Высокоантагонистические штаммы лактобацилл, перспективные для конструирования новых пробиотических препаратов

Актуальность темы

.

В настоящее время в медицинской практике широко применяются пробиотические препараты, изготовляемые на основе штаммов лактоба-цилл. Пробиотические бактерии должны обладать набором свойств, позволяющих им конкурировать с патогенными и условно-патогенными микроорганизмами. К таким признакам относятся: антагонистическая активность, способностью к адгезии к эпителиоцитам кишечника, активность кислотообразования, определенный уровень резистентности к соляной кислоте и желчи, отсутствие факторов патогенности, т. е. безопасность при применении (Бондаренко В.М., Воробьев А. А., 2004). Известно, что представители рода Lactobacillus способны синтезировать антимикробные вещества, ассоциированные с синтезом бактериоцинов. Бактериоцины представляют собой комплексы, составной частью которых является белковый или полипептидный компонент, ответственный за бактерицидную активность. В отличие от антибиотиков, бактериоцины имеют сравнительно узкий спектр действия, направленный против родственных видов (Блинкова Л.П., 2003, Рыбальченко О. В. и др., 2006, Jack R.W., 1995, Ja-muna М., 2004).

В зависимости от штамма-продуцента, химической природы, способа воздействия на бактериальную клетку выделяют несколько групп бактериоцинов: 1) лантибиотики — это бактериальные термостабильные полипептиды молекулярной массы (ММ) от 3 до 7 кД, 2) микроцины — термостабильные пептиды низкой ММ 1,0 -2,0 кД, 3) высокомолекулярные термолабильные протеины ММ от 10 до 5000 кД и 4) комплексы протеинов, для проявления антимикробной функции которых необходимы углеводная или липидная составляющие (Петров JI.H. и др., 2006, Вахитов Т. Я. и др., 2006).

Описаны различные типы антибиотикоподобных полипептидов (бак-териоционов и микроцинов, в том числе: блокирующих белковый синтез в микробных клетках (микроцины А15, Al7, С 7, С51), подавляющих репликацию ДНК (микроцин В17, D93), ингибирующих транспорт лейцина и пролина (микроцины D140, D15), — изменяющих мембранный потенциал клетки (микроцин Е492), нарушающих процессы деления клетки (микроцин J25) или проницаемость бактериальной цитоплазматической мембраны, путем образования пор (Хмель И.А., 1999, Бондаренко В. М., 2006).

В связи с этим актуальной является селекция штаммов лактобацилл, синтезирующих микроцины с широким спектром антагонистической активности.

Цель исследования:

Целью настоящей работы явилось выделение, идентификация и изучение высокоантагонистически активных штаммов лактобацилл, продуцирующих бактериоциноподобные вещества с широким спектром антимикробного действия, перспективные для создания новых пробиотиче-ских препаратов.

Задачи исследования:

1. Выделить бактерицинпродуцирующие высокоантагонистические штаммы лактобацилл из кишечника здоровых детей и взрослых и провести их биохимическую идентификацию до вида с подтверждением при помощи полимеразной цепной реакции с видоспецифиче-скими праймерами, амплифицирующими последовательности гена 16S рРНК.

2. Определить спектр антимикробной активности, адгезивную и кислотообразующую способность бактерицинпродуцирующих штаммов лактобацилл.

3. Разработать комплексные подходы оценки безвредности потенциальных пробиотических штаммов лактобацилл по выявлению признаков, ассоциированных с наличием ферментов патогенности, определяемых в системе in vitro.

4. Определить чувствительность бактерицинпродуцирующих штаммов лактобацилл к желчи, соляной кислоте и антимикробным препаратам и характер взаимных отношений между выделенными и производственными пробиотическими штаммами бактерий различных таксономических групп. Научная новизна работы:

1. Выделены высокоантагонистические бактериоциногенные штаммы лактобацилл, подавляющие различные виды грамположительных и грамотрицательных патогенных и условно патогенных бактерий и грибов рода Candida.

2. Обоснована необходимость комплексного изучения апатогенно-сти изолятов, критериями отбора которых являются отсутствие гемолитической, протеолитической (желатиназной и казеинолитической), лецити-назной, гиалуронидазной, антилизоцимной, ДНК-ной и РНК-ной активности, определяемых in vitro.

3. Получена коллекция бесплазмидных высокоантагонистических бактериоциногенных штаммов лактобацилл, устойчивых к физиологической концентрации соляной кислоты и желчи, обладающих чувствительностью к ряду одних и резистентностью к ряду других химиотерапевтиче-ских препаратов, антибиотиков и хитозану.

4. Показана совместимость выделенных высокоантагонистических штаммов лактобацилл с бактериями производственных штаммов L. plantarum 8RA-3, L. fermentum 90−4Т, L. acidophilus 75D, B. bifidum 1 и Enterococcus l’aecium SF68.

5. Впервые выявлена ростстимулирующая активность 0,6% соляной кислоты в отношении антагонистически активных штаммов лактобацилл и энтерококков.

Практическая значимость.

Установлено, что бактериоциногенные штаммы лактобациллы, выделенные из фекалий здоровых детей, обладают высокой антагонистической активностью в отношении патогенной и условно патогенной микрофлоры, не обладают признаками патогенности и могут быть использованы для разработки на их основе новых препаратов пробиотиков.

Показано, что антагонистически активные бесплазмидные штаммы лактобацилл обладают резистентностью к широкому спектру антимикробных препаратов, что открывает возможность их использования в комплексной терапии заболеваний, осложненных дисбактериозом кишечника.

Показано, что антагонистически активные штаммы лактобацилл не оказывают ингибирующего влияния на нормальную микрофлору кишечника и могут быть использованы совместно с другими препаратами про-биотиками, содержащими лактобациллы, бифидобактерии и энтерококки.

Положения, выносимые на защиту.

Выделенные высокоантагонистические бактериоциногенные апато-генные, резистентные к соляной кислоте и желчи штаммы лактобацилл, подавляющие патогенную и условно патогенную микрофлору, могут быть использованы в качестве основы для создания новых эффективных препаратов пробиотиков. Штаммы лактобацилл с широким спектром антимикробной активности, обладающие высокой чувствительностью к ряду антибиотиков и биологически совместимые с известными пробиотическими штаммами бактерий различных таксономических групп, могут быть использованы для конструирования производственных консорциумов для комплексной терапии различных заболеваний ЖКТ.

Внедрение результатов в практику.

По материалам диссертации было составлено пособие «Дисбакте-риозы кишечника и их коррекция». Экспресс метод определения степени дисбактериоза кишечника защищен патентом и внедрен в практику работы бактериологической лаборатории кафедры микробиологии Тверской.

ГМА. Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО Тверской ГМА МЗ РФ. Апробация работы.

Основные положения работы были доложены на заседании Тверского отделения научно-практического общества микробиологов, эпидемиологов и паразитологов совместно с региональными научными обществами инфекционистов и иммунологов в марте 2005 г. (г.Тверь), на научной конференции клинических микробиологов в мае 2005 г. (г.Москва), на выездной сессии Всероссийского общества гастроэнтерологов ноябрь 2005 г. (г.Тверь). Публикации.

По теме диссертации опубликованы 15 печатных работ в местной и 2 в центральной печати, получен патент на 1 изобретение (Бондаренко В.М., Виноградов В. Ф., Червинец Ю. В. «Способ определения казеиноли-тической активности микроорганизмов при экспресс диагностике дисбак-териоза кишечника» Патент на изобретение № 2 235 324 от 25 августа 2004 г.) и 1 методическое пособие (Червинец В.М., Виноградов В. Ф., Смирнова Л. Е., Червинец Ю. В., Бондаренко В. М. Дисбактериоз кишечника: современные аспекты изучения проблемы, принципы диагностики и лечения. — Тверь, 2004, — 24 с.) Структура диссертации.

Выводы:

1. Из фекалий 177 практически здоровых детей в возрасте 7−15 лет выделено и идентифицировано 20 высокоантагонистических штаммов лактобацилл с широким спектром антимикробной активности по отношению к патогенным и условно патогенным бактериям родов Staphylococcus, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Escherichia, Bacillus и грибам рода Candida.

2. Индикаторные культуры В. subtilis и Р. aeruginosa проявили чувствительность к бактериоцинной продукции 75% лактобацилл, St. aureus и S. typhimurium 415- к 60%, Е. coli — к 55%, Sh. sonnei — к 45%, С. albicans — к 10%- культура Р. aeruginosa оказалась чувствительной к мик-роцинной активности 40% лактобацилл, Е. coli — к 30%, S. typhimuriumк 25%, С. albicansк 15%, Sh. Sonnei и St. aureus — к 10% лактобацилл.

3. Выделенные антагонистически активные штаммы фенотипи-чески апатогенны, т. е. не обладали гемолитической, протеолитической, летициназной, гиалуронидазной, антилизоцимной, ДНК-ной и РНК-ной активностью, средний показатель адгезии составлял 2,54±1,19.

4. При исследовании чувствительности к антибиотикам выявлено, что 5 антагонистически активных штамма лактобацилл чувствительны к следующим антибиотикам: бензилпенициллин, хлорамфеникол, ампициллин, тетрациклин, амоксициллин, фромилид (кларитромицин), карбе-нициллин, эритромицин, левомицетин, бициллин-3, ванкомицину. К стрептомицину, мономицину, рифампицину и сульфодиметоксину был чувствителен только один штамм.

5. Для большинства штаммов лактобацилл минимальная ингиби-рующая концентрация соляной кислоты составила 1,25%. При исследовании чувствительности лактобацилл к желчи было выявлено, что при любой концентрации желчи наблюдалась стимуляция роста лактобацилл.

Наибольшими концентрациями желчи, стимулирующими рост лактоба-цилл, являлись: 0,625%, 2,5%, 5% и 10%, наименьшими — 1,25% и 20%.

6. Кислотопродуцирующая способность бульонных культур лак-тобацилл колебалась от 2 до 52 °Т в первые сутки, от 14 до 60 °Т в течение вторых суток и к третьим суткам составляла от 28 °Т до 52 °Тглюкоза, после добавления ее в питательную среду, незначительно стимулировала продукцию молочной кислоты лактобациллами.

7. Селекционированные высокоантагонистические штаммы лак-тобацилл не обладают антагонизмом в отношении исследуемых производственных штаммов пробиотиков, устойчивы к действию соляной кислоты и желчи и обладают высокой степенью кислотообразования, что позволяет отнести их к пробиотическим, производственно перспективным.

Практические рекомендации.

1. Обоснована необходимость комплексного изучения биологических свойств и установлены в системе in vitro критерии отбора пробиоти-ческих штаммов рода Lactobacillus, которые могут быть использованы в качестве основы для создания новых бактерийных препаратов.

2. Перспективными являются бактериоциногенные высокоантагонистические штаммы лактобацилл с широким спектром антимикробной активности по отношению к патогенным и условно патогенным микроорганизмам, не оказывающие ингибирующего действия на нормальную микрофлору кишечника и на микроорганизмы, содержащиеся в составе других пробиотиков.