Кинетика электрогенного транспорта двухвалентных катионов в митохондриях

Ионы Са2+ являются одним из универсальных регуляторов энергетического метаболизма и могут служить проводниками сигналов из цитозоля в матрикс митохондрий. К настоящему времени известно, что поглощение Са2+ является инвариантной функцией митохондрий позвоночных, а также растений, грибов и простейших. Это указывает на исключительную важность митохондриального транспорта Са2+ для поддержания жизнедеятельности организмов. Низкоамплитудные Са2±сигналы (до 300 нМ), не сопровождающиеся значительным увеличением Са2±нагрузки клеток (до 5 нмоль/мг сухого веса клетки), по-видимому, активируют Са2±транспортирующие системы плазмалеммы и эндоплазматического ретикулума. При появлении высокоамплитудных и/или продолжительных Са2±волн в цитозоле Са2±сигнал передается внутрь митохондрий, что приводит к активации окислительного метаболизма и обеспечивает защиту от перегрузки цитозоля ионами Са2+. Исследование кинетики митохондриального транспорта Са2+ необходимо для понимания механизма, обеспечивающего амплитудно-частотную селективность проведения Са2±сигналов из цитозоля в митохондриальный матрикс.

Перенос Са2+ по электрохимическому градиенту через внутреннюю мембрану митохондрий обеспечивает так называемый Са2±унипортер, чувствительный к катионам лантанидов и рутениевому красному. Несмотря на то, что поглощение Са2+ в митохондрии из разных источников изучается уже около полувека, молекулярная структура унипортера до сих пор не установлена, а кинетические параметры транспорта по данным разных лабораторий сильно варьируют и часто.

Введение

противоречивы. Систематическое исследование кинетики транспорта Са2+ митохондриями было начато в начале 70-х годов. В 1971 г. Бигрейв, Рид и Спенсер, используя измерения накопления 45Са2+ в митохондрии печени, обнаружили «кооперативную» зависимость скорости транспорта от его концентрации. Два года спустя Виноградов и Скарпа провели детальный анализ кинетики накопления Са2+ и Мп2+ в митохондрии печени при помощи быстро-регистрирующей фотометрии с применением непроникающего в матрикс металлохромного индикатора мурексида. Ими было показано, что начальные скорости поглощения Са2+ и Мп2+ в митохондрии сигмоидально зависят от концентрации этих катионов. Было установлено, что сигмоидная кинетика транспорта Мп2+ исчезает после кратковременной преинкубации митохондрий с небольшими концентрациями Са2+. Авторы впервые предложили кинетическую модель функционирования унипортера, согласно которой переносчик функционально активен при связывании двух ионов переносимого катиона. С 1973 г. в литературе было опубликовано множество работ, в которых кинетические параметры транспорта (кажущаяся величина «Кт» и значения максимальных скоростей) и само существование кооперативности варьировали в очень широких пределах. В качестве причин кинетической изменчивости авторы рассматривали зависимость транспорта Са2+ от генерации ДЧ7, компенсации АрН, ионной силы окружающей среды, а также присутствия активаторов и ингибиторов. Однако ни одна из предложенных моделей не позволяла непротиворечиво объяснить наблюдаемый в ряде случаев переход от сигмоидной кинетики митохондриального транспорта катионов к гиперболической.

В 1986 г. Лейкиным и Гонсальвес с использованием изотопного и спектрофотометрического методов регистрации было показано, что удаление Са2+ из внешней среды приводит к ингибированию выхода предварительно накопленного Са2+ из разобщенных митохондрий. В это же время Крёнер независимо показал, что продолжительная инкубация деэнергизованных митохондрий печени с ионами Са2+ ускоряет поглощение 45Са2+ в митохондрии после их энергизации. Из этих наблюдений логически следовало, что для функционирования унипортера необходимо специфическое связывание «активирующего» катиона — вывод, хорошо соответствующий модели кооперативного переноса Са2+ через внутреннюю мембрану митохондрий, ранее предложенной Виноградовым и Скарпа. Кинетика активации унипортера охарактеризована не была, хотя отдельные факты указывают на то, что эта реакция протекает медленно и обладает катионной специфичностью. Известные из литературы гипотезы о понижении энергии активации транспорта или увеличении канальной проводимости после насыщения «активирующих» центров позволяют объяснить лишь часть известных фактов. Таким образом, ни механизм Са2±зависимой активации транспорта Са2+, ни его физиологическая значимость до настоящего времени оставались неизвестными.

Мы предположили, что катионная и амплитудно-частотная селективность Са2±унипортера обеспечиваются тем же механизмом, который обусловливает появление кооперативности поглощения Ме2+, а именно интерференцией кинетики транспорта и его активации. Таким образом, основой диссертационной работы стал кинетический анализ взаимодействия митохондриального транспорта двухвалентных катионов и его активации.

В разделе «Обзор литературы», состоящем из двух частей, мы рассматриваем, каким образом кинетика митохондриального транспорта Са2+ определяет роль этого процесса в метаболизме клетки. В первой части раздела «Обзор литературы» перечислены основные способы регулирования внеклеточной и внутриклеточной концентрации Са2+ и обозначено место митохондрий в иерархии систем, участвующих в Са2±сигнализации. Принимая во внимание ограниченный объем диссертационной работы, мы позволили себе ограничиться лишь узкими рамками при рассмотрении такой безбрежной темы, как метаболизм Са2+ и его роль в регулировании клеточных процессов. Вторая часть обзора литературы посвящена особенностям электрогенного транспорта Са2+ в митохондриях.

Раздел «Материалы и методы» состоит из четырех частей. В первых трех частях описаны применявшиеся в работе материалы и известные из литературы препаративные и аналитические методы исследования, а также разработанные нами способы модификации традиционных процедур. В частности, обсуждаются способы очистки инкубационных сред от примесного Са2+ и модификации процедуры выделения митохондрий печени крысы, которые позволяют получать сопряженные митохондрии с заданным количеством эндогенного Са2+. Четвертую часть раздела «Материалы и методы» мы посвятили способам оптимизации экспериментальных условий, без применения которых выполнение настоящей работы оказалось бы невозможным. Аргументирован перечень ингредиентов используемых в работе сред, а также рассмотрены преимущества и недостатки известных из литературы и предложенных нами способов активации и деактивации Са2±унипортера митохондрий.

Раздел «Результаты исследования» состоит из четырех глав (частей). Первая часть посвящена исследованию влияния внутримитохондриального Са2+ на активность Са2±унипортера. Полученные результаты указывают на асимметричность Са2±зависимого регулирования унипортера относительно внутренней мембраны митохондрий. Во второй главе описано проанализирована и количественно описана кинетика активации унипортера ионами Са2+, 8г2+ и Ва2+. В третьей главе количественно охарактеризована кинетика транспорта Са2+, Бг2* и Ва2+, а также ее вариации, обусловленные изменениями активности унипортера. Особое внимание уделено зависимости начальных скоростей транспорта катионов и их специфичности от активации унипортера. В четвертой главе показано, что активационные изменения кинетики транспорта Са2+ полностью обратимы и приведены количественные характеристики деактивации Са2±унипортера.

В разделе «Обсуждение результатов» предложена кинетическая модель кооперативности между электрогенным транспортом Са2+ и его медленной активацией. Проведен анализ соответствия предлагаемой кинетической модели полученным нами и известным из литературы экспериментальным фактам.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

выводы.

1. Предложена модификация процедуры получения интактных митохондрий из печени крысы методом дифференциального центрифугирования, позволяющая снизить содержание эндогенного Са2+ до 0.5 нмоль/мг белка.

2. Исследовано взаимодействие кинетики активации Са2±унипортера митохондрий в присутствии Са2+, 8г2+ и Мп2+ и транспорта перечисленных двухвалентных катионов. Определены величины кажущихся констант диссоциации комплексов Са2+, 8г2+ и Мп2+ из активационных и транспортных центров Са2±унипортера митохондрий. Соотношение этих констант указывает на то, что ряд специфичности транспорта катионов формируется в большей степени на стадии активации, и в меньшей — при транслокации.

3. Активационный центр Са2±унипортера обращен в межмембранное пространство и связывает не менее двух ионов Ме2+. Активация унипортера заключается в его медленном переходе из неактивной формы в активную и происходит независимо от энергизации митохондрий в соответствии с кинетикой обратимых реакций псевдопервого порядка. При отсутствии предварительной активации унипортера начальная скорость транспорта Ме2+ в митохондрии равна нулю.

4. Кажущиеся константы скорости активированного транспорта более чем на порядок превышают наблюдаемые константы скорости его активации в присутствии физиологических концентраций Ме2+. Такое соотношение констант скорости реакций приводит к искажению кинетики транспорта при условии его одновременной активации.