Помощь в написании студенческих работ
Антистрессовый сервис

Атомно-силовые чипы для выявления маркеров заболеваний вирусными гепатитами B и C

Диссертация: Атомно-силовые чипы для выявления маркеров заболеваний вирусными гепатитами B и C
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

В настоящее время основными методами детекции серологических маркеров заболеваний вирусными гепатитами являются иммуноферментный анализ (ИФА) и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Эти методы зарекомендовали себя как высокоспецифичные и чувствительные. Однако, диагностика инфекционных заболеваний на ранних стадиях (на которых не проявляются клинические симптомы заболевания) с помощью тест-систем… Читать ещё >

Атомно-силовые чипы для выявления маркеров заболеваний вирусными гепатитами B и C (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Содержание

  • Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
    • 1. 1. Вирус гепатита В
    • 1. 2. Лабораторная диагностика вирусного гепатита В
    • 1. 3. Вирус гепатита С
    • 1. 4. Лабораторная диагностика вирусного гепатита С
    • 1. 5. Основы метода АСМ
    • 1. 6. Колебательные методики АСМ
    • 1. 7. Примеры применения АСМ для исследования 34 биологических объектов
    • 1. 8. Способы иммобилизации биологических макромолекул 39 на подложки АСМ
  • Глава 2. АППАРАТУРА И МЕТОДИКИ 46 ИССЛЕДОВАНИЯ
    • 2. 1. Использованные реактивы
    • 2. 2. Характеристика исследуемых биологических объектов
    • 2. 3. АСМ Solver Р47Н и зондовая нанолаборатория NTEGRA
    • 2. 4. Получение АСМ-изображений
    • 2. 5. Обработка АСМ-изображений
    • 2. 6. Методика модификации подложки АСМ
    • 2. 7. Методика приготовления образцов
      • 2. 7. 1. Нековалентная иммобилизация белков на подложки АСМ
      • 2. 7. 2. Ковалентная иммобилизация моноклональных антител
      • 2. 7. 3. Получение комплексов HBsAg с антителами против него 54 на поверхности АСМ-чипа
      • 2. 7. 4. Получение комплексов HCVcoreAg с антителами против 55 него на поверхности АСМ-чипа
      • 2. 7. 5. Фишинг HBsAg и HCVcoreAg из сывороток крови людей
  • Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
    • 3. 1. Выявление маркера вирусного гепатита С
      • 3. 1. 1. Иммобилизация моноклональных антител против 57 HCVcoreAg на подложку АСМ
      • 3. 1. 2. Детекция HCVcoreAg в растворе
      • 3. 1. 3. Детекция HCVcoreAg в сыворотках крови людей
      • 3. 1. 4. Анализ сывороток крови на содержание HCVcoreAg с 67 помощью АСМ-чипов
    • 3. 2. Выявление маркера вирусного гепатита В
      • 3. 2. 1. Иммобилизация моноклональных антител против HBsAg 76 на подложку АСМ
      • 3. 2. 2. Детекция HBsAg в растворе
      • 3. 2. 3. Анализ сывороток крови на содержание HBsAg с 82 помощью АСМ-чипов

Актуальность.

Создание диагностических систем нового поколения является одним из приоритетных направлений современных медицинских исследований. Настоящая диссертационная работа посвящена созданию высокочувствительного молекулярного детектора на базе АСМ для выявления маркеров вирусных частиц гепатитов В и С в сыворотке крови.

Актуальность диагностики вирусных гепатитов В и С обусловлена широкой распространенностью этих заболеваний и их ростом в последние годы. Высокий уровень хронизации с возможным исходом в цирроз и первичный рак печени, и частое поражение лиц молодого возраста также обуславливают повышенное внимание к вирусным гепатитам, актуальность и важность подбора рациональных методов диагностики, лечения и профилактики. По данным ВОЗ вирусом гепатита В инфицировано около 2 миллиардов человек в мире, а около 350 миллионов человек имеют хроническую инфекцию. По оценкам, 600 ООО людей ежегодно умирает от острой или хронической формы гепатита В [1]. Вирусом гепатита С инфицировано порядка 170 млн. человек в мире, что составляет около 3% населения Земли [2]. В России в 2000 г. по сравнению с 1998 г. заболеваемость гепатитом В возросла на 15,6%, гепатитом С — на 45,1% [3].

В настоящее время основными методами детекции серологических маркеров заболеваний вирусными гепатитами являются иммуноферментный анализ (ИФА) и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Эти методы зарекомендовали себя как высокоспецифичные и чувствительные. Однако, диагностика инфекционных заболеваний на ранних стадиях (на которых не проявляются клинические симптомы заболевания) с помощью тест-систем на основе этих методов является недостаточно эффективной. В частности, чувствительность метода ПЦР очень высока — порядка нескольких копий нуклеиновой кислоты. Но существует следующее ограничение — при помощи.

ПЦР возможно детектировать только нуклеиновые кислоты, но не белки, в то время как многие маркеры инфекционных заболеваний имеют белковую природу. Также на результаты ПЦР существенное влияние оказывает высокая вероятность контаминации образцов, что часто приводит к ложноположительным результатам. Существенным недостатком методов белковой диагностики (к которым относится ИФА), является предел чувствительности: концентрационный барьер для обнаружения и идентификации белковых молекул в биологическом материале,.

10 существующий в протеомике, ограничен 10″ М [4]. Такое ограничение традиционных методик медицинской белковой диагностики приводит к тому, что в настоящее время в диагностике используется лишь 10−20% потенциально значимых диагностических белковых маркеров, что в свою очередь сдерживает создание ранних диагностикумов, основанных на использовании маркерных белков.

Другие методы идентификации белков, которые широко используются в протеомике и медицине также не обладают ' достаточной чувствительностью для детекции биологических объектов, присутствующих в растворах аналита в низких концентрациях. Например, чувствительность комбинации 2В-электрофореза или хроматографии с масс-спектрометрией LC/MS составляет порядка 10'8- Ю" 10 М [5].

Таким образом, традиционные методики медицинской диагностики имеют ограничения, связанные, прежде всего, с недостаточной чувствительностью. Это приводит к тому, что в настоящее время в диагностике регистрируется и используется лишь небольшая часть потенциально значимых диагностических белковых маркеров, что в свою очередь сдерживает создание ранних диагностикумов, основанных на использовании маркерных белков.

Дальнейшее успешное развитие медицинской диагностики и диагностики вирусных гепатитов в частности требует разработки и внедрения методик, обладающих возможностями выявления и идентификации белков и их комплексов в многокомпонентном.

IО биологическом материале в диапазоне концентраций ниже 10″ М. Подходы, позволяющие решать эти задачи, основаны на использовании методов регистрации и идентификации единичных молекул с помощью молекулярных детекторов [4]. Используемый в настоящей работе метод атомно-силовой микроскопии (АСМ) предоставляет принципиальную возможность визуализировать отдельные белковые молекулы, а это — прямой путь к обнаружению биомаркеров на ранних стадиях заболеваний.

Молекулярный детектор на базе АСМ основан на мониторинге силы взаимодействия зонда микроскопа с молекулами, иммобилизованными на атомарно-гладкой поверхности подложки АСМ [6]. При сканировании зондом вдоль такой поверхности измеряется высота молекул и их комплексов. Высота АСМ-изображений белкового комплекса, как правило, превышает высоту составляющих его изолированных молекул белков г [7, 8]. Вертикальное разрешение метода атомно-силовой микроскопии достигает 0,1 нм.

Для создания диагностического устройства на базе АСМ необходима комбинация метода АСМ с методами биоспецифического фишинга (вылавливание биомолекул из раствора за счет специфического связывания с молекулами-зондами, иммобилизованными на подложке АСМ). В настоящей работе эта комбинация была использована для выявления серологических маркеров вирусных гепатитов В и С — поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) и кор-антигена вируса гепатита С (HCVcoreAg).

Схема детекции серологических маркеров гепатитов В и С с помощью метода АСМ включает два этапа: на первом этапе проводится биоспецифический фишинг, для чего биологический микрочип (АСМ-чип), представляющий собой атомарно ровную подложку с монослоем иммобилизованных макромолекул-зондов, инкубируется в биологическом растворе, содержащем маркеры-гепатитов В-и Сна втором этапе проводится подсчет образовавшихся иммунокомплексов на поверхности АСМ-чипа с помощью АСМ.

Цель работы — разработка методики выявления в сыворотке крови людей маркеров заболеваний вирусными гепатитами В и С: HBsAg и HCVcoreAg на основе АСМ-чипов.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Подбор условий иммобилизации МКА против HBsAg и HCVcoreAg на подложку АСМ;

2. АСМ-визуализация иммобилизованных антител, определение их высоты и плотности иммобилизации на поверхности АСМ-чипа;

3. Разработка методики биоспецифического АСМ-фишинга для детекции HBsAg и HCVcoreAg с помощью АСМ-чипов;

4. АСМ-визуализация, определение высоты и количества иммунокомплексов анти-HBsAg/HBsAg и анти-HCVcoreAg/HCVcoreAg на поверхности АСМ-чипа;

5. Адаптация методики АСМ/биоспецифического фишинга для определения биологических маркеров вирусов гепатитов В и С в сыворотках крови больных людей с помощью метода АСМ;

6. Анализ сывороток, положительных и отрицательных (по данным ИФА и ПЦР) по содержанию биомаркеров вирусных гепатитов, с помощью разработанной методики на основе АСМ-чипов.

Научная новизна работы.

Впервые разработана и реализована методика ковалентной иммобилизации МКА на подложку АСМ. Показано, что в результате иммобилизации образуется монослой антител, сохраняющих биологическую активность. Показано, что комбинация методов АСМ-регистрации и биоспецифического фишинга может применяться для выявления биологических маркеров вирусных гепатитов В и С в растворах и сыворотках крови людей. Получены изображения HBsAg, HCVcoreAg, антител против этих антигенов и иммунокомплексов. Впервые осуществлена АСМ-детекция серологических маркеров вирусов гепатитов В и С — HBsAg и HCVcoreAg — в сыворотках крови людей с помощью разработанных АСМ-чипов.

Научно-практическая ценность работы.

Показана возможность выявления серологических маркеров вирусов гепатитов В и С в сыворотках крови людей с помощью разработанных АСМ-чипов. Разработанная методика биоспецифического фишинга в комбинации с прямым подсчетом белковых комплексов с помощью молекулярного детектора на базе АСМ может служить основой для создания высокочувствительных диагностических систем нового поколения. Данный подход может быть использован в протеомике и медицинской диагностике для выявления других белков в многокомпонентном растворе.

Апробация работы.

Основные положения диссертации были представлены на VII Всероссийской конференции «Физикохимия ультрадисперсных (нано-) систем» (Ершово, Московская область, 2005 г.), Московской международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006 г.), 4-ом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007 г.), Втором международном конкурсе научных работ молодых ученых в области нанотехнологий Rusnanotech 09 (Москва, 2009 г.).

Структура и объем диссертации

.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания аппаратуры и методик исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы.

выводы.

1. АСМ/биоспецифический фишинг может быть использован для детекции биологических маркеров вирусов гепатитов В и С — HBsAg и HCVcoreAg.

2. Разработан АСМ-чип с иммобилизованными МКА против HBsAg и против HCVcoreAg для детекции указанных биологических маркеров вирусов гепатитов. Этот АСМ-чип содержит монослой антител, ковалентно иммобилизованных в определенные зоны на поверхности слюды. Активность иммобилизованных антител подтверждена серией экспериментов в растворах рекомбинантных белков HBsAg и HCVcoreAg.

3. Получены АСМ-изображения HBsAg, HCVcoreAg, МКА против этих антигенов и иммунокомплексов анти-HBsAg/HBsAg и анти-HCVcoreAg/HCVcoreAg. Обработка АСМ-изображений показала, что высота иммунокомплексов на поверхности АСМ-чипа превышает высоты соответствующих антител и антигенов.

4. Отработана методика АСМ/биоспецифический фишинг детекции белковых маркеров заболеваний гепатитами В и С в сыворотках крови людей. Проведен анализ тестовых образцов сывороток, положительных и отрицательных по содержанию биомаркеров вирусных гепатитов. Для исследованных образцов сывороток проведено сравнение результатов АСМ-анализа с результатами традиционно используемых методов диагностики (ИФА и ПЦР).

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТ.

Проведенные исследования поддержаны грантом РФФИ # 09−04−12 113-ОФИ, Государственной программой «Протеомика в медицине и биотехнологии», Государственными контрактами № 02.512.11.2176 «Атомно-силовая микроскопия и биосенсоры для диагностики гепатитов В и С" — № 02.552.11.7060 «Проведение поисковых научно-исследовательских работ в области разработки методики измерений по детекции ультранизкокопийных белков посредством атомно-силовой микроскопии и способов ее применения в медицинских исследованиях в центре коллективного пользования научным оборудованием».

БЛАГОДАРНОСТИ.

Выражаю искреннюю благодарность научному руководителюзаведующему лабораторией нанобиотехнологии ИБМХ РАМН, доктору биологических наук Юрию Дмитриевичу Иванову за предоставление темы для настоящей работы, помощь и поддержку при ее выполнении.

Особо благодарю заведующего кафедрой инфекционных болезней у детей РГМУ, академика РАМН В. Ф. Учайкина, а также сотрудников кафедры к.м.н. В. А. Конева и д.м.н. О. Б. Ковалева за предоставление сывороток крови для анализа.

Благодарю О. Н. Ястребову за предоставления рекомбинантного белка капсида ВГС для исследований.

Выражаю глубокую признательность коллективу лаборатории нанобиотехнологии ИБМХ РАМН за полезные рекомендации и помощь в проведении экспериментов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Целью настоящей работы являлась разработка методики выявления в сыворотке крови людей маркеров заболеваний вирусными гепатитами В и С на основе метода АСМ. В ходе выполнения работы были реализованы следующие основные этапы:

1. Разработка методики иммобилизации моноклональных антител на поверхность подложки АСМ.

2. Тестирование сформированных АСМ-чипов с использованием растворов рекомбинантных белков HBsAg и HCVcoreAg.

3. Тестирование сформированных АСМ-чипов в образцах сывороток крови людей.

На первом этапе была разработана методика иммобилизации — моноклональных антител против HBsAg и HCVcoreAg на аминомодифицированную поверхность слюдьь на основе использования карбодиимидов. С помощью данной методики были созданы АСМ-чипы с монослоем ковалентно иммобилизованных молекул-зондов (моноклональных антител против HBsAg и HCVcoreAg).

На втором этапе была продемонстрирована возможность выявления HBsAg и HCVcoreAg в растворах с помощью метода АСМ в сочетании с методом биоспецифического фишинга анализируемых белковых молекул на поверхность АСМ-чипа. Возможности метода АСМ позволили регистрировать образование комплексов «антиген-антитело» в режиме счета единичных белковых молекул.

На третьем этапе разработана методика выявления маркеров вирусных гепатитов В и С в сыворотках крови людей на основе разбавления исследуемой сыворотки и отмывки неспецефически связавшихся с поверхностью АСМ-чипа компонентов сыворотки. С использованием данной методики была продемонстрирована возможность определения HBsAg и HCVcoreAg в сыворотках крови людей.

Разработаны критерии отнесения исследуемой сыворотки к положительным или отрицательным по содержанию маркеров вирусных гепатитов — HCVcoreAg и HBsAg. На основании выбранных критериев было произведено тестирование положительных и отрицательных (согласно данным ИФА и ПЦР) по содержанию HBsAg и HCVcoreAg сывороток крови с помощью комбинации методов биоспецифического фишинга и АСМ.

Также было проведено сравнение данных, полученных при помощи метода АСМ в комбинации с методом биоспецифического фишинга с данными традиционных методов исследования (ИФА, ПЦР). Совпадение результатов, полученных с использованием традиционно используемых методов исследования (ИФА, ПЦР) с результатами разработанной методики на основе АСМ составило 75,6% в случае детекции HCVcoreAg и 88,6% в случае детекции HBsAg.

Показать весь текст

Список литературы

  1. Информационный бюллетень ВОЗ № 204. — 2008.
  2. WHO Fact sheet № 164. -2008.
  3. И.Д., Радуто О. И. Вирусные гепатиты в России: официальная статистика и экономические потери // Вирусные гепатиты. -2001.-№ 6(18).-С. 6−9.
  4. Archakov A.I., Ivanov Y.D., Lisitsa A.V., Zgoda V.G. AFM fishing nanotechnology is the way to reverse the Avogadro number in proteomics // Proteomics. 2007. — V. 7(1), P. 4−9.
  5. Farci P., Alter H.J., Wong D., Miller R.H., Shih J.W., Jett В., Purcell R.H. A long-term study of hepatitis С virus replication in non-A, non-B hepatitis // N. Engl. J. Med. 1991. — V. 325(2). — P. 98−104.
  6. Ivanov Yu.D., Gnedenko O.V., Nikolaeva L.I., Konev V.A., Kovalev
  7. B., Uchaikin V.F., Govorun V.M., Pokrovsky V.I., Archakov A.I. Detection of hepatitis В virus surface antigen with the use of an optical biosensor// Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 2003. — V. 2. — P. 5862.
  8. Kuznetsov V.Yu., Ivanov Yu.D., Archakov A.I. Atomic force microscopy revelation of molecular complexes in the multiprotein cytochrome P450 2B4-containing system // Proteomics. 2004. -V. 4. — P. 2390−2396.
  9. Kuznetsov V.Yu., Ivanov Y.D., Bykov V.A., Saunin S.A., Fedorov
  10. A., Lemeshko S.V., Hui Bon Hoa G. and Archakov A. I. Atomic force microscopy detection of molecular complexes in multiprotein P450cam containing monooxygenase system // Proteomics. 2002. — V. 2. — P. 16 991 705.
  11. Glebe D. Recent advances in hepatitis В virus research: a German point of view // World J. Gastroenterol. -2007. V. 13(1). — P. 8−13.
  12. Hsia C.C., Purcell R.H., Farshid M., Lachenbruch P.A., Yu M.Y. Quantification of hepatitis В virus genomes and infectivity in human serum samples // Transfusion. 2006. — V. 46(10). -P. 1829−35.
  13. A.A., Каганов B.C., Потапов A.C., Зайнудинов З. М. Хронический гепатит В у детей // Вопросы современной педиатрии. -2002 .-Т. 1, № 3. С. 44−55.
  14. Glebe D., Urban S. Viral and cellular determinants involved in hepadnaviral entry // World J. Gastroenterol. 2007. -V. 13(1). — P. 22−38.
  15. Dane D. S., Cameron С. H., and Briggs M. Virus-like particles in serum of patients with Australia-antigen-associated hepatitis // Lancet. -1970.-V. l.-P. 695−698.
  16. Heermann K.H., Goldmann U., Schwartz W., Seyffarth Т., Baumgarten H., Gerlich W.H. Large surface proteins of hepatitis В virus containing the pre-s sequence // J. Virol. 1984″. — V. 52(2). — P. 396−402.
  17. Nordenfelt E. and Kjellen L. Dane particles, DNA polymerase and e-antigen in two distinct categories of hepatitis В antigen carriers // Intervirology. -1975. V. 5. — P. 225−232.
  18. А.А., Каганов B.C., Учайкин В. Ф. и др. Диагностика и лечение хронических гепатитов С и D у детей // Вопросы современной педиатрии. 2004. — Т. 3, № 1. — С. 16−28.
  19. Е.Н., Фомина Е. Е., Артемов Е. К., Говорун В. М., Иваников И. О., Сюткин В. Е. Хронические вирусные заболевания печени (методическое пособие для врачей). Москва: 2001. — 22 С.
  20. Anderson N.L., Anderson N.G. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects // Mol. Cell. Proteomics. 2002. — V. 1 (11).-P. 845−867.
  21. Grebenchtchikov N., Geurts-Moespot A J., Kroot J J., den Heijer M., Tjalsma H., Swinkels D.W., Sweep F.G. High-sensitive radioimmunoassay for human serum hepcidin // Br. J. Haematol. 2009. — V. 146(3). — P. 317 325.
  22. Sato K., Okamoto H., Aihara S., Hoshi Y., Tanaka Т., Mishiro S. Demonstration of sugar moiety on the surface of hepatitis С virions recovered from the circulation of infected humans // Virology. 1993. — V. 196. — P. 354−357.
  23. Ligler F.S. Perspective on optical biosensors and integrated sensor systems // Anal. Chem. 2009. — V. 81(2). — P. 519−526.
  24. Report of a WHO Consultation organized in collaboration with the Viral Hepatitis Prevention Board, Antwerp, Belgium // J. Viral. Hepat. -1999.-V. 6. P. 35—47.
  25. Seeff L.B., Hoofnagle J.H. Appendix: The National Institutes of Health Consensus Development Conference. Management of Hepatitis С 2002 // Clin. Liver Dis. 2003. — V. 7. — P. 261−287.
  26. Tanaka Т., Kato N., Cho M.J., Sugiyama K., Shimotohno K. Structure of the 3' terminus of the hepatitis С virus genome // J. Virol. 1996. — V. 70(5).-P. 3307−3312.
  27. Mizuno M., Yamada G., Tanaka Т., Shimotohno K., Takatani M., Tsuji T. Virion-like structures in HeLa G cells transfected with the full-length sequence of the hepatitis С virus genome 1933−1940 // Gastroenterology. -1995.-V. 109.-P. 1933−1940.
  28. Baumert T.F., Ito S., Wong D.T., Liang TJ. Hepatitis С virus structural proteins assemble into viruslike particles in insect cells // J. Virol. -1998.-V. 72.-3827−3836.
  29. Yuasa Т., Ishikawa G., Manabe S., Sekiguchi S., Takeuchi K., Miyamura T. The particle size of hepatitis С virus estimated by filtration through microporous regenerated cellulose fibre // J. Gen. Virol. 1991. — V. 72.-P. 2021−2024.
  30. Prince A.M., Huima-Byron Т., Parker T.S., Levine D.M. Visualization of hepatitis С virions and putative defective interfering particles isolated from low-density lipoproteins // J. Viral Hepat. 1996. — V. 3(1). — P. 11−17.
  31. Ishida S., Kaito M., Kohara M., Tsukiyama-Kohora K., Fujita N., Ikoma J., Adachi Y., Watanabe S. Hepatitis С virus core particle detected by immunoelectron microscopy and optical rotation technique // Hepatol. Res. -2001V. 20(3) .-P. 335−347.
  32. Li X., Jeffers L.J., Shao L., Reddy K.R., de Medina M., Scheffel J., Moore В., Schiff E.R. Identification of hepatitis С virus by immunoelectron microscopy // J. Viral Hepat. 1995. — V. 2(5). — P. 227−234.
  33. Hijikata M., Kato N., Ootsuyama Y., Nakagawa M., Shimotohno K. Gene mapping of the putative structural region of the hepatitis С virus genome by in vitro processing analysis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. -V. 88(13).-P. 5547−5551.
  34. Yasui К., Wakita Т., Tsukiyama-Kohara К., Funahashi S.I., Ichikawa M., Kajita Т., Moradpour D., Wands J.R., Kohara M. The native form and maturation process of hepatitis С virus core protein // J. Virol. 1998. — V. 72(7).-P. 6048−6055.
  35. Lo S.Y., Selby M., Tong M., Ou J.H. Comparative studies of the core gene products of two different hepatitis С virus isolates: two alternative forms determined by a single amino acid substitution // Virology. 1994. — V. 199(1).-P. 124−131.
  36. Matsumoto M., Hwang S.B., Jeng K.S., Zhu N., Lai M.M. Homotypic interaction and multimerization of hepatitis С virus core protein // Virology. -1996.-V. 218(1).-P. 43−51.
  37. Nolandt O., Kern V., Muller H., Pfaff E., Theilmann L., Welker R., Krausslich H.G. Analysis of hepatitis С virus core protein-interaction domains //J. Gen. Virol.- 1997.-V. 78(6).-P. 1331−1340. :
  38. Reed K.E., Rice C.M. Overview of hepatitis С virus genome structure, polyprotein processing, and protein. properties // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2000. — V. 242. — P. 55−84.
  39. Deleersnyder V., Pillez A., Wychowski C., Blight K., Xu J., Hahn Y.S., Rice C.M., Dubuisson J. Formation of native hepatitis С virus glycoprotein complexes // J. Virol. 1997. — V. 71(1). — P. 697−704.
  40. Liberman E., Fong Y.L., Selby M.J., Choo Q.L., Cousens L., Houghton M., Yen T.S. Activation of the grp78 and grp94 promoters by hepatitis С virus E2 envelope protein // J. Virol. 1999. — V. 73(5). — P. 3718−3722.
  41. Kolykhalov A.A., Mihalik K., Feinstone S.M., Rice C.M. Hepatitis С virus-encoded enzymatic activities and conserved RNA elements in the 3' nontranslated region are essential for virus replication in vivo // J. Virol. —2000. V. 74(4). — P. 2046−2051.
  42. Gorbalenya A.E., Snijder E.J. Viral cysteine proteinases // Perspect. Drug Discovery Design. 1996. — V. 6, P. 64−86.
  43. Bartenschlager R., Ahlborn-Laake L., Mous J., Jacobsen H. Nonstructural protein 3 of the hepatitis С virus encodes a serine-type proteinase required for cleavage at the NS¾ and NS4/5 junctions // J. Virol. 1993. — V. 67(7). — P. 3 83 5−3 844:
  44. Kim D.W., Gwack Y., Han J.H., Choe J. Towardsidefining a minimal functional domain for NTPase and RNA helicase activities of the hepatitis С virus NS3 protein//Virus Res. 1997.-V. 49(1).-P. 17−25.
  45. Bartenschlager R., Ahlborn-Laake L., Yasargil K., Mous J., Jacobsen H. Substrate determinants for cleavage in cis and in trans by the hepatitis С virusNS3 proteinase//J. Virol.- 1995 .-V. 69(1).-P. 198−205.
  46. Gwack Y., Kim D.W., Han J.H., Choe J. DNA helicase activity of the hepatitis С virus nonstructural protein 3'// Eur. J. Biochem. 1997. — V. 250(1).-P. 47−54.
  47. Hiigle Т., Fehrmann F., Bieck E., Kohara M., Krausslich H.G., Rice C.M., Blum H.E., Moradpour D. The hepatitis С virus nonstructural protein 4B is an integral endoplasmic reticulum membrane protein // Virology.2001.-V. 284(1).-P. 70−81.
  48. Kato J., Kato N., Yoshida H., Ono-Nita S.K., Shiratori Y., Omata M. Hepatitis С virus NS4A and NS4B proteins suppress translation in vivo // J. Med. Virol. 2002. — V. 66(2). — P. 187−199.
  49. Tellinghuisen T.L., Marcotrigiano J., Gorbalenya A.E., Rice C.M. The NS5A protein of hepatitis С virus is a zinc metalloprotein // J. Biol. Chem. -2004. -V. 279(47). P. 48 576−48 587.
  50. Behrens S.E., Tomei L., De Francesco R. Identification and properties of the RNA-dependent RNA polymerase of hepatitis С virus // EMBO J. -1996.-V. 15(1).-P. 12−22.
  51. Sharma S.D. Hepatitis С virus: Molecular biology & current therapeutic options // Indian J. Med. Res. 2010. — V. 131. — P. 1734.
  52. A.B., Кузякин A.O., Кочетков C.H. Молекулярная биология вируса гепатита С // Успехи биологической химии. 2005. — Т. 45.-С. 37−86.
  53. Hsu М., Zhang J., Flint М., Logvinoff С., Cheng-Mayer С., Rice С.М., McKeating J.A. Hepatitis С virus glycoproteins mediate pH-dependent cell entry of pseudotyped retroviral particles // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2003.-V. 100(12).-P. 7271−7276.
  54. Monazahian M., Bohme I., Bonk S., Koch A., Scholz C., Grethe S., Thomssen R. Low density lipoprotein receptor as a candidate receptor for hepatitis С virus // J. Med. Virol. 1999. — V. 57(3). — P. 223−229.
  55. Enjoji M., Nakamuta M., Kinukawa N., Sugimoto R., Noguchi K., Tsuruta S., Iwao M., Kotoh K., Iwamoto H., Nawata H. Beta-lipoproteins influence the serum level of hepatitis С virus // Med. Sci. Monit. 2000. — V. 6(5).-P. 841−844.
  56. Lin C., Lindenbach B.D., Pragai B.M., McCourt D.W., Rice C.M. Processing in the hepatitis С virus E2-NS2 region: identification of p7 andtwo distinct E2-specific products with different С termini // J. Virol. 1994. -V. 68(8).-P. 5063−5073.
  57. Archakov A.I., Ivanov Y.D., Lisitsa A.V., Zgoda V.G. Biospecific irreversible fishing coupled with atomic force microscopy for detection of extremely low-abundant proteins // Proteomics. 2009. — V. 9(5). — P. 13 261 343.
  58. Binning G., Quate C.F., Gerber C. Atomic force microscope // Phys. Rev. Lett. 1986. — V. 56(9). — P. 930−933.
  59. В.Jl. Основы сканирующей зондовой микроскопии. Н. Новгород: 2004.- 110 С.
  60. Garcia R., San Paulo A. Attractive and repulsive tip-sample interaction regimes in tapping-mode atomic force microscopy // Phys. Rev. B. 1999. -V. 60. — P. 4961 — 4967.
  61. San Paulo A., Garcia R. High-resolution imaging of antibodies by tapping-mode atomic force microscopy: attractive and repulsive tip-sample interaction regimes // Biophys. J. 2000: — V. 78(3). — P. 1599−1605.
  62. Podesta A., Imperadori L., Colnaghi W., Finzi L., Milani P., Dunlap D. Atomic force microscopy study of DNA deposited on poly 1-ornithine-coated mica // J. Microscopy. 2004. — V. 215. — P. 236−240.
  63. Ellis J.S., Abdelhady H.G., Allen S., Davies M.C., Roberts C.J., Tendler S.J.B., Williams P.M. Direct atomic force microscopy observations of monovalent ion induced binding of DNA to mica // J. Microscopy. 2004. -V.215.-P. 297−301.
  64. Rippe K., Mucke N., Langowski J. Superhelix dimensions of a 1868 base pair plasmid determined by scanning force microscopy in air and in aqueous solution // Nucl. Acid Res. 1997. — V. 25. — P. 1736−1744.
  65. Bayburt Т.Н., Sligar S.G. Single-molecule height measurements on microsomal cytochrome P450 in nanometer-scale phospholipid bilayer disks // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. — V. 99(10). — P. 6725−6730.
  66. Janicievic A., Ristic D., Wyman C. The molecular machines of DNA repair: Scanning force microscopy analysis of their architecture // J. Microsc. 2003. — V. 212. — P. 264−272.
  67. Pastre D., Hamon L., Sorel I., Le Cam E., Curmi P.A., Pietrement O. Specific DNA-protein interactions on mica investigated by atomic force microscopy//Langmuir. -2010. -V. 26(4). P. 2618−2623.
  68. Butt H.-J., Guckenberger R., Rabe J.P. Quantitative scanning tunneling microscopy and scanning force microscopy of organic materials // Ultramicroscopy. 1992. — V. 46. — P. 375−393.
  69. Zhang Y., Sheng S., Shao Z. Imaging Bioological Structures with the Cryo Atomic Force Microscopy // Biophys. J. 1996. — V. 71. — P. 21 682 176.
  70. Thomson N.H. Imaging the substructure of antibodies with tapping-mode AFM in air: the importance of a’water layer on mica// J. Microsc. -2005.-V. 217.-P. 193−199.
  71. Moller C., Allen M., Elings V., Engel A., Muller D.J. Tapping-Mode Atomic Force Microscopy Produces Faithful High-Resolution Images of Protein Surfaces // Biophys. J. 1999. — V. 77(2). — P: 1150−1158.
  72. Cheung C.L., Hafiier J.H., Lieber C.M., Carbon nanotube atomic force microscopy tips: direct growth by chemical vapor deposition and application to high-resolution imaging // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. — V. 97(8). -P. 3809−3813.
  73. Nagao E., Dvorak J.A. An integrated approach to the study of living cells by atomic force microscopy // J. Microsc. 1997. — V. 191. — P.8−19.
  74. Nettikadan S.R., Johnson J.C., Mosher C., Henderson E. Virus particle detection by solid phase immunocapture and atomic force microscopy // Biochem. Biophys. Res. Commun. -2003. V. 311.-P. 540−545.
  75. Huff J.L., Lynch M.P., Nettikadan S.R., Johnson J.C., Vengasandra S., Henderson E. Label-free protein and pathogen detection using the atomic force microscope // J. Biomol. Screen. 2004. — V. 9(6). — P. 491−497.
  76. Thundat Т., Allison D.P., Warmack R.J., Ferrell T.L. Imaging isolated strands of DNA molecules by atomic force microscopy // Ultramicroscopy. -1992. V. 42−44(Pt. В). — P. 1101−1106.
  77. Song Y., Guo C., Sun L., Wei G., Peng C., Wang.L., SunsY., Li Z. Effects of bridge ions, DNA species, and developing temperature on flat-lying DNA monolayers // J. Phys. Chem. B. 2007. — V. 111(2). — P. 461−468.
  78. Negishi A., Chen J, McCarty D.M., Samulski R.J., Liu J., Superfine R. Analysis of the interaction between adeno-associated virus and heparan sulfate using atomic force microscopy // Glycobiology. 2004. — V. 14. — P. 969−977.
  79. Wagner P. Immobilization strategies for biological scanning probe microscopy // FEBS Lett. 1998. — V. 430. — P. 112−115.
  80. Butt H.J. Measuring local surface charge densities in electrolyte solutions with a scanning force microscope // Biophys. J. 1992. — V. 63. — P. 578−582.
  81. Mueller D.J., Amrein M., Engel A. Adsorption of Biological Molecules to a Solid Support for Scanning Probe Microscopy // J. Struct. Biol.-1997.-V. 119.-P. 172−188.
  82. Florin E.-L., Moy V.T., Gaub H. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs // Science. 1994. — V. 264. — P. 415−417.
  83. Hegner M., Wagner P., Semenza G. Immobilizing DNA on gold via thiol modification for atomic force microscopy imaging in buffer solutions // FEBS Lett. 1993. — V. 336. — P. 452−456.
  84. Crampton N., Bonass W.A., Kirkham J., Thomson N.H., Formation of aminosilane-functionalized mica for atomic force microscopy imaging of DNA//Langmuir.-2005. V. 21(17).-P. 7884−7891.
  85. Caballero D., Pla-Roca M., Bessueille F., Mills C. A., Samitier J., Errachid A. Atomic Force Microscopy Characterization of a Microcontact Printed, Self-Assembled Thiol. Monolayer for Use in Biosensors // Anal. Lett. 2006. — V. 39(8). — P. 1721 — 1734.
  86. Lyubchenko Y., Shlyakhtenko L., Harrington R., Oden P., Lindsay S. Atomic force microscopy of long DNA: imaging in air and under water // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. — V. 90. — P. 2137 — 2140.
  87. Karrash S., Dolder M., Hoh J., Scabert F., Ramsden J.,"Engel A. Covalent binding of biological samples to solid supports for scanning probe microscopy in buffer solution // Biophys. J. 1993. — V. 65. — P. 2437−2446.
  88. Vinckier A., Heyvaert I., Dhoore A., McKittrick Т., Vanhaesendonck C., Engelborghs Y., Hellemans L. Immobilizing and imaging microtubules by atomic force microscopy // Ultramicroscopy. 1995. — V. 57. — P. 337−343.
  89. Mattson G., Conklin E., Desai S., Nielander G., Savage M.D., Morgensen S. A practical approach to crosslinking // Mol. Biol. Reports. -1993.-V. 17.-P. 167−183.
  90. Christopherson C., Kidane Y., Conway В., Krowka J., Sheppard H., Kwok S. PCR-Based Assay To Quantify Human Immunodeficiency Virusit t
  91. Type 1 DNA in Peripheral Blood Mononuclear Cells // J. Clin. Microbiol. -2000. V. 38(2). — P. 630−634.
  92. JI.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. // М.: Наука.- 1985.-536 С.
  93. Hermanson G.T. Bioconjugate Technniques // Academic Press. -1996.-785 P.
  94. Methods Guide for IAsys Plus and IAsys Auto+// Affinity sensors. -1996.
  95. Zweig M.H., Campbell G. ROC Plots: A Fundamental Evaluation Tool in Clinical Medicine // Clin. Chem. 1993. — V. 39(4). — P. 561−577.
  96. Hanley J. A., McNeil В J. The meaning and use of the area under a receiver operating characteristic (ROC) curve // Radiology. 1982. — V. 143(1).-P. 29−36.
  97. Bukh J., Purcell R.H., Miller N.H. Sequence analysis of the. core gene of 14 hepatitis С virus genotypes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. — V. 91.-P. 8239−8243. >
Заполнить форму текущей работой

Сессия? Спокойно!