Помощь в написании студенческих работ
Антистрессовый сервис

Разработка новой технологии получения O-антигена холерного вибриона для производства профилактических препаратов

Диссертация: Разработка новой технологии получения O-антигена холерного вибриона для производства профилактических препаратов
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Схема диализной установки представляет собой сборную конструкцию, состоящую из бачка, в который помещается препарат О-антигенсодержащей фракции, ультрафильтрационного модуля, насоса с магнитным приводом и блоком электропитания для циркуляции препарата, двух ротаметров, фиксирующих показание расхода объёма диализующей воды и прохождения объёма диализуемого препарата. Проточная кювета… Читать ещё >

Разработка новой технологии получения O-антигена холерного вибриона для производства профилактических препаратов (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Содержание

  • ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МАСШТАБИРУЕМОГО КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ И ОЧИСТКИ АНТИГЕННЫХ КОМПОНЕНТОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
    • 1. 1. Методологические основы баромембранного разделения биологических жидкостей
    • 1. 2. Оборудование для концентрирования и очистки антигенных компонентов бактериальных клеток
    • 1. 3. Характеристика О-антигена холерного вибриона и методы его выделения, концентрирования и очистки в производстве профилактических и диагностических препаратов
  • СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
  • ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
  • ГЛАВА 3. АППАРАТУРНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ ПО ВНЕДРЕНИЮ МАСШТАБИРУЕМЫХ УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИОННЫХ МЕТОДОВ В ПРОИЗВОДСТВЕ ХОЛЕРНЫХ ВАКЦИН
    • 3. 1. Разработка стенда для концентрирования культуральной жидкости холерного вибриона с использованием ультрафильтрационных модулей
    • 3. 2. Создание схемы обвязки ультрафильтрационных модулей для проведения процессов диализа и диафильтрации концентратов О-антигена
  • ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ СХЕМЫ ПОЛУЧЕНИЯ О-АНТИГЕНА ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИОННОГО ОБОРУДОВАНИЯ
    • 4. 1. Разработка и оптимизация методических приемов концентрирования культуральной жидкости холерного вибриона для получения полуфабриката О-антигена
    • 4. 2. Использование ультрафильтрационных модулей для ускоренного диализа и диафильтрации концентратов О-антигена
    • 4. 3. Технологичность и экономическая эффективность использования ультрафильтрационных модулей для проведения процессов концентрирования и диализа О-антигена
  • ГЛАВА 5. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ О-АНТИГЕНА И ТАБЛЕТИРОВАННОЙ ХОЛЕРНОЙ ВАКЦИНЫ, ПОЛУЧЕННЫХ С ПОМОЩЬЮ УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИИ И ТРАДИЦИОННОЙ ТЕХНОЛОГИИ
    • 5. 1. Сравнительный анализ физико-химических свойств и серологической активности О-антигенов, полученных различными способами
    • 5. 2. Иммунобиологические свойства бивалентной химической табле-тированной холерной вакцины, полученной с использованием новых технологических приемов

Актуальность темы

В системе противоэпидемических мероприятий по борьбе с холерой большое значение придаётся профилактической вакцинации. В связи со значительными проявлениями этого заболевания в мире в последние годы, особенно в развивающихся странах, ВОЗ настоятельно рекомендует разработку, производство и использование вакцинных препаратов орального применения [182]. В России разработана, зарегистрирована и выпускается оральная химическая бивалентная таблетированная холерная вакцина, которая в 2001 году Приказом Минздрава России (№ 229 от 27.06.2001) включена в Национальный календарь профилактических прививок по эпидемическим показаниям, предусматривающим проведение вакцинации у лиц, выезжающих в неблагополучные по холере страны, и населения приграничных районов России в случае возникновения неблагоприятной по холере обстановке на сопредельной территории. Разработана и запатентована таблетированная вакцина против 0139 сероварианта холерного вибриона [13]. Таблетированная холерная вакцина разработана и производится в РосНИПЧИ «Микроб» с использованием методических подходов и оборудования, относящихся к 70-м годам XX столетия. Современный уровень биотехнологического производства препаратов, вводимых людям, требует использования и современных методических подходов к масштабируемой биосепарации, внедрения более совершенного оборудования и новых материалов, позволяющих с высокой эффективностью получать качественные вакцинные препараты. В связи с этим, проведение научных разработок, направленных на совершенствование технологии производства холерных вакцин и внедрение в практику, настоятельно необходимо.

Среди большого количества методов очистки и концентрирования препаратов: седиментации, флотации, электрокоагуляции, мембранной фильтрации, одно из ведущих мест стали занимать методы с использованием ультрафильтрации на полых волокнах. При ультрафильтрации биомолекул образуются два раствора, один из которых обогащён растворённым веществом, что при соответствующем подборе мембран с определенным пределом исключения молекул позволяет получать в достаточно чистом виде конечный продукт [30]. Основными преимуществами методов, использования модулей с полыми волокнами, являются: возможность развёртывания большой площади фильтрации в сравнительно малом объёме, регенерация волокон обратным током жидкости в модулях, высокая химическая устойчивость волокон, позволяющая стерилизовать их современными дезинфектантами.

При глубинном культивировании холерного вибриона значительное количество О-антигена спонтанно освобождается в окружающую среду. [158], что позволяет получить его без применения химических методов экстракции из клеток [20]. Была показана принципиальная возможность концентрирования и очистки О-антигена с использованием ультрафильтрации на полых волокнах [И, 12, 14, 15], однако эксперименты проводились на малообъёмных установках, не масштабировались и не были внедрены в производство. Из большого количества технологических разработок по усовершенствованию производства холерных вакцин в производстве ограниченно используется метод диализа препарата О-антигена на плоских мембранах с применением мембранного модуля, разработанного в институте «Микроб» [80]. Однако эти модули имеют невысокую площадь фильтрации (порядка 0,6 м), громоздки и использование их ограничено определённой номенклатурой мембран.

В настоящее время в ГП ВНИИ Полимерных волокон (г. Мытищи) разработан широкий ассортимент отечественных модулей на полых волокнах на основе ароматического полиамида (полисульфона) для процессов ультрафильтрации, диафильтрации и диализа с пределом исключения молекул от 5 до 100 кДа. На основе указанных типов полых волокон созданы ультрафильтрационные аппараты с площадью фильтрации от 0,005 до 4 м². Одновременно ведутся работы по созданию специальных типов полых волокон: с пониженной сорбцией белков, бактерицидных, медицинского # назначения (гемодиализ и гемофильтрация) [9].

Широкое использование в современной биотехнологической практике ультрафильтрационных модулей на полых волокнах и их высокая технологическая и экономическая эффективность заставили нас обратить внимание на возможность применения определённых классов данной аппаратуры для концентрирования и очистки высокомолекулярного О-антигена холерного вибриона, используемого для конструирования холерных Ф вакцин. Необходимость повышения эффективности технологических процессов при снижении стоимости конечного продукта холерной вакцины и определило цель настоящей работы.

Цель работы заключается в разработке масштабируемой технологии получения и очистки компонента холерных химических вакцин — О-антигена холерного вибриона с использованием ультрафильтрационных модулей на полых волокнах.

Задачи исследования: 1. Оценить состояние современных разработок по ультрафильтрации ® биологических жидкостей и определить оптимальное оборудование для выделения О-антигена холерного вибриона.

Разработать производственные установки для концентрирования и диализа биологических жидкостей на основе универсальных модулей на полых волокнах.

Разработать масштабируемую технологию концентрирования О-антигена холерного вибриона с использованием метода ультрафильтрации на полых волокнах при производстве холерных вакцин.

Оптимизировать и внедрить в технологию производства холерных вакцин метод ультрафильтрации на полых волокнах для диализа полуфабриката О-антигена.

Изучить в сравнительном аспекте, иммунологические и физико-химические свойства препаратов О-антигена, полученные традиционным способом и с помощью метода ультрафильтрации.

6- Изучить динамику и спектр ферментов холерного вибриона на этапах получения холерной вакцины с помощью разработанной ультрафильтрационной технологии.

Определить технологичность и экономическую эффективность использования масштабных методов ультрафильтрации на полых волокнах в производстве холерных вакцин.

Научная новизна.

Впервые изучены физико-химические и биохимические свойства растворов О-антигена холерного вибриона при масштабируемых процессах ультрафильтрации, диафильтрации и диализа. Впервые, на основе изучения коллоидной структуры и физико-химического состояния растворов О-антигена холерного вибриона, разработаны оптимальные режимы ультрафильтрации данного компонента холерных вакцин. Впервые даны адсорбционные характеристики препаратов О-антигена холерного вибриона в отношении различных фильтрующих основ полых волокон и определены параметры образования вторичного фильтрационного слоя на поверхности данных материалов. Определён композиционный состав концентрата О-антигена по основным белковым и полисахаридным компонентам, даны сравнительные характеристики нового и традиционного препаратов. Впервые изучена динамика качественного и количественного содержания ферментов холерного вибриона в процессе концентрирования, выделения и очистки О-антигена, а также в процессе формирования таблетированного препарата вакцины. Новыми явились сведения о полноценности по иммунобиологическим свойствам О-антигена и холерной таблетированной вакцины, полученных в производственных условиях с использованием ультрафильтрации.

Практическая значимость.

Разработана, смонтирована и введена в эксплуатацию установка с применением стандартных промышленных ультрафильтрационных модулей на полых волокнах для эффективного использования в технологиях производства медицинских иммунобиологических препаратов. Созданная универсальная ультрафильтрационная установка внедрена в производство сертифицированных препаратов — холерных вакцин. Использование концентрирования, диализа и диафильтрации на полых волокнах растворов О-антигена холерного вибриона позволило существенно снизить количество дорогостоящего сульфата аммония, применяемого для очистки О-антигена, проточной воды и электроэнергии, существенно уменьшить трудозатраты на осуществление данного этапа производства, а также повысить качество конечного продукта за счет получения более очищенной фракции О-антигена.

Внедрение метода диализа и диафильтрации О-антигена холерного вибриона на этапе его освобождения от сульфата аммония, позволяет, благодаря большой площади полых волокон в ультрафильтрационном волоконном аппарате существенно сократить время на проведение процесса диализа и исключить рутинные малоэффективные регламентные методы.

Образцы таблетированной холерной вакцины в количестве трех серий, полученных по новой технологии, прошли испытания в Национальном органе контроля МИБП — ГИСКе им. Л. А. Тарасевича, на основании результатов которых были составлены «Изменения № 3 к регламенту производства № 500−94 на вакцину холерную бивалентную химическую таблетированную», утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» 21.11.2002 г, одобренные Ученым советом и согласованные директором ГИСК им. Л. А. Тарасевича 26.11.2002 г.

Разработанные технологии внедрены в производство, для чего составлены и утверждены стандартные операционные процедуры на каждом этапе использования нового оборудования.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Разработана, сконструирована и внедрена производственная установка из шести ультрафильтрационных половолоконных аппаратов для масштабируемого концентрирования культуральной жидкости холерного вибриона, содержащей О-антиген.

2. На основании данных о физико-химических и биохимических свойствах растворов О-антигена предложена оптимальная схема ультрафильтрационного концентрирования культуральной жидкости холерного вибриона в 10 раз для последующего выделения препарата О-антигена.

3. Разработана и смонтирована установка для масштабируемой диализной диафильтрации раствора О-антигена после осаждения сульфатом аммония с использованием ультрафильтрационных аппаратов.

4. Препараты О-антигена, полученные по новой технологии, соответствуют требованиям действующей нормативной документации, обладают большей серологической активностью и в своем составе сохраняют набор ферментов холерного вибриона.

5. Использование ультрафильтрационного метода в производстве холерных вакцин технологично и экономически эффективно за счет уменьшения количества расходных материалов, снижения энергои трудозатрат.

6. Экспериментально-производственные серии вакцины, полученные с помощью ультрафильтрации, при контрольной проверке по показателям качества соответствовали действующим требованиям фармакопейной статьи предприятия и регламенту производства на «Вакцину холерную бивалентную химическую таблетированную».

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на научно — практической конференции «Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы» (Киров, 2001) — на научнопрактической конференции с международным участием, посвящённой 90-летию основания кафедры общей гигиены и экологии Саратовского медицинского университета «Окружающая среда и здоровье» (Саратов, 2002) — на VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера» (Ростов-на-Дону, 2003 г.) — на ежегодных итоговых научных конференциях в РНИПЧИ «Микроб» в 2000, 2002 и 2003 годах.

Диссертационная работа рассмотрена и одобрена на межлабораторной конференции в институте «Микроб».

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 7 опубликованных научных работах.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырёх глав собственных исследований, заключения, выводов и списка основной использованной литературы. Объём диссертации 145 страниц машинописного текста, включающего 15 рисунков 9 таблиц.

Список литературы

содержит 183 источника, в числе которых 98 отечественных.

ВЫВОДЫ.

1. На основе использования отечественных ультрафильтрационных модулей разработан технологический стенд из шести половолоконных аппаратов площадью фильтрации 18 м, предназначенный для концентрирования формалинизированного центрифугата культуральной жидкости холерного вибриона, содержащей О-антиген. Предложенные технологические решения основных узлов установки позволили эффективно использовать ее в производственном цикле приготовления холерных вакцин.

2. Полученные данные о реологических и физико-химических свойствах растворов О-антигена холерного вибриона позволили с использованием ультрафильтрационной установки разработать схему и определить оптимальные технологические параметры концентрирования данного протективного компонента. Показано, что десятикратное концентрирование раствора О-антигена с 250, до 25 л в течение 2,5 ч не приводит к его потерям и изменению агрегатного состояния.

3. Установлено, что полученные по новой технологии фракции О-антигена соответствуют требованиям действующего регламента производства на холерную вакцину по иммуногенности и безвредности, имеют в своем составе меньше неспецифических белковых компонентов, что приводит к повышению его серологической активности. В препарате О-антигена сохраняется комплекс иммунологически значимых ферментов холерного вибриона.

4. С использованием ультрафильтрационных аппаратов разработана технологическая схема диализа методом диафильтрации фракции О-антигена от осадителя сульфата аммония, что позволило повысить эффективность данного производственного этапа за счет сокращения времени на выполнение и количества расходных материалов при сохранении концентрации и биологической активности препарата.

5. Применение ультрафильтрации на полых волокнах в технологической схеме получения О-антигена позволяет сократить, по сравнению с традиционным методом, количество используемого осадителя сульфата аммония в 14 раз, расход воды в 1,8 раза, электроэнергии в 2,6 раза, количество времени на выполнение всего этапа с 200 до 100 ч, сократить число используемого персонала с 3-х до 2-х человек, при существенном снижении трудозатрат.

6. Холерная химическая бивалентная таблетированная вакцина, полученная по новой технологии, соответствует требованиям регламента производства (№ 500−94) и фармакопейной статьи предприятия (№ 42−200 020−00) на холерную вакцину. На основании результатов контрольных испытаний трех серий экспериментальных вакцин, проведенных Национальным органом контроля МИБП — ГИСКом им. Л. А. Тарасевича были составлены и утверждены «Изменения № 3 к регламенту производства на вакцину холерную бивалентную химическую таблетированную», что позволило в 2002 году внедрить ультрафильтрационную технологию в производство.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Седьмая пандемия холеры, начавшаяся около 40 лет тому назад, поставила перед национальными органами здравоохранения вовлеченных в нее стран, ряд серьезных проблем, одной из которых явилась разработка вакцин против этой инфекции. ВОЗ в своем резюме заявляет, что существует настоятельная необходимость в создании холерных вакцин, эффективных против различных эпидемических типов У. сЬо1егае, особенно для орального применения. В Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» разработана и внедрена в производство бивалентная химическая таблетированная холерная вакцина, содержащая основные протек-тивные антигены холерного вибриона: холероген-анатоксин, соматические О-антигены Огава и Инаба, ферменты.

Технология производства холерных вакцин постоянно совершенствуется, так как современный уровень биотехнологических производств препаратов, вводимых людям, требует использования современных методических подходов, оборудования и материалов, позволяющих с высокой эффективностью получать качественные вакцинные препараты. В связи с этим, проведение научных разработок, направленных на совершенствование технологии производства холерных вакцин и их внедрение в практику, настоятельно необходимо.

Широкое использование в современной биотехнологической практике ультрафильтрационных модулей на полых волокнах, в связи с их высокой технологической и экономической эффективностью, заставило нас обратить внимание на возможность применения определённых классов данной аппаратуры для концентрирования и очистки высокомолекулярного О-антигена холерного вибриона, используемого для конструирования холерной химической вакцины. Необходимость повышения эффективности технологических процессов при снижении стоимости конечного продукта холерной вакцины и определило цель настоящей работы.

Проведенный литературный и патентный поиск, а также изучение рынка ультрафильтрационных материалов, позволили нам выбрать наиболее рентабельные материалы и оборудование. Наиболее приемлемыми по цене, доступности и диапазону исключения биомолекул оказались отечественные ультрафильтрационные аппараты на полых волокнах марки УВА-ПС-20−1040. Полые волокна модулей аналогично мембранам действуют по принципу молекулярного сита. Однако обладают по сравнению с ними рядом преимуществ, обусловленных увеличением площади фильтрации за счет соотношения между площадью поверхности волокон и их объемом.

На первом этапе работы был создан опытный вариант установки для концентрирования формалинизированного центрифугата (культуральной жидкости) О-антигена холерного вибриона производственного штамма М-41 Огава. Ультрафильтрационная установка состояла из половолоконного аппарата марки УВА-ПС-20−1040 производительностью по дистиллированной воде 415 л/чбаллона с газообразным азотом вместимостью 40 лрегулятора давления азота марки БКО-54−4 — реактора (ферментёра) объёмом 630 л — насоса с магнитным приводомротаметра и приёмной ёмкости для фильтрата.

На данной установке было сконцентрировано 200 л (реактор) формалинизированного центрифугата штамма М41 серовара Огава до 20 л. Время фильтрации — 30 часов, средняя скорость 100 мл/мин. Количество сульфата аммония, истраченного на осаждение препарата, было в десять раз меньше по сравнению с традиционной технологией. Качество препарата по основным показателям (в реакциях с АХС, О-сыворотками, РНГА) соответствовало требованиям нормативной документации.

Дальнейшей задачей стало создание производственного стенда для масштабирования этапа ультрафильтрации. Базовый стенд был собран из шести ультрафильтрационных волоконных аппаратов производительностью по дистиллированной воде 730 л/ч каждый, суммарная производительность соединённых последовательно аппаратов составила 4380 л/ч., что существенно уменьшило время концентрирования. Данная схема обеспечивала лучшие гидродинамические характеристики установки в целом, способствовала снижению времени на процесс концентрирования и создавала большие удобства в обслуживании.

Конструкция разработанного стенда удовлетворяет основным техническим условиям при производстве концентрата О-антигена из центрифугата. Герметичность гарантируется введением в конструкцию замкнутой системы циркуляции, насоса с магнитным приводом и реактора (ферментёра). Начальная скорость выхода фильтрата на шестиколоночном модуле составила 2,5 л/мин, через 3 ч. концентрирования скорость выхода фильтрата уменьшилась до 0,8 л/мин и стабилизировалась примерно на данном уровне. Таким образом, время отвода фильтрата было значительно выше благодаря более высокой плотности пор на единицу площади волокна ультрафильтрационных волоконных аппаратов и увеличению количества колонок.

Вспомогательное оборудование, апробированное на экспериментальной установке, показало свою надёжность и безопасность в работе и было включено в конструкцию стенда. Схема последовательной обвязки модулей исключала образование застойных зон внутри корпусов модулей.

Введение

в схему обвязки ультрафильтрационных модулей реактора в качестве сосуда для концентрирования фракции О-антигена, конструкция трубопроводов и запорной арматуры позволяют стерилизовать реактор паром перед началом и по окончании цикла. Использование газообразного азота в реакторе при парциальном давлении выше атмосферного, во время концентрирования не только увеличивает скорость ультрафильтрации, но и не позволяет окислять центрифугат, а впоследствии его концентрат кислородом воздуха. Создание атмосферы газообразного азота над препаратом в реакторе предотвращает вспенивание препарата, что, при его отсутствии, потребовало бы установки дополнительного оборудования по пеногашению. Важным преимуществом конструкции стенда являются две независимые разводки в схеме стенда по фильтруемому материалу и по фильтрату, а простота сборки конструкции, малая металлоёмкость, применяемые материалы (силиконовая резина, нержавеющая сталь, фторопласт) гарантирует многократную стерилизацию химическими агентами линий трубопроводов модулей и вспомогательного оборудования.

На данной установке проведено шесть циклов концентрирования куль-туральной жидкости штамма М-41 от 250 ± 25 литров до 25 ± 2 литров (т.е. 6 реакторов). Концентраты О-антигена центрифугировали для осаждения нерастворимых компонентов на центрифуге СГО-ЮО при 15 000 в. Из надоса-дочной жидкости О-антиген осаждали сульфатом аммония при 50% насыщения, центрифугировали (СГО-ЮО, 15 000 в), диализовали и получали жидкую О-антигенсодержащую фракцию. После стерилизации и лиофильной сушки получали готовый полуфабрикат вакцины (О-антигена штамма М-41 серова-ра Огава).

В процессе ультрафильтрации каждые 15 мин производили отбор проб фильтрата, который контролировался по мутности (что позволяло определять целостность волокон колонки), содержанию О-антигена и ферментов холерного вибриона. Результаты сравнительного анализа исходного центрифугата, концентрата и фильтрата показали, что весь О-антиген, растворенный в куль-туральной жидкости, концентрировался в процессе ультрафильтрации и сохранялся в концентрате. Некоторое количество протеазы и фосфолипаз переходило в фильтрат, что в дальнейшем позволяет использовать этот отход производства для получения ферментов в очищенном виде. Липаза (твиназа) не проникала через ультрафильтрационные волокна и полностью сохранялась в препаратах.

Количество центрифугата 2-х реакторов после концентрирования уменьшилось с 435±10 литров до 35±5 л, что позволило исключить необходимость осаждения препарата при 60% насыщения сульфатом аммония и, соответственно, центрифугирования в течение 4 ч. двумя сверхцентрифугами. Кроме того, исключается необходимость в последующем диализе препарата в течение 48 ч. на целлофановых мешочках или 24 ч. на аппарате типа «искусственная почка». По новой технологии центрифугирование для отделения балластных веществ от растворённого О-антигена проводят на сверхцентрифуге СГО 100, скорость ротора которой равна 15 000 в, обеспечивает отделение балластных фракций от растворённого О-антигена без 20%-ного насыщения сульфатом аммония.

Таким образом, предложенный новый вариант технологии позволил исключить многоступенчатые этапы выделения и очистки О-антигена.

Следующим этапом работы стала разработка технологических схем ускоренного диализа и диафильтрации О-антигена на ультрафильтрационном модуле. В производстве холерных вакцин при диализе полуфабриката О-антигена после осаждения его из культуральной жидкости сульфатом аммония используют для удаления соли аммония диализ в целлофановых мешочках или аппарат для диализа типа «искусственная почка». Недостатками этих методов является длительность диализа за счет малой площади поверхности мембран, большой расход проточной воды, одноразовое использование мембран и целлофана. На современном этапе эти способы обессоливания в производстве существенно устарели и являются малоэффективными.

Характеристики ультрафильтрационного модуля и большая площадь фильтруемой поверхности полых волокон позволили разработать и апробировать технологические схемы диализа и диализа методом диафильтрации О-антигенных компонентов холерной вакцины с использованием аппарата, ранее применённого в эксперименте при концентрировании О-антигена из культуральной жидкости.

Схема диализной установки представляет собой сборную конструкцию, состоящую из бачка, в который помещается препарат О-антигенсодержащей фракции, ультрафильтрационного модуля, насоса с магнитным приводом и блоком электропитания для циркуляции препарата, двух ротаметров, фиксирующих показание расхода объёма диализующей воды и прохождения объёма диализуемого препарата. Проточная кювета с ионоселективными электродами &bdquo-ЫН/ и рЫа + позволяет получать данные о концентрации ионов аммония в протоке диализуемого препарата по откалиброванной в милливольтах (от 90 до — 22) шкале универсального иономера марки ЭВ-74. В схему конструкции диализной установки включён фильтр для очистки проточной диализующей воды от механических примесей, 40-литровый баллон с газообразным азотом и понижающим редуктором для выравнивания давлением азота осмотического давления диализующей воды и раствора диализуемого препарата. Использование в схеме двух независимых линий обвязки ультрафильтрационного модуля, для диализуемого препарата и диализующей проточной воды, позволяет в замкнутом цикле вести диализ в стерильных условиях. На линии диализуемого препарата предварительно перед диализом из сифонного бачка через трубопроводы и запорную арматуру закачивается раствор стерилизующих химических дезинфектантов, под давлением стерильного воздуха направляется в корпус модуля по наружному пучку полых волокон. Таким образом, стерилизуется вся линия — насос, ротаметр, проточная кювета с ионоселективными электродами и возвращается в сифонный бачок. После полного выхода диализующего раствора в фильтрат из аналогичного сифонного бачка вся линия промывается стерильной дистиллированной водой по той же схеме. На линии обвязки диализующей воды стерилизация не предусмотрена, стерилизующий раствор проходит сквозь поры полых волокон, где и стерилизуется вся внутренняя сторона пучка полых волокон. Газообразный азот в сифонном бачке создаёт над препаратом во время диализа небольшое парциального давление, выравнивает осмотический потенциал (осмотическое давление) между диализующей водой и концентрационным градиентом раствора диализуемого препарата, для избежания значительного насыщение проточной водой препарата.

Испытание данной схемы показало несомненное технологическое преимущество диализа на модуле, по сравнению с диализом в целлофановых мешочках и аппарате типа «искусственная почка». Время прохождение диализа на модуле уменьшилось в 4 раза по сравнению с диализом на мембранах «Влацефан» и до 8 раз в целлофановых мешочках. Расход проточной воды уменьшился по сравнению с мембранами «Влацефан» в 9 раз, в целлофановых мешочках в 17 раз. Себестоимость расходных материалов на одну серию препарата снизилась в 6 раз по сравнению с диализом в целлофановых мешочках и в 15 раз по сравнению с мембранами «Влацефан», применяемыми в аппарате типа «искусственная почка».

Возможность обессоливания раствора О-антигена за счет многократного или непрерывного разведения раствора свежим растворителем показана в разработанной технологии диафильтрации О-антигена. Важным преимуществом данной технологии является возможность замены водопроводной воды на стерильную дистиллированную. Стенд для диализа методом диафильтрации в непрерывном и периодическом режиме, собран на базе однотипного модуля и оборудования, применённого в предыдущем эксперименте по диализу на проточной воде с небольшими изменениями. В конструкцию установки по диафильтрации включили реактор, наличие паровой рубашки у которого позволяет стерилизовать дистиллированную воду для диализа. Применение газообразного азота создавало в реакторе гидростатическое давление, увеличивая скорость выхода в фильтрат растворителя (воды) с сульфатом аммония сквозь поры полых волокон модуля, и с помощью парциального давления поддерживало объём растворителя выбывшего в фильтрат таким же объёмом стерильной дистиллированной воды из реактора.

Апробация диафильтрации в постоянном рабочем объёме О-антигенсодержащей фракции штамма 569 В Инаба показала экономию во времени в 2,6 раза по сравнению с диализом в целлофановых мешочках и 0,2 раза на мембранах «Влацефан». Расход стерильной дистиллированной воды составил 60 литра, но по себестоимости расходных материалов в 1,7 менее, чем на мембранах. Диафильтрация в периодическом режиме препарата О-антигенсодержащей фракции штамма М-41 Огава, показала экономию во времени в 4,3 раза по сравнению с диализом в целлофановых мешочках и 2,1 раза на мембранах «Влацефан». Расход стерильной дистиллированной воды, как и в предыдущем случае, составил 62 л.

Результаты изучения лиофилизированных О-антигенсодержащих фракций показали, что по химическому составу и специфической активности (титры РНГА 1:112 и 1:56 у антигенов серовара Огава и Инаба) они соответствуют требованиям регламента производства.

При сравнении различных вариантов диализа очевидно, что наиболее перспективным является применение схемы диафильтрации в «периодическом» режиме, преимуществом которой было уменьшение времени диализа в четыре раза и возможность применения только дистиллированной воды.

Результаты, полученные в процессе изучения фракций О-антигена, позволили сделать вывод о том, что внедрение нового технологического этапа не ухудшило качества компонентов вакцины, а в некоторых случаях имелось преимущество перед традиционной технологией (повышение в 1,5 раза специфической активности по РПГА при уменьшении количества неспецифических белковых компонентов). Общее количество основных химических компонентов в препаратах было сходным, некоторые отличия обнаружены в количестве белка: у экспериментальтальных препаратов О-антигена оно составляло 22%, а у полученных традиционным способом 27%. Возможно, это связано с удалением в процессе ультрафильтрации неспецифических белковых компонентов. Содержание альдогептозы во всех препаратах было однозначным и составляло 0,5−0,6%. Как известно, альдогептоза является маркером липополисахарида холерного вибриона и может характеризовать содержание О-антигена в препаратах. Таким образом, препараты О-антигенов, полученные с помощью технологии ультрафильтрации, по своим физико-химическим свойствам и серологической активности соответствовали препаратам, полученным по регламенту производства.

Анализ полученных фракций осуществляли с помощью хроматографи-ческого разделения О-антигенов на колонке с Т8Кгелем Н^-бО. Полученные нами результаты хроматографического анализа О-антигенов продемонстрировали их подобие: в элюатах препаратов обнаруживался специфический О-антиген и некоторое количество антигена VI, относящегося к неспецифическим термостабильным антигенам, что связано со стерилизацией обоих препаратов текучим паром.

Большое внимание было уделено сравнительной оценке готовых форм холерной бивалентной химической вакцины, изготовленной из фракций, полученных по традиционной и измененной технологиям. Из 6 выращенных реакторов были сформированы 3 серии таблетированной холерной бивалентной химической вакцины — 09, 010, 011. Контроли проводились по всем тестам, заложенным в регламенте производства № 500−94 «Вакцина холерная бивалентная химическая таблетированная». Они включали в себя изучение физико-химических свойств, бактериальной контаминации, специфической активности, токсичности, иммуногенности, реактогенности.

По физико-химическим свойствам таблетки, полученные по измененной технологии, не отличались от серий таблеток, полученных по регламенту.

В биохимическом составе таблеток 6 серий, полученных различными способами, значимых отличий не наблюдалось. По активности основных антигенов (холероген-анатоксин, О-антиген) обе вакцины были практически одинаковы. Обе вакцины имели в своем составе фосфолипазу (3200 у.е.), протеазу (2100 у.е.), твиназу (1150 у.е.). Следовательно, внедрение новой технологии не привело к ухудшению качества и специфической активности препарата.

Далее, стандартность серий вакцины была изучена путем анализа таблеток методом высокоэффективной жидкостной хроматографии — ВЭЖХ. Профили элюции таблеток экспериментальной вакцины и полученных по регламенту производства представляют ряды подобных пиков, при анализе которых в материале первого пика всех серий вакцины обнаруживался О-антиген, а последнего — холероген. Идентичность пиков позволяет считать все исследованные серии вакцины стандартными.

Проверка безвредности таблетированной вакцины, полученной по измененной технологии, согласно регламенту производства проводилась на белых нелинейных мышах массой (17+1) г. С этой целью животным вводили подкожно 0,5 мл раствора, содержащего 1/160 часть таблетки. Установлено, что экспериментальные вакцины так же, как и коммерческий препарат, в пороговой дозе не вызывали гибели белых мышей в течение 7 сут.

В проверке на специфическую безопасность все три серии были идентичны друг другу и соответствовали требованиям ФСП 42−0020−0020−00.

Изучение иммуногенных свойств экспериментальной вакцины выявило ее высокую иммуногенность. Было установлено, что величина ЕД50 испытуемого препарата не превышала регламентируемую 1/20 000 часть таблетки для штаммов каждого серовара и составляла в среднем 1/80 000 часть таблетки.

Проведённые иммунобиологические исследования и контрольные испытания трёх экспериментально-производственных серий вакцины показали их соответствие требованиям ФСП-42−0020−0020−00 и регламенту производства № 500−94 на вакцину холерную бивалентную химическую таблетиро-ванную.

Концентрирование методом ультрафильтрации О-антигена на стенде из шести аппаратов на полых волокнах позволило снизить количество расходуемого сульфата аммония в 14 раз и исключить необходимость использования различного оборудования.

Рассчитана экономическая эффективность использования технологии ультрафильтрации при изготовлении таблетированной холерной вакцины. Расчеты показали, что экономический эффект от внедрения этапа концентрирования позволил сократить регламентное время (время работы оборудования) с 192,15 до 96,45 ч. Время диализа или диафильтрации на ультрафильтрационном модуле позволило снизить время данного процесса до 6 — 11 ч по сравнению с традиционной технологией, где затраты времени составляют от 48 до 96 ч.

Сравнение затрат на получение препарата по новой и традиционной технологий показало несомненное преимущество первой. Общая экономия в рублях по суммарной стоимости составила на 2003 год 14 438,57 рублей на получение одной серии О-антигена. Экономия при диализе и диафильтрации при формировании 20 серий вакцины составила 4220,61 рублей. Количество сотрудников сократилось с 3 до 2 человек.

В результате выполненной работы составлены «Изменения № 3 к регламенту производства № 500−94 на вакцину холерную бивалентную химическую таблетированную», утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» 21.11.2002 г, одобренные Ученым советом и согласованные директором ГИСК им. Л. А. Тарасевича 26.11.2002 г, что позволило в 2002 году внедрить разработанную улырафильтрационную технологию в производство холерной вакцины в институте «Микроб».

Показать весь текст

Список литературы

  1. А.К. Основные закономерности формирования и функционирования иммунных молекулярных циклов // ЖМЭИ., 1993. — № 1,-С. 98−103.
  2. А.К., Наумшина М. С. Холерные вибрионы. Саратов., 1984.- 23 с.
  3. Л.П., Черепахина И. Я., Сальникова О. Л. с соавт. Изучение антигенных взаимосвязей типичных и R форм холерных вибрионов на основе моноклональных антител // ЖМЭИ., -1998. № 4.- С. 9 -12.
  4. В.В. Об отсутствии различий между холерой эльтор и классической холерой // ЖМЭИ., 1991. — № 2.- С. 72−75.
  5. Н.М., Тюменцев С. Н. Иммунобиологические свойства липополисахаридного компонента холерного О-антигена // Совр. аспекты профилакт. зоонозных инф. Иркутск., -1984. — Ч. 3. — С. 102−103.
  6. Н.М., Безносов М. В., Тюменцев С. Н. с соавт. Физико-химические свойства белковолипополисахаридного компонента холерного О-антигена // Совр. аспекты проф. зоонозных инф. Иркутск., -1984.-Ч.З.-С. 100−101.
  7. И. П., Воробьёв А. А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л., -1962. -. 180 с.
  8. Л.Г. Патогенез функциональных и метаболических расстройств при холерной интоксикации и вакцинации. Дис. .д-ра мед. наук Саратов., -1994.- 395 с.
  9. Т. Мембранная фильтрация. М., Мир., — 1987.- 462 с.
  10. О.В., Джапаридзе М. Н., Дятлов И. А. с соавт. Новый способ получения О-антигена холерного очищенного с целью создания холерных диагностических препаратов // Биотехнология., 2002. № 2.- С. 4246.
  11. О.В., Джапаридзе М. Н., Дятлов И. А. с соавт. Патент № 2 143 280 от 26.05.1999 г.
  12. О.В., Джапаридзе М. Н., Дятлов И. А. с соавт. Патент № 21 59 128 от 24.02.2000 г.
  13. М. Н. Никитина Г. П. Попов A.A. К вопросу получения О-антигена холерного вибриона при производстве холерной химической вакцины холероген-анатоксин // Проблемы спец. проф. чумы и холеры. Саратов., 1985. — С. 66 -71.
  14. М.Н., Домарадская Т. И. Выделение О-антигена холерного вибриона методом иммуноаффинной хроматографии // Лаб. диагност., биохим. и специфич. профилакт. холеры и чумы. Саратов., 1986. — С.61−67.
  15. М.Н., Караева JI.T., Сумароков A.A. с соавт. О-антиген Vibrio cholerae серовара Огава, рекомендуемый для создания оральной холерной бивалентной химической вакцины // ЖМЭИ., 1981. № 11.-С. 75−80.
  16. М.Н., Мартене JI.A., Егорова В. Д. Влияние эндотоксинов холерного вибриона на дыхание митохондрий печени в присутствии субстратов цикла Кребса // Бюлл. экспер. биол. 1970. — № 4. -С. 66−69.
  17. М.Н., Тараненко Т. М., Наумов A.B. с соавт. Биохимическая природа О-специфичности полисахаридов ЛПС оральной холерной химической бивалентной вакцины // V Всесоюзн. биохим. съезд. Тез. стенд, сообщ. М., 1986. — Т.З. — С.9.
  18. .А. Структура и иммунобиологические свойства ® бактериальных полисахаридов и липополисахаридов // Химия и биохимияуглеводов: Тез.докл. на VIII Всесоюз. конф. Пущино., 1987. — С.17−19.
  19. Е.А. Исследование явления концентрационной поляризации и его учёт в процессах разделения растворов обратным осмосом И Дисс. .канд. хим. наук. М., МХТИ им. Д. И. Менделеева, 1980. -190с.
  20. Т.Н. Ферментативная активность вибрионов // Пробл. ООИ. Саратов., 1978. — Вып. З (61). — С. 59−63.
  21. В.П., Перепечнин Г. П., Каталавский Е. Е. Полимерные ^ мембраны. М., Изд. Химия. 1981.- 232 с.
  22. Ю.И. Баромембранные процессы. М, Изд. Химия. -1986.-37 с.
  23. Ю. И. Когаров P.P., Моргунова Е. П. Электродиффузионный метод определения концентрационной поляризации // V Всесоюзное совещание по электрохимии. М., Тезисы докладов. 1974. -Т. II. — С. 324−326.
  24. Ю.И. Мембранные процессы разделения жидких смесей. М., Изд. Химия. 1975.- 252 с.
  25. Ю.И. Обратный осмос и ультрафильтрация. М., Изд. Химия. 1978.- 286 с.
  26. Ю.И. Очистка сточных вод целлюлозно-бумажной промышленности обратным осмосом и ультрафильтрацией. М., Изд. ВНИПИЭИ. Леспром. 1974.- 42 с.
  27. Ю.И. Патент. США № 354 006. от 12. 05. 1970 г.
  28. Ю.И. Самые тонкие фильтры. М., Изд. Правда. 1981. № 292.- 4 с.
  29. Ю.И., Дмитриев A.A. Всесоюзная конференция мембранных методов // Изд. ВНИИСС. Владимир., — I981.-4.I.- С. 134−136.
  30. Ю.И., Кочаров Р. Г., До Ван Дай. Всесоюзная конференция мембранных методов 73 //- М., Изд. МХТИ. 1973. — С. 24 — 27.
  31. Ю.И., Сухов Г. Д., Моргунова Е. П. Химическая промышленность // 1982. № 4.- С. 32 — 34.
  32. В.Е., Приходько А. Г. Капиллярно фильтрационная модель механизма селективной проницаемости органических веществ // Журнал прикладной химии. — 1977. № 2.- С. 16−19.
  33. Ю.В. Патогенность как функция биомолекул. М., Медицина, 1985. — 240 с.
  34. В.П. Получение и исследование пористых полимерных мембран для ультрафильтрации растворов биологически активных веществ. Дисс. .канд. хим. наук. Минск., — 1979. — 180 с.
  35. Л.Ф. Изоляция и некоторые свойства клеточных компонентов холерного вибриона. Сообщ. 1. Получение клеточных культур и исследование антигенных свойств вибриона типа Огава // ЖМЭИ. 1968. — № 12.-С. 38−43.
  36. H.A. Электрохимия растворов. М., Изд. Химия. 1966.263 с.
  37. A.A. Исследование формирования динамических мембран из щёлоков целлюлозно-бумажной промышленности и их использование для очистки щелокосодержащих стоков: // Дисс. .канд. хим. наук. Киев институт коллоидной химии и химии воды. 1980. -188 с.
  38. Г. А., Михалков П. Е. Теплообменные акустические процессы и аппаратура. М., Машиностроение. 1973.- 233 с.
  39. Ф. Н. Лишневский В.Н. Ультрафильтрация и обратный осмос // Труды ВНИИ ВОДГЕО. Вып.29. 1971.- С. 39 — 41.
  40. В.А., Лялин A.A., Свитцов A.A. Состояние и перспективы мембранной техники в микробиологической медицинской и пищевой отраслях промышленности // Биотехнология. Т. 5. № 3. 1989. — С. 260−261.
  41. Г. И., Шапиро Н. И., Андриевская P.A. Химические вакцины для профилактики кишечных инфекций. Л., Медицина. 1979. — С. 66 — 74.
  42. Ю.А., Кочетков Н. К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. I. Общая характеристика липополисахаридов и структура липида, А (обзор) // Биохимия. 1993. — Т. 58, вып.2. — С. 166−181.
  43. Ю.А., Кочетков H.K. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. II. Структура кора (Обзор) // Биохимия. -1993. -Т. 58, вып.2. С. 182−201.
  44. Ю.А., Кочетков Н. К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. III. Структура О-специфических полисахаридов И Биохимия. -1994. Т. 59, вып.12. — С.1784−1851.
  45. А.Е., Марквичев Н. С., Свитцов A.A. Химия и биотехнология физиологически активных соединений и их полупродуктов // Труды. МХТИ им Д. И. Менделеева М., 1987.- Вып. 149.- С. 108−113.
  46. И.А., Громова О. В., Джапаридзе М. Н. с соавт. Тест среды для определения активности твиназы, протеазы и фосфолипазы в холерной химической вакцины и её компонентах // Проблемы ООИ. -Саратов., 2002. Вып. 1(83) С. 148−152.
  47. В.А., Яковлев А. П., Аваева С. Н. с соавт. Улучшенный метод выделения липополисахаридов из грамотрицательных бактерий // Мол. генетика, микробиол. и вирусол.- 1987.- N 5. С.44−46.
  48. H.H. Влияние потока электролита на кинетику электродных реакций, осложнённых химической стадией // Дисс. .канд. хим. наук. Москва, 1970. — 187 с.
  49. В.В., Сухарь В. В. Особенности липополисахарида Vibrio cholerae // ЖМЭИ. № 2. 2002.- С. 102 107.
  50. В.В. Простые опыты с ультразвуком. М., Наука. 1978.-159с.
  51. М.Н., Кузнецов А. Е., Марквичев Н. С. Мембранные биореакторы в биотехнологии // Биотехнология. 1988.- Т. 4. № 2.- С. 165 -173.
  52. Е.Ю., Марамович A.C., Голубинский Е. П. с соавт. Перспективы совершенствования холерных химических вакцин // ЖМЭИ. № 4. 1998.- С. 91−96.
  53. Ю.В. Иммунологические реакции организма на эндотоксин холерного вибриона: Автореф. дис. .канд. мед. наук. М., 1979. -15 с.
  54. Г. И., Вознесенская И. Е. Термодинамика и строение водных и неводных растворов электролитов. Л., Химия. 1976.- 328 с.
  55. A.C. Химия вод океана. М., Наука. 1979. Т. 1.- 518 с.
  56. Н.В. Вакцинология. М., «Триада-Х», 1999. 272 с.
  57. K.M., Колесник A.B. Выявление основных антигенов холерного вибриона методом встречного иммуноэлектрофореза // Лаб. дело. 1981.-№ 6.-С.-384.
  58. A.B., Ледванов М. Ю., Дроздов И. Г. Иммунология холеры. (Руководство). Саратов., Изд. Слово. 1995. 7 с.
  59. К. В. Кудряшов В.Л. Лыжин В. Е. Эффективность применения металлокерамических мембран в биотехнологии // Мат-лы 1-го Международного конгресса «Биотехнология состояние и переспективы развития» — Москва, Россия, 14−18 октября 2002, — С. 215−216.
  60. Г. П., Джапаридзе М. Н., Попов A.A. Усовершенствование процесса получения О-антигена холерного вибриона серовара Огава // Профилактика ООИ / Тр. противочумн. учрежд. Саратов, 1988. -С.75−80.
  61. Д. Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию. Пер. с англ. М., Мир. 1985. — С. 61−62.
  62. .Г. Применение акустических колебаний в химико-технологических процессах. М., Изд. Химия. 1983. — 193 с.
  63. Л.П., Зелинсон Б. М. Оксигенатор «Север» для искусственного кровообращения // Наука и жизнь. М., Изд. Правда. 1987.- С. 36−37.
  64. B.C., Полинский A.C. Высокомолекулярные соединения. Варшава., 1981. Т. 23. С. 246−254.
  65. Г., Вали Нагий Т., Виталис С. Генетика микроорганизмов. Ф — М., Медицина, 1963. — С. 282−292.
  66. О .Я. Структура водных растворов электролитов и гидратация ионов. М., Изд. АН СССР. 1957.- 179 с.
  67. A.A., Орлов Н. С., Кузнецов А. Е. Полупроницаемые мембраны в биотехнологии // ОНТИТЭН. М., Микробиопром. 1983.- 38 с.
  68. А.Е., Марквичёв Н. С., Кураков В. В. Мембранные реакторы в биотехнологии // ВНИИСЭНТИ. Обзор. М., 1986.- 32 с.
  69. Селин М. М Ультрафильтрационное фракционирование // Хим* фарм. журнал. 1985. № 5.- С. 573 .
  70. Р. Методы очистки белков М., Мир. 1985.- 237 с.
  71. A.C. Биохимия. М., 1958. — 565 с.
  72. A.C. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот // Биохимия. 1958. -Т.23, — Вып.5. — С.656−662.
  73. .Д., Цветков A.A. Неорганическая химия. М., Высшая школа. 1994. — С. 264−265.ф 80. Строганов В. В., Космаенко О. М., Васин Ю. Г. с соавт.
  74. Удостоверение № 558 на рационализаторское предложение № 655 выданное 22.09.1987.
  75. Н.М., Рудницкая Г. Е., Рейфман JI.C. // Журнал прикладной химии 1983, — Т. 56. № 1. С. 118−121.
  76. Т.М. Углеводсодержащие антигены чумного и псевдотуберкулезного микробов (теоретические и прикладные аспекты): Автореф. дис. .д-ра биол. наук. Саратов, 1988.- С. — 41.
  77. В.В. Липополисахариды холерного вибриона и не-• которых энтеробактерий // ЖМЭИ. 1982.- № 9. С.20−28.
  78. С.Н., Марков Е. Ю., Молева В. А. Использование деградированного липополисахарида О-антигена для получения высокоактивных и специфичных холерных сывороток // Иммунобиология. -Т.2 // ВИНИТИ. М., 1988. — 40 с.
  79. B.C., Черепахина И .Я., Фецайлова О. П. Оценка значения некоторых свойств для вирулентности V.cholerae и выявление их коррелятивных связей // ЖМЭИ. 1984. — № 10. — С. 25−28.
  80. В.А. Фильтрующие элементы с полупроницаемыми мембранами, аппараты на их основе М., ЦИНТИ Хим-нефтемаш. 1977. — 34 с.
  81. Г. Н. Синтез элементов и применение методов ядерной физики в смежных областях // Вестник АН СССР. № 4. 1984. С. 72−88.
  82. Г. Н., Барашенков B.C. Успехи физических наук. 1974. -Т. 114. № 2.-С. 351−359.
  83. Д. Физическая химия. М., Мир. 1980.- 583 с.
  84. Хау Ф.В., Григуль У. Оптические методы в теплопередаче. М., Мир. 1973.- 240 с.
  85. С., Каммермейер Т. Мембранные процессы разделения. Пер. с англ. М., Изд. Химия. 1981. — 464 с.
  86. А., Хупе К., Лотшпайх Ф. с соавт. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. М.:Мир, 1988. — 668 с.
  87. А. Кристаллизация полимеров. Пер. с англ. М., Мир. 1968. — 200 с.
  88. А.С., Дегтярёва В. Т., Авдошин А. А. с соавт. Информационный бюллетень Горьковского НИИЭМ МЗ РСФСР. Фильтрация в производстве биопрепаратов. Горький., 1986 г. — 17 с.
  89. Э.А. Иммунохимические и биологические свойства бактериальных полисахаридов и липополисахаридов // Химия и биохимия углеводов: Тез.докл. на VIII Всесоюз. конф.- Пущино, 1987. С. 17−19.
  90. Э.А., Домарадский И. В., Киселёва В. И. с соавт. Получение и некоторые биологические свойства липополисахарида холерного вибриона//ЖМЭИ. № 10. 1972.-С. 47.
  91. Д.А., Добровольский А. А., Майзлик Д. А. Дименерилизация и очистка воды методом обратного осмоса. СЭВ. Приложение № 51. М., Изд. Постоянной комиссии по химической промышленности. 1973.- С. 8.
  92. Arcuciba Mohar A., Ariosa — Alvarez., Madrazo — Alonzo D. Sinthesis of terminal disaccharide elements corresponding to the Ogava and Inaba antigenic determinant from Vibrio — cholerae 01 // Carbohydr. Res. -1998. -Vol. 306 (1−2)-P. 163- 170.
  93. Belfort G., Roten Borenstain Y., Katznelson E. Concentrating of viruses with the help of membranes from hollow of fibers. Pergamon Press // Phogn. Water Technol. — 1978.-Vol. 10.- P. 357 — 354.
  94. Bell A.T., Wydeuen Т., Tomson C.C. Millipore membrane // J. Appl. Polym. Sci. 1975. -Vol. 19. — P. 1911- 1915.
  95. Berman D., Rohr M.E., Safferman R.S. Concentrating of polyviruses in water with the help of molecular kill. Appl. Enviren // J. Microbiol. 1980. -Vol. 40. — P. 426 — 428.
  96. Bhaskaran K., Gorrill R.H. A study of antigenic variation in Vibrio cholerae // J. Gen. Microbiol. 1957. — Vol. 16. — P.721−729.
  97. Boiuin A., Mesrobeanu J., Mesrobeanu L. Extraction d ' un complexe toxigue et antigenigue a partir du tecili d’Aertbycke. C.R. Soc. // Biol. — 1933. -Vol. 114(3).-P. 307−310.
  98. Brade H. Occurance of 2-keto-3-deoxy-octonic acid 5-phosphate in lipopolysaccharides of Vibrio cholerae Ogawa and Inaba // J. Bacteriol. 1985. -Vol.161.-P.795−798.
  99. Broch T.D. Membrane filtration: auser' s guide and referense manual. Spinger. Verland. Berlin, Heidelbeng, New York. 1983. — 381 p.
  100. Brock T. Catalogue No. LAR 8010 / U Prienteg in USA. Copyrgnt 1974. Millipore Corp, Bedford Mass. 1 730 Thind Printig 6/75. 80.
  101. Brock T. Reverse osmosis and sintesis membranes, (eds. Somirajan), Nat. Res Conneil Canada, NRCC Publication No. 15 627, Ottawa, Canada, 1977.
  102. Broze D.J., Cates S., Hutchison F.A. Studies on the scale up of microfiltration membrane devices. — PBA // J. Pharm. Sci. Technol. — 1994. -Vol. 48 (4).-P. 184.
  103. Cooper A.R. Ultrafiltration membranes and Applications, ed. -Plenum Press. New York and London, — 1980.- 707 p.
  104. Court J.R. Digital fermentatiw control // World Biotech. Rept. 1986. Biotech. 86. London: New — York. — 1986.- P. 17 — 21.
  105. Dai X., Luo R.G., Sirrar K.K. Pressure and Fiux Profiles in Bead -Filled Ultrafiltracion Microfiltracion Hollow Fiber membrane modules // Biotechol Plog — 2000. Des 1- 16 (6) — P. 1044 — 1054.
  106. Damiano D., Shin C., Ju N. et al. Applications // J. Microbiol. Biotechnol. 1985. — Vol. 21. № 1−2. — P. 68−77.
  107. Danleany M. Polimeric membranes. A review of application // J. Chem. Technol. Biotechnol. 1995. Vol. 63. № 1.- P. 85−91.
  108. Dutka B.J. Membrane filtration. Application, technigues and? problems. Marsel Dekker, New-York. 1981.- 612 p.
  109. Dytnerski J.I. Membranoprozesse zur Trennung flussiger Gemische. Leipzig. VEW. 1977. — 244 s.
  110. Edwards M.F., Wirinson W.L. Transmembranes. Lust // Chem. Eng. -1971. Vol. 19. № 2.- P. 85−92.
  111. Fane A.G., Felle J.D., Nor M.T. Ultrafiltration. Membranes and Applications. Plenum Press, New-York and London.- 1980. P. 631−658.
  112. Fournier J.M. Current pandemics of cholera and strategy of cholera * vaccines. In: R.S. Mahajan. et al. (ed). Ind. Sei. Acad.-1999.- P. 23−30.
  113. Gropl R., Puch W. Delisation. -1970. Vol. 8. P. 277−284.
  114. Hisatsune K., Kondo S., Isshiki Y. et al. Occurance of 2−0-methyl-N-(3-deoxy-L-glycerotetronyl)-D-perosamine (4-amino-4,6-dideoxy-D-mannopyranose) in lipopolysaccharide from Ogawa but not from Inaba O forms of 01
  115. Vibrio cholerae //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. — Vol.190. № 1. -P.302−307.
  116. Hisatsune K., Hayashi M., Haishima Y. et al. An immunochemical study on O-antigenic (endotoxic) lipopolysaccharides of 01 Vibrio cholerae // J. Med. Sei. Biol. 1988. — Vol. 41. — P.222.
  117. Hisatsune K., Yamamoto.F., Kondo S. Lipopolisacharide of Vibrio cholerae. Chemical and serological properties. In: S. Kuwahara, N.F.Pierce (ed.). -Adv. Res. Cholera. Tokyo. 1985. — P. 17−24.
  118. Holmgren J., Svennerholm A.M. Mechanisms of disease and immunity in cholera: a review // J. Infect. Dis.- 1977.- Vol.136. P. 105−112.
  119. Holmgren J., Svennerholm A.M. Development of oral vaccines against cholera and enterotoxigenic Escherichia coli diarrhea Scand // J. Inf. Dis. 1990. — Suppl. — № 76. — P.47−53.
  120. Hou K., Gerba C.O., Goyal S.M. et.al. Delay by filters with the changed, charge latex Bubble, bacteria, endotoxin and viruses. -Appl. Environ // Mikrobiol. 1980. № 40.- P. 892−896
  121. Jacob A., Sinha V.B., Sahib M.K. et al. Identification of a 33 kDa antigen associated with an adgesive and colonizing strain of Vibrio cholerae El Tor and its role in protection // Vaccine. 1993. — Vol.11. № 3. — P.376−382.
  122. Jacobs S. Ultra filtration membranes in biochemistry. Methods Biochem. Anal. -1974. № 22. P. 307−354.
  123. Jasuda H., Mazch H.C. Application // J. Polimeri sci. 1975. Vol. 19, p. 2157. 1976, v. 20,1769- 1976, v. 20. — P. 543−548.
  124. Kabier P.W., Clord H.F. Application of differential mediums at work with membrane filters. American // J. Public Health. 1952. 42. — P. 390 — 392
  125. Kabir S. Antigenic analisis of Vibrio cholerae 01 by crossed immunoelectrophoresis // Zentralbl. Bacteriol. Mikrobiol. Hyg. 1989. -Vol.270, № 3.-P.361−372.
  126. Kaper J. Toxins prodused by Vibrio cholerae // 7 th International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology Division. Prague, 1994.-P. 197.
  127. Kesting R.E. Sinthetic polimeric membranes. McGraw — Hill, New -York. — 1971.-P. 480.
  128. Resting R.E., Murray A., Jachson K. Newman. Highlyanizatropn microfiltration membranes // J. Pharm. Tech. 1981. № 4. — P. 53 — 60
  129. Knirel J.A., Widmalm G., Senchenkova S. et al. Structural staclies on the shot chain lipopolysaccharide of Vibrio cholerae 0139 Bengal. Eur. // J. Biochem. — 1997. 247. — P. 402 — 410.
  130. Kondo S., Haishima Y., Hisatsune K. Chemical structure of the 2-keto-3-deoxyoctonate (KDO) region of the lipopolysaccharide isolated from 01 Vibrio cholerae NIH 41R (Ogawa) II Microbiol. Immunolog. 1991.- Vol.35. № 8. -P.675−680.
  131. Kuberrkan V.T., Davis R.H. Effects of addet yeast on proteintransmission and flux in crossflow membrane microfiltracion // Biotechol. -1999. Vol. 15(3).-P. 472−9.
  132. Lowry O.H., Rosenbrough N. J., Farr A. L. et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. № 193. — P. 265−275
  133. LuderitzO., Galanos C., Rietschel E.T. et al. Lipid A: relationships of chemical structure and biological activity // Immunol. Immunopharmacol. Bact. Endotoxins Proc.Univ. South.Fla. Int.Symp. Biomed.Sci. Tampa. Fid. New York, London.-1985. — P.65−74.
  134. Luderitz О., Galanos С., Rietschel E.T. Endotoxins of gramnegative bacteria // Pharmacol. Ther. 1981. — Vol.15. — P.383−402.
  135. Madsen R.F. Hiperfiltration and ultrafiltration in plate and frame sistems. Amsterdam Oxford N Y. Elsevier Publ. Co. — 1977. — P. 240.
  136. Masayki T. Application // Microbiol. Biotechnol. 1983. Vol.18. — P. 201 -206.
  137. Meltzer Т.Н. Filtration in the pharmacentical industry New — York Basel. Marsel Dekker. — 1987. — P. 1097.
  138. Moussy Y. Bioartifical kidney. I. Theoretical analysis of convective flow in hollow fiber modules: application to a bioarficial hemofilter. // Biotechnol Bioeng. 2000. Apr 20- 68 (2). — P. 142 — 52.
  139. Moussy Y. Bioartificial kidney. I. Teoretical analysis of convetive flow in hollow fiber modules: application to a bioartificial hemofilter // J. Dairy Sci. 1999. 82 (12). — P. 2550 — 7
  140. Nguyen Q. T. Ultrafiltration des soluticus macromoleculares procede de fractionnement associant ultrafiltration et la. Com complexation etat en seien-sislorraine. — 1980. — P. 195.
  141. Nobeshi K. Les types immunologiques du vibrion cholerique // Jap. Bull.Int. Hyg. publ. 1933. — Vol. 25. — P.72.
  142. Osborn M.G. Studies on the gram-negative cell wall. 1. Evidence for the role of 2-keto-3-deoxyoctonate in the lipopolysaccharide of Salmonella typhimurium //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1963. — Vol.50. — P.499−506.
  143. Ozawa T. Yotsumoto H., Takeyata T. Automatic observation sistem fer microorganisms and the lire The patent 4 647 540. USA. The application. 21.05.85. № 736 892.- Is published 03.03.87. МКИ С 12 M 1/34- НКИ 435 /291.
  144. Paul S., Sen A.K., Banerjee N., et. al. Lipid A mutants of Vibrio cholerae: isolation and partial characterization // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990. — Vol.169. № 1. — P. l 16−122.
  145. Perez-Perez G., Hopkins J., Blaser M. Lipopolysaccharide structures in Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, and Vibrio cholerae are immunologically related to Compilobacter spp. // Infect. Immun. 1986. -Vol.51. № 1. — P.204−208.
  146. Petsch D., Bellskow T.C., Anspach F.B. et al. Membrane adsorbers for selektive removal of bacterial endotoxin. // J. Chomotograf B Biomed Sei Appl. 1997. May 23. 693 (1). — P. 79 — 91.
  147. Pike P., Chandler C. Patial purification and properties of somatic antigen spontaneously released from Vibrio cholerae // Infektion. And. Immun. -1975. Vol. 12. № l.-P. 187−192.
  148. Raetz C.R.H., Brozek K.A., Clementz T., et. al. Gramnegative endotoxins biologically active lipid // Cold Spring Harbor Symp. on Quant. Biol.- V.53, pt 2. Cold Spring. Harbor (N.Y.), 1988. — P.973−982.
  149. Raziuddin S. Immunochemical studies of the lipopolysaccharides of Vibrio cholerae: constitution of O-specific side chain and core polysaccharide // Infect. Immun. 1980. — Vol. 27. № 1. — P.211 -215.
  150. Raziuddin S. Characterization of lipid A and polysaccharide moieties of lipopolysaccharides from Vibrio cholerae // J. Biochem. 1977. -Vol.167.-P.147−154.
  151. Raziuddin S., Kawasaki T. Biochemical studies on the cell wall lipopolysaccharides (O-antigens) of Vibrio cholerae 569B (Inaba) and El tor (Inaba) // Biochim. Biophys. Acta. 1976. — Vol.431. — P. 116−126.
  152. Raziuddin S. Structure-function relationship: biological activities of the lipopolysaccharides and lipid A from Vibrio cholerae // J. Infect. Dis. 1980. -Vol.140.-P.590−595.
  153. J.W. 4-aminosugars present in the lipopolysaccharides of Vibrio cholerae and related vibrios // Biochim.Biophys.Acta. 1978. — Vol. 584. — P.346−352.
  154. Redmond J.W. The structure of the O-antigenic side chain of the lipopolysaccharide of Vibrio cholerae 569B (Inaba) // Biochemica et Biophysica Acta. 1979. -Vol.584. — P.346−352.
  155. Rietschel E, T., Brade H. Bacterial endotoxins // Scientific American. 1992. — Vol.267. — P.26−33.
  156. Rietschel E.T. Bacterial endotoxins: structure activity relationships // 7th International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology Division.-Prague.-1994.- P. 174.
  157. Rietschel E.T., Brade H. Bacterial endotoxins // Sci. Am.- 1992. -Vol. 267, № 2. P.54−61.
  158. Rietschel E.T., Galanos C., Luderitz O., et al. The chemistry and biology of Lipopolysaccharides and their lipid A component // Immuno-pharmacology and regulation of leukocyte function. D. RWebb (ed.) Marsel Dekker Inc., New-York. 1982. — P. 183 -229.
  159. Saito T., Yukva K., Suruki T. Microorganism monitoring apparatus The patent. 466 185, CIIIA. The application. 24.12.84. № 685 309. Is published 28.04.87. MKHH 04. № 7/18.
  160. Sakai K. Dialisis membranes for blood. Purification. Departament of chemical enchinering- Waseda University, Tokio, Japan. // J. Biotechnol Bioeng. -2000. 2069 (4).-P. 429−39.
  161. Sakasaki R., Tamura K. Somatic antigen variation in Vibrio cholerae Jap. // J.Med. Sci. Biol. 1971. — Vol .24, № 2.- P.93−100.
  162. Scherer T., Schugerl K. Characterization of bacteriactors. By in situ fluoromdry. // J. Biotechnol. — 1986. Vol.3. № 4.- P. 221- 229.
  163. Seyser Hans Dieter. Chem.+ Anlag.+ Verfahren. — 1981. Vol. 14. № 6.-P. 19−20.
  164. Shimada T., Sakasaki R. A serogroup of non-01 Vibrio cholerae possessing the Inaba antigen of Vibrio cholerae 01 // J. Appl. Bacterid. -1988. Vol.64, № 2.-P. 141−145.
  165. Soltanich M., Gill W. N. Chem. Eng. Commun. 1981. Vol.12. — P. 279−363.
  166. Sourirajan S. Reverse osmosis. Academic Press New York. -1970.
  167. Sourirajan S. Reverse. Osmosis, logos London.-1970. P. 578.
  168. Thomas D.G. Dynamic membranes their technological and engineering aspekts, pp. 295 — 312. — In: Reverse Osmosis and Synthetic Membranes (ed. S. Sourirajan), National Research Council of Canada Publication No. 15 627. Ottawa. Canada. — 1977.
  169. Vogel J.H., Kroner K.H. Gesellschaft fur Biotechnologische Forschung mg H, Biochemical Engineebing Division, Mascheroder Weg 1, D -38 124 Braunschweig, Germay. // Biotechnol Bioeng. 1999. 63 (6). — P. 663 — 74.
  170. Warburg O., Christian W. Isolierung und Kristallisation des Garungsferments Enolase // Biochem.- 1941. -Vol. 310. P. 384−421.
  171. Weeldy epidemiological record. 2001. -Vol. 76, № 16. P. 117−124.
  172. Westphal O., Luderitz O., Bister R. Uber die extraktion von bacterien mit phenol // Wasser. Z. Naturforsh.- 1952.-Vol. 70.-S.148−155.
Заполнить форму текущей работой

Сессия? Спокойно!