Закономерности эксцизии транспозонов при действии излучений с разными физическими характеристиками

Актуальность исследования,.

Изучение проблемы индуцированного мутагенеза у прокариот при действии ионизирующих излучений служит необходимым фундаментом для интерпретации сложных механизмов, лежащих в основе мутационных процессов у высших организмов. С учетом этого, исследования закономерностей и механизмов мутагенного действия излучений с разной линейной передачей энергии (ЛПЭ) на бактериальные клетки представляются весьма актуальными (Е.А. Красавин и С. Козубек, 1991). Воздействие излучения индуцирует в «бактериальных клетках Escherichia coli ряд процессов, сопряженных с функционированием Л’ОЛ^-системы ответа на повреждающее воздействие: индукцию некоторых профагов и колицинов, ^(7Л-репарацию и ЗОЛ-мутагенез. При действии на клетки ДНК-повреждающих факторов репликация ДНК происходит с большим количеством, ошибок, вследствие снижения корректорских функций ДНК-полимеразы и, следовательно, становится причиной возникновения^{ОЯ-зависимых} мутаций.

К числу наименее изученных вопросов радиационной генетики прокариот относятся исследования закономерностей возникновенияструктурных мутаций: делеций, инсерций, и транслокаций. Это связано как с методическими трудностями выявления таких изменений * генетических структур, так и с относительно низкой частотой (по сравнению с генными мутациями) образования структурных мутаций. Закономерности индукции структурных мутаций у клеток прокариот излучениями? с высокой ЛПЭ практически не изучены. В клетках Е. coli структурные мутации с высокой частотой возникают при транспозиции мобильных элементов. Транспозиция является специфичным SOS-му тагенным процессомкоторый индуцируется химическими мутагенами, ультрафиолетовым светом, а также ионизирующей радиацией.

Показано, что точная эксцизия транспозонов является ЯОЯ-индуцибельным процессом, который происходит, по «мишенному механизму». Стрессовые состояния бактериальной клетки, индуцирующие^{OS-репарацию} ДНК и мутагенез, прямо влияют на частоту транспозиции мобильных элементов: КорреляцияSOS-мутагенеза и активности мобильных элементов позволила разработать оригинальный подход к изучению индуцибельных систем репарации ДНК и мутационного процесса у прокариот с использованием генетических систем, сконструированных на основе транспозонов (Г.И. Алешкин и др., 1983).

Такой подход позволил определить влияние ключевых генов Ä-AS-мутагенеза на индукцию точной эксцизии транспозона ТпЮ при действии УФ-излучения. Показано, что точная эксцизия находится под контролем Ä-AS-индуцибельных генов рекомбинационной репарации ДНК: ruvw recN (R. Nagel et.al., 1994; A. Chan et. al-, 1994). При облучении клеток, несущих мутацию гесА эффективность У Ф-индуци-рованной точной эксцизии резко снижается, так как ген является ключевым в реализации ?'О^-ответа (G.I. Aleshkin et. al., 1998). Оказалось, что точная эксцизия, ТпЮ в системе ?" О^-мутабильности происходит без участия транспозазы, поэтому консервативный механизм точной эксцизии в процессе транспозиции, которая происходит через внесение ступенчатых двунитевых разрывов не позволял определить закономерности эксцизии при индуцирующем воздействии УФ-света. Было продемонстрировано участие гесВС и recF-зависимых рекомбинационных процессов в индукции точной эксцизии транспозона ТпЮ (R. Nagel, 1999). Точная эксцизия транспозона, происходящая в условиях индукции Л’ОЛ'-ответа является классическим делеционным процессом, который? происходит при участии небольших па-линдромных последовательностей. Аналогичные закономерности были обнаружены в активных локусах с высоким выходом структурных перестроек, и в: этом смысле точная эксцизия транспозона может служить модельной системой для определения закономерностей формирования делеций.

В экспериментах с ускоренными тяжелыми ионами (Е.А.Красавин и С. Козубек, 1991) получен обширный материал по индукции прямых и обратных генных мутаций излучениями в широком диапазоне ЛПЭ. Бьшо показано, что зависимость частоты мутирования клеток от дозы у-квантов и тяжелых заряженных частиц описывается линейно-квадратичной функцией, для которойквадратичная компонента зависимости определяется эффективностью экспрессии генов, контролирующих SOS-ответ. Относительная биологическая эффективность (ОБЭ) частиц по критерию индукции мутаций увеличивается с ростом ЛПЭ и зависимость ОБЭ (ЛПЭ) описывается кривой с локальным максимумом при ЛПЭ «20 кэВ/мкм. Различие в положениях максимумов по критерию летального (~ 80−100 кэВ/мкм) и мутагенного эффектов облучения определяется разным характером событий, участвующих в формировании этих эффектов. Летальный эффект вызван образованием двунитевых разрывов (ДР) ДНК, а мутагенный эффект — кластерными однони-тевыми разрывами ДНК.

В отличие от генных мутаций, структурные мутации у клеток прокариот формируются в результате возникновения ДР ДНК. Соотношение выходов прямых двунитевых разрывов, как результат разрыва опозитных нитей при прохождении частицы и энзиматических ДР ДНК, возникающих в процессе Л’О^-репарации может обуславливать специфику образования мутаций делеционного типа при действии излучений с разной ЛПЭ. G учетом этих обстоятельств исследование эксцизии транспозонов при действии излучений широкого диапазона ЛПЭ может дать важную информацию об особенностях индукции структурных мутаций у бактерий ионизирующим излучением с разными физическими характеристиками.

Цель и основные задачи исследования.

Целью настоящего исследования является изучение закономерностей и механизмов ^О^-индуцибельной эксцизии транспозонов в клетках бактерии Escherichia coli при действии излучений с разными физическими характеристиками: ультрафиолетового света, у-излучения, и ускоренных тяжелых ионов с разной ЛПЭ. Для достижения поставленной: цели необходимо решить следующие основные задачи:

1. Исследовать характер индукции точной эксцизии транспозонов разных классов при облучении УФ-светом и определить роль структуры последовательности элемента в этом процессе.

2. Используя клетки, несущие мутации генов гес-семейства, определить зависимость индуцированной эксцизии транспозона 7и/0 от репарационного генотипа бактерий.

3. Изучить закономерности индукции точной эксцизии транспозона ТпЮ при облучении ускоренными ионами, в диапазоне ЛПЭ от 20 до 200кэВ/мкм в биологическом образце.

4. Оценить генетическую эффективность ускоренных ионов по критерию точной эксцизии ТпЮ и по критерию летального действия на клетки Escherichia coli.

5. Провести статистическое моделирование встраивания транспозона в новое положение и предложить механизм SOS-индуцибельной точной эксцизии транспозона при действии излучений разного качества.

Научная новизна.

Исследования закономерностей ЗОЯ-мутабильности клеток Escherichia coli при действии излучений с разными физическими характеристиками, с использованием в качестве тест-системы мобильные элементы позволяют предложить новый перспективный подход для изучения механизма возникновения структурных мутаций у бактерий. В настоящей работе впервые определены закономерности эксцизии транспозона Тл/0 при действии у-излучения. Показано, что у-индуцированная экс-цизия является SOS-мутагенным процессом, который контролируется генами гес-семейства. Впервые показана возможность индукции точной эксцизии транспозона ТпЮ ускоренными многозарядными ионами с разной ЛПЭ, изучены закономерности этого процесса. Определены значения относительной биологической и генетической эффективности ускоренных ионов 4Не и 12С по критериям летального действия и точной эксцизии транспозона Тп 10. Проведен оригинальный статистический. расчет мишенного встраивания транспозона Тп10 в новое положение, исходя из функции вероятности распределения мишеней в геноме Escherichia coli, и построена модель, описывающая механизм точной эксцизии транспозонаТпЮ, как Л’О^-индуцируемого мишенного делеционного явления:

Научно-практическая значимость работы.

При решении ряда научно-практических задач радиационной генетики весьма важно иметь информацию не только о суммарном выходе различного рода мутаций в облученных клетках^ но исключительный интерес представляют сравнительные данные о частоте образования как генных, так и структурных мутаций. Эти задачи обусловлены необходимостью решения вопросов нормирования лучевых нагрузок от излучения разного качества на персонал, работающий в смешанных полях ионизирующих излучений, проблемам обеспечения радиационной безопасности экипажей при длительных космических полетах, другим важными практическим вопросами. Полученные данные представляют несомненный научный интерес при интерпретации механизмов мутагенного влияния излучений широкого диапазона ЛПЭ на клетки с разным генотипом. Результаты исследования могут быть использованы при разработке нормативных документов, связанных с обеспечением радиационной безопасности лиц, находящихся в условиях многокомпонентного радиационного воздействия.

Положения и результаты, выносимые на защиту:

1. закономерности радиочувствительности бактерий Escherichia coli при действии излучений широкого диапазона ЛПЭ;

2. закономерности у-индуцированной эксцизии транспозона ТпЮ в клетках Escherichia coli с различным репарационным генотипом;

3. дозовые зависимости точной эксцизии транспозона ТпЮ при ультрафиолетовом облучении клеток с мутациями в разных локусах генов re с;

4. результаты исследования закономерностей точной эксцизии ТпЮ при облучении ускоренными тяжелыми ионами с разной ЛПЭ и определение относительной биологической эффективности ускоренных ионов по критерию летального действия и точной эксцизии ТпЮ.

5. статистическое моделирование мишенного встраивания транспозона и модель точной эксцизии ТпЮ при облучении ускоренными ионами.

Выводы.

11 Изучена радиочувствительность бактерий Escherichia coli и репарацион-но-дефицитных мутантов recA, recN, гесО, и recQ при действии излучений с разными физическими характеристиками. Показано, что мутация гесА при облучении ультрафиолетовым светом и у-квантами в ряду рассмотренных гее-мутаций оказывает наибольшее влияние на чувствительность клеток. Зависимость радиочувствительности клеток дикого типа от ЛПЭ излучений описывается кривой с локальным максимумом в области ~ 100 кэВ/мкм.

2. Исследованы закономерности эксцизии транспозонов ТпЮ и Тп1 у клеток дикого типа. Показано, что УФ-свет и у-излучение являются эффективными индукторами эксцизии транспозонов. При у-облучении относительная > частота эксцизии транспозона ТпЮ зависит от условий предрадиационного культивирования: в богатой питательной среде эксцизия транспозона осуществляется более эффективно, по сравнению с минимальной средой.

3. Изучено влияние мутаций гесА и recN на частоту эксцизии ТпЮ при уи УФ-облучении клеток. Показано, что в обоих случаях указанные мутации подавляют эксцизию транспозона, в клетках с п? сЛ мутацией дозовая зависимость частоты эксцизии не выявляется.

41 В широком диапазоне ЛПЭ излучений (0,3−200 кэВ/мкм) исследованы закономерности точной эксцизии транспозона ТпЮ. Выявлено, что с ростом ЛПЭ частиц эффективность точной эксцизии возрастает, в диапазоне 20−40 кэВ/мкм, достигает максимума, а при дальнейшем увеличении ЛПЭ — снижается.

5. Получены значения относительной биологической эффективности тяжелых ускоренных частиц по критерию летального действия и точной эксцизии ТпЮ. Максимальные значения ОБЭ излучений составили 1,9 ± 0,5 и 2,4 ± 0,6 соответственно.

6. Проведено статистическое моделирование встраивания, транспозона ТпЮ и построено распределение вероятности встраивания. Найдена наиболее вероятная мишень: CGCTCAGC.

7. Предложена молекулярная модель, описывающаяиндуцированную точную эксцизию транспозона:

Признательность.

В заключении хотел бы выразить глубокую признательность за любезное предоставление штаммов Escherichia coli Бактериальному музею Отделения молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики РАН, а также лично д.б.н. Г. Н. Алешкину, Институт иммунологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалея.

Выражаю искреннюю благодарность своим наставникам: А. П. Булаху и к.б.н. A.B. Борейко за консультативную помощь при проведении экспериментов с ускоренными тяжелыми ионами на базовых установках Объединенного института ядерных исследований, а также студенткам Университета «Дубна» A.B. Можаевой и Е. Ю. Козловой, как соавторам и коллегам по проведению некоторых экспериментов с УФ-излучением. Все результаты проходили первую апробацию через Научную конференцию молодых ученых и специалистов ОИЯИ, что было бы невозможным без деятельного участия организаторов — членов совета ОМУС.

Выражаю свою признательность за консультацию и редакторские замечания старшим коллегам по кафедре физики Университета «Дубна» проф. С. А. Хорозову и проф. И. М. Граменицкому. Finally, I would like to thank Dr R. Nagel (CEFYBO, Buenos Aires, Argentina) for providing author’s paperscripts, which were very useful in the section of the discussions.