Термодинамическая совместимость желатины с анионными и неионными полисахаридами в водном растворе

Термодинамическая несовместимость характерна для систем, содержащих два полимера в общем растворителе. Большинство работ в этой области посвящено изучению поведения синтетических и модифицированных природных (производных целлюлозы) полимеров технического назначения в связи с задачей их переработки.

Сведений о термодинамической несовместимости биополимеров существенно меньше. Однако, они имеют научное и практическое значение как для выяснения закономерностей формирования структуры и свойств пищевых систем (жидких и телеобразных), так и для разработки научных основ технологий выделения, концентрирования и переработки белков и полисахаридов в новые формы пищи. За структуру, механические и другие физико-химические свойства многокомпонентных пищевых систем в наибольшей мере ответственны белки и полисахариды. Будучи важнейшими пищевыми гелеобразователями, загустителями, стабилизаторами эмульсий и пен, они выполняют в пищевых системах ключевые структурные функции. На структурные функции белков и полисахаридов сильное влияние оказывает характер их взаимодействия между собой и с другими компонентами пищевых систем.

Взаимодействие белков и полисахаридов может приводить к трем основным последствиям: их сорастворимости, несовместимости и комплексообразованию. Ввиду полимерной природы белков и полисахаридов, а также наличия в их макромолекулах разнообразных функциональных групп, сораствориыость этих компонентов пищевых систем — наименее типичная ситуация. Поэтому основное внимание уделяется изучению двух типов взаимодействий, связанных с притяжением или отталкиванием макромолекул биополимеров и, соответственно, обеспечивающих либо комплексообразование, либо термодинамическую несовместимость этих биополимеров.

Важным фактором, определяющим характер взаимодействия белков и полисахаридов, является химическая природа полисахаридов. Она влияет на совместимость биополимеров 'в смеси, определяя интенсивность межмолекулярных взаимодействий (полимер-полимер, полимер-растворитель). Трудности исследования влияния структуры полисахаридов на их термодинамическую совместимость с белками определяется в значительной мере сложностью получения полисахаридов с одинаковой молекулярной массой и разной структурой, т. е. сложностью направленного регулирования структуры полимеров. В то же время направленное изменение структуры полимеров (например, путем заряжения, т. е. увеличения плотности заряда) — это один из перепективных путей регулирования термодинамической совместимости полимеров в общем растворителе. Однако, беспорным остается то, что ключом к пониманию особенностей термодинамической совместимости биополимеров, особенностей фазового равновесия в системах вода-белок-полисахарид является характеристика межмолекулярного взаимодействия между всеми смешиваемыми компонентами (полимер-полимер, полимер-растворитель).

В этой связи в литературном обзоре мы считаем целесообразным уделить особое внимание рассмотрению некоторых термодинамических аспектов совместимости полимеров в присутствии растворителя, а также влиянию химической природы полимеров на их совместимость в общем растворителе. Представляет интерес рассмотреть особенности фазовых равновесий в системах полимер-полимер-растворитель как с позиций теоретических представлений, базирующихся на классической теории Флори-Хаггинса, так и в свете положений новых теорий, получивших развитие в последние годы.

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

б. В ы В О д ы.

Впервые исследовано влияние структурных особенностей полисахаридов (природы и концентрации функциональных групп, характера распределения их по цепи, блочного состава, молекулярной масг сы) на их термодинамическую совместимость с желатиной, находящейся в состоянии статистического клубка, и в спиральном агрегированном состоянии. При этом было установлено, что:

1. Условия несовместимости (рН, ионная сила) зависят от ионогенных свойств полисахаридов (анионные или неионные) и не зависят от состояния молекул желатины в растворе.

2. Характерными особенностями фазовых диаграмм данных систем являются низкие величины критических параметров расслоения (пороговой и критических точек, пределов сорастворимости) и слабая асимметрия, свидетельствующие о более низкой совместимости полисахаридов с желатиной, а также об относительно более высокой гид-рофилъности желатины, по сравнению с глобулярными белками, характеризующимися меньшим.: чем желатина исключенным объемом.

3. Совместимость желатины с анионными полисахаридами увеличивается с повышением степени этерификации и локальной концентрации с ложно эфирных групп в молекуле пектина, с возрастанием содержания смешанных блоков (маннуроновая-гулуроновая кислот) в молекуле альгината и с ростом концентрации карбоксиметильных групп в молекуле карбоксиметилцеллюлозы. Совместимость желатины с анионными полисахаридами определяется в основном ионной силой, в меньшей степени рН, температурой и концентрацией макромолеку-лярных компонентов. Совместимость желатины с неионными полисахаридами растет при переходе от линейной метилцеллюлозы к разветвленному декстрану, и от желатины зв спиральном агрегированном состоянии к желатине, находящейся в состоянии статистического клубка, и уменьшается пропорционально изменению молекулярной массы полисахарида в степени 0,5.

На примере смесей водных растворов желатины и анионного полисахарида (пектина) и желатины и неионного полисахарида (декст-рана) изучено влияние характера межмолекулярных взаимодействий типа белок-полисахарид, белок-растворитель, полисахарид-раствори тель на термодинамическую совместимость и фазовые равновесия. Показано, что:

4. Совместимость биополимеров, вероятно, обусловлена образо ванйем между ними слабых комплексов, которые могут быть разрушены при повышении концентрации соли и температуры системы, в то время как термодинамическая несовместимость в основном обусловле на эффектом исключенного объема (определяемого размером и формой мащюмолекул), а также различием полимеров в сродстве к раствори телю.

Изучено влияние степени этерификации пектина на его совместимость с белками обезжиренного молока. Установлено, что:

5. С повышением степени этерификации пектина его совместимость с белками обезжиренного молока возрастает аналогично тому, как это имеет место для смесей водных растворов желатины и пектина. Предположено, что увеличение совместимости в этих системах при возрастании степени этерификации пектина может быть обусловлено образованием слабых растворимых белково-полисахаридных комп лексов, стабилизированных водородными связями.

На основе данных по фазовым равновесиям в системах вода-белки обезжиренного молока — карбоксиметилцеллюлоза разработан процесс концентрирования белков молока, прошедший стадию опытной апробации в НПО «Мир» (г.Москва).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Накоплен большой экспериментальный материал о термодинамической несовместимости биополимеров. Достаточно широко исследованы условия термодинамической несовместимости, фазовые равновесия, а также влияние на них основных физико-химических факторов (рН, ионной силы, температуры и т. п.) в смесях водных растворов, содержащих глобулярные белки и различные по природе полисахариды / 88−50, 92−95). Показано, что важным фактором, определяющим условия термодинамической несовместимости в этих системах I является химическая природа полисахарида. Однако, основной недостаток этих работ в том, что выбранные в качестве объектов иссле дования полисахариды отличались между собой сразу несколькими структурными факторами. Систематические данные о влиянии направленного регулирования структуры макромолекул полисахаридов (изме нение концентрации функциональных групп, характера их распределе ния по цепи и т. д.) на совместимость их с белками отсутствуют. В то же время направленное изменение структуры полимеров,(например, увеличение плотности заряда одного из смешиваемых полимеров путем повышения концентрации его ионногенных групп) в существен ной степени изменяет термодинамическую совместимость полимеров и является одним из перспективных направлений в регулировании их совместимости. Кроме того, ограничены также сведения о влиянии полисахаридов различной природы на совместимость их с белками неупорядоченной конформации /85 /. К такого рода белкам относят с я белки, широко используемые в пищевой промышленности , — желатина и казеин.

В связи с этим представлялось необходимым систематически исследовать влияние локальных изменений структуры макромолекул полисахаридов на термодинамическую совместимость и фазовые равновесия в системах вода-белок-полисахарид, содержащих белки с неупорядоченной конформацией.

Целью работы было изучение влияния структурных особенностей полисахаридов (природы и концентрации функциональных групп, характера распределения их по цепи, молекулярной массы) на термодинамическую совместимость и фазовые’равновесия в модельных системах, содержащих в качестве белкового компонента желатину в мо-лекулярно-дисперсном (при 40°С) и коллоидно-дисперсном состоянии (при 18°С), а также полисахариды различной природы, имеющие научную и практическую ценность.

Для исследования были выбраны линейные анионные полисахариды — пектины36 с разной степенью этерификации и характером распределения сложноэфирных групп, альгинаты* с различным содержанием блоков ма ннур оно во й-гулур о, но во й и гулуроновой-гулуроновой кислот, карбоксиметилцеллюлоза^ разной степени замещения (концентрации кар б о кс и ме т и ль ных групп) и неионные полисахариды — линейная ме-тилцеллюлоза и разветвленный декстран.

Задача работы состояла такие в изучении влияния на фазовые равновесия в системах вода-белбк-полисахарид важнейших физико-химических факторов (рН, ионная сила, температура), характерных для начальных стадий процесса выделения и концентрирования белков из растворов и суспензий, а также переработки белков в смесях с другими белками и полисахаридами. При этом полагали, что используя препараты относительно высокомолекулярного пектина (М^ЗЗОкД, степень этерификации 62,7%)' можно получить сведения о влиянии на х В работе были использованы пектинаты натрия, альгинаты натрия и нариевая соль карбоксиметилцеллюлозы, которые для шаткости будем называть соответственно пектинами, альгинатами, карбокси-метилцеллюлозой совместимость основных физико-химических факторов (концентрации макромолекулярных компонентов, рН, ионной силы и т. д.)" в то время, как применяя относительно низкомолекулярные пектины (М^= 22−25 цД) с разной степенью этерификации и блочным или статистическим характером распределения свободных карбоксильных и сложноэфирных групп, можно получить сведения о влиянии сил электростатической и неэлектростатической природы на термодинамическую совместимость в системах вода-белок-полисахарид.

Используя альгинаты с различным содержанием блоков маннуро-новой-гулуроновой и гулуроновой-гулуроновой кислот, а также карбоксиметилцеллюлозу разных степеней замещения, предполагали изучить влияние соответственно гибкости цепи и плотности заряда анионных полисахаридов на их совместимость с желатиной.

2, ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Объекты исследования 2.1.1. Желатина.

Желатина — водорастворимый продукт деструкции нерастворимых в воде коллагеновых волокон. Структура и физико-химические свойства желатины подробно рассмотрены в / 1X2 /. Аминокислотный состав ее необычен для белков. Примерно одну треть всех аминокислот ных остатков составляют остатки глицина, имеется большое число остатков пролина. Кроме того, встречаются остатки двух, а мин о кислот, обычно не обнаруживаемых в белках — гидроксипролин и гидроксилизин. В водных растворах при температуре выше 30−40°С желатина принимает конформацию статистического клубка / 113 /.Кислотные и основные группы боковых цепей аминокислот придают желатине свойства полиэлектролита.

В работе использовали препарат щелочной желатины марки «Фото». Молекулярная масса желатины, определенная по данным упругого светорассеяния в условиях рН 3,5- I = 0,01, составила 90 вД Изоэлектрическую точку желатины определяли путем осаждения желатинь! этанолом из ряда разбавленных растворов, имеющих значение рН от 4,0 до 5,5, согласно / 114 /. Она составила 4,75.

Для работы желатину очищали от примесей низкомолекулярных веществ по Лёбу /115 /. Очистка представляла собой последователь ный диализ желатины сначала против разбавленного раствора уксусной кислоты, а затем — дистиллированной воды. Продолжительность очистки 3−4 часа, после чего гранулы набухшей желатины отделяли от воды фильтрованием через капроновую ткань и гомогенизировали при 40 °C в течение I часа. В качестве антисептика в полученный раствор вносили следы азида натрия. Ранее Гринбергом / 89 / было показано, что свойства желатины, очищенной по Лёбу, и желатины после исчерпывающего электродиализа практически не отличаются. Концентрированные гели желатины (10−15%) хранили при 5 °C в течение 10−12 дней. Эти гели использовали в качестве исходного материала для получения желатины в молекулярно-и коллоидно-дисперсных состояниях.

2.1.2. Белки обезжиренного молока.

Б состав обезжиренного молока входят 2 белковые фракции: казеин и сывороточные белки / 116,11? /.

Казеином называют основную фракцию белка молока (80−83% общего белка), осаждающуюся из обезжиренного молока при рН А, 6 и температуре 20 °C. Казеин представляет собой гетерогенную группу фосфопротеидов. Основными компонентами казеина являются и Эб—казеин. В сумме они составляют около 95% казеиновой фракции белков молока. В молоке 75−98% казеина находится в составе крупных коллоидных частиц — мицелл. Остальные 10−20% казеина присутствуют в молоке в растворенном виде. Мицеллы казеина имеют размеры около 50−300 нм и массу Д. Каждая мицелла состоит из субъединичных мицелл размером 10−20 нм и массой 6.10^ Д, содержащих обычно 25−30 молекул $ -иказеина (соотношение 3:2:1).

Ведущую роль в стабилизации мицелл играет ^ -казеин.

Белки обезжиренного молока, остающиеся в растворе после осаждения казеина, называют сывороточными белками и составляют они 20% всех белков молока. Основными (70−80% общего белка молочной сыворотоки являются $ -лактоглобулин и ^ -лактоальбумин. Кроме этих белков в сыворотке присутствуют альбумин сыворотки крови, иммуноглобулины, протеозопептоны, а также другие белки в меньших количествах.

Белки обезжиренного молока характеризуются высокой биологической ценностью. Они содержат лизин и триптофан в относительно избыточных количествах наряду с небольшим недостатком серосодержащих аминокислот. Белки сыворотки содержат незаменимые аминокис лоты в значительно больших количествах, чем казеин, включая обыч, но наиболее дефицитные в рационах питания лизин, триптофан и серосодержащие аминокислоты. Это белки — одни из наиболее биологически ценных.

2.1.3. Пектин.

Пектин относится к полисахаридам растительных тканей. Основ ным структурным элементом макромолекулы пектина является галакто пиранозилуроновая кислота (полигалактуроновая), состоящая из ли нейного 1-^4 соединенного // - Д — галактурона (рис.4). со*н он согн он} он он он со, н.

1Ь он — Д — галактурон Рис. 4.

Большая часть карбоксильных групп полигалактуроновой кисло' ты этерифицирована метанолом, а некоторые гидроксильные группы в положении С-2 и С-3 могут быть этерифицированы уксусной кисло той / 118 /. Кроме того, в состав пектинов входят нейтральные углеводы, главным образом арабиноза и галактоза. Степень этерифи-кации и характер распределения сложноэфирных групп в макромолекуле пектина в существенной степени влияет на ряд его физико-химических свойств: растворимость / 119 /, способность к гелеобразованшо / 119−122 /, а также поверхностную активность / 123,124 /. Термодинамическая гибкость макромолекулы пектина экстремально зависит от степени этерификации. Максимальная гибкость у пектинов со степенями этерификации 43 и 58% / 119,125−127 /.

Растворимость пектинов в воде увеличивается с понижением молекулярного веса и увеличением степени этерификации.

Раствор пектина наиболее стабилен при рН 3−4. Отклонение рН как в кислую, так и в щелочную область от этого значения приводит к уменьшению плотности заряда макромолекулы пектина, причем это уменьшение наиболее сильно выражено при повышении температуры (выше 50°С).

Пектины высоких степеней этерификации способны к гелеобразо-ваиию в кислой среде в присутствии сахарозы, а пектины низких степеней этерификации — в присутствии солей поливалентных металлов.

Б связи с тем, что пектины физиологически инертные вещества и способны к гелеобразованию, а также связыванию солей поливалентных металлов, они нашли широкое применение в кондитерской промышленности и при изготовлении продуктов лечебного питания.

Б работе использовали следующие препараты пектинов: х а) пектины3®разной степени этерификации со статистическим распределением сложноэфирных группэе В работе использовали пектинаты натрия, которые для краткости будем далее называть пектинами, хх Препараты пектина разной степени этерификации со статистичеб) пектины*35 разной степени этерификации с блочным распределением сложноэфирных группв) коммерческий препарат яблочного пектина фирмы «(» Ы^О/.п партии № 76 282 (Швеция) со степенью этерификации 62,7%.

Основные характеристики использованных препаратов пектина приведены в таблице I.

Препараты пектина разной степени этерификации со статистическим характером распределения сложноэфирных групп получены из коммерческого препарата пектина С^п-ы^ Ре, о>к1>П'- Мб (?импь.

ИьрМ Л Яок-Шм Рвскт^киС, (Я&п-тьгк) со степенью этерификации 93% методом щелочной деэтерификации, приводящей практически к статистическому распределению свободных карбоксильных и сложноэфирных групп в макромолекуле пектина Д2.8/. Препараты пектина разной степени этерификации и блочным распределением сложноэфирных групп были получены методом контролируемой деэтерификации под действием пектинэстеразы, выделенной из помидоров.

Характер распределения сложноэфирных групп в молекуле пектинов был определен на основе индивидуальных коэффициентов активности ионов кальция (), полученных в растворах пектинатов кальция концентрации 3,0 моль/л спектрофотометрическим методом / 129,130 /. Содержание карбоксильных групп определяли методом осаждения пектинов медью. Содержание меди в осадке оценивали титским и блочным распределением сложноэфирных групп, а также их физико-химические характеристики (содержание и характер распределения функциональных групп, молекулярная масса и др.) получены в институте органической химии Словацкой АН и любезно предоставлены в наше распоряжение.