 2002. — V. 66. — № 4. -P. 1410−1415.
  181. Takami H. Degradation of human hair by a thermostable alkaline protease from alkalophilic Bacillus sp. No. AH-101 / H. Takami, S. Nakamura, R. Aono, K. Horikoshi // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1992. — V. 56. — P. 1667−1669.
  182. Teplyakov A.V. Crystal structure of thermitase at 1.4 A resolution / A.V. Teplyakov, I.P. Kuranova, E.H. Harutyunyan, B.K. Vainshtein // J. Mol. Biol. 1990.-V. 214.-P. 261−279.
  183. Tian B. Cloning, expression and deletion of the cuticle-degrading protease BLG4 from nematophagous bacterium Brevibacillus laterosporus G4 / B. Tian, N. Li, L. Lian, J. Liu, J. Yang, K.Q. Zhang // Arch. Microbiol. 2006. -V. 86.-№ 4. -P. 297−305.
  184. Thomas P.G. Tailoring the pH dependence of enzyme catalysis using protein engineering / P.G. Thomas, A.J. Russell, A.R. Fersht // Nature. 1985. — V. 28.-P. 375−376.
  185. Thomas G. Furin at the cutting edge: from protein traffic to embriogenesis and disease / G. Thomas // Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2002. -V. 3.-№ 10.-P. 753−766.
  186. Torsvik V. High diversity in DNA of soil bacteria / V. Torsvik, J. Goksoyr, F.L. Daae // Appl. Environ. Microbiol. 1990. — V. 56. — P. 782−787.
  187. Tsuchiya K. Purification and characterization of a thermostable alkaline protease from alkalophilic Thermoactinomyces sp. HS682 / K. Tsuchiya, Y.
  188. Nakamura, H. Sakashita, Т. Kimura // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1992. -V. 56.-№ 2.-P. 246−250.
  189. Toogood H.S. Daniel Purification and characterization of Ak. l protease, a thermostable subtilisin with a disulphide bond in the substrate-binding cleft / H.S. Toogood, C.A. Smith, E.N. Bake, R.M. Daniel // Biochem. J. 2000. -V. 350.-P. 321−328.
  190. Valbuzzi A. A novel member of the subtilisin-like protease family from Bacillus subtilis / A. Valbuzzi, E. Ferrari, A.M. Albertini // Microbiology. -1999.-V. 145.-P. 3121−3127.
  191. Varela H. Skin unhairing proteases of Bacillus subtilis: production and partial characterization / H. Varela, M.D. Ferrari, L. Belobradjic, A. Vazquez, M.L. Loperena // Biotechnol. Lett. 1997. — V. 19. — P. 755−758.
  192. Van der Laan J.C. Cloning, characterization and multiple chromosomal integration of a Bacillus alkaline protease gene / J.C. Van der Laan, G. Gerritse, L. Mulleners, R. Van der Hoek, W.J. Quax // Appl. Environ. Microbiol. 1991. -V. 57. — P. 901−909.
  193. Vielle C. Hyperthermophilic Enzymes: Sources, Uses, and Molecular Mechanisms for Thermostability / C. Vielle, G.J. Zeikus // Microbiol. Mol. Biol. Rew.-2001.-V. 65.-№ l.-P. 1−43.
  194. Von der Osten T. Protein engineering of subtilisins to improve stability in detergent formulations / T. Von der Osten, S. Branner, S. Hastrup, L.
  195. Hedegaard, M.D. Rasmussen, H.S. Frantzen, S. Carlsen, J.M. Mikkelsen // J. Biotechnol. 1993. — V. 28. — P. 55−68.
  196. Wang L. Prodomain mutations at the subtilisin interface: correlation of binding energy and the rate of catalyzed folding / L. Wang, S. Ruvinov, S. Strausberg, D.T. Gallagher, G.L. Gilliland, P.N. Bryan // Biochemistry. -1995.-V. 34.-P. 15 415−15 420.
  197. Wells J.A. In vivo formation and stability of engineered disulfide bonds in subtilisin / J.A. Wells, D.B. Powers // J. Bid. Chem. 1986. — V. 261. — P. 6564−6570.
  198. Wells J.M. Cloning, sequencing and secretion of Bacillus amyloliquefaciens subtilisin in Bacillus subtilis / J.M. Wells, E. Ferrari, D.J. Henner, D.A. Estell, E.Y. Chen // Nucleic Acids Res. 1983. — V. 11. — P. 7911−7925.
  199. Wintrode P.L. Cold Adaptation of a Mesophilic Subtilisin-like Protease by Laboratory Evolution / P.L. Wintrode, K. Miyazaki, F.H. Arnold // J. Biol. Chem. 2000. — V. 275. — № 41. — P. 31 635−31 640.
  200. Wright C.S. Structure of subtilisin BPN at 2.5 A resolution / C.S. Wright, R.A. Alden, J. Kraut // Nature. 1969. — V. 221. — P. 235−242.
  201. Wong S.S. Chemical crosslinking and the stabilization of proteins and enzymes / S.S. Wong, L.J.C. Wong // Enzyme Microb. Technol. 1992. — V. 14.-P. 866−874.
  202. Wu J. Cloning and analysis of WF146 protease, a novel thermophilic subtilisin-like protease with four inserted surface loops / J. Wu, Y. Bian, B. Tang, X. Chen, P. Shen, Z. Peng // FEMS Microbiology Letters. 2004. — V. 230,-№ 2.-P. 251−258.
  203. Yabuta Y. Folding pathway mediated by an intramolecular chaperone. A Functional peptide chaperone designed using sequence databases / Y. Yabuta, E. Subbian, C. Oiry, U. Shinde // J. Biol. Chem. 2003. — V. 278. — № 17. -P. 15 246−15 251.
  204. Yamagata Y. Molecular cloning and nucleotide sequence of the 90k serine protease gene, hspK, from Bacillus subtilis (natto) No. 16 / Y. Yamagata, R. Abe, Y. Fujita, E. Ichishima // Curr Microbiol. 1995. — V. 31. — № 6. — P. 340−344.
  205. Yoshimoto Т. Cloning and expression of subtilisin amylosacchariticus gene J / T. Yoshimoto, H. Oyama, T. Honda, H. Tone, T. Takeshita, T. Kamiyama, D. Tsuru // Biochem. (Tokyo). 1988. — V. 103. -№ 6. — P. 1060−1065.
  206. Yum D. Y. Purification and characterization of alkaline serine protease from an alkalophilic Streptomyces sp. / D.Y. Yum, H.C. Chung, D.H. Bai, D.H. Oh, J.H. Yu // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1994. — V. 58. — № 3. — P. 470−474.
  207. Zhao H. Directed evolution converts subtilisin E into a functional equivalent of thermitase / H. Zhao, Arnold F.H. // Protein Engeeniring. 1999. — V. 12. -№ l.-P. 47−53.
  208. Zhou R., Wei X., Jiano N., Li H" Dong Y., His K.-L., and Zhao J. Evidence that HetR protein is an unusual serine protease / R. Zhou, X. Wei, N. Jiano, H. Li, Y. Dong, K.-L. His, J. Zhao // Biochemistry. 1988. — V. 95. — P. 49 594 963.
  209. Zhou A., Webb G., Zhu X., and Steiner D.F. Proteolytic Processing in the Secretory Pathway / A. Zhou, G. Webb, X. Zhu, D.F. Steiner // The J. Biol. Chem. 1999. — V. 274. — № 30. — P. 20 745−20 748.
Заполнить форму текущей работой

Сессия? Спокойно!