Жизненные циклы, патогенность и дифференциация кокцидий родов Sacrocystis и Cystoisospora

Содержание

В опытах по выяснению возрастной восприимчивости животных было 12 кошек в возрасте от одной недели до 15 лет. Кошек содержали индивидуально в клетках, подвергавшихся ежедневной тщательной очистке и периодическому обеззараживанию огнем паяльной лампы. Перед введением в опыт животных 10 дней выдерживали в особом помещении, чтобы исключить спонтанную инвазию изоспорами. Кормили кухонными отходами, молоком два раза в день из чистой посуды, подвергавшейся ежедневному кипячению.

Дозы спорулированных, предварительно отмытых от бихромата калия ооцист I. felia, применявшиеся для заражения, варьировали в пределах от 5 до 50 тысяч одному животному, в зависимости от его возраста. Ооцисты давали per os с помощью глазной пипетки в небольшом количестве воды (от 2 до 5 мл).

§-екалии животных исследовали ежедневно до тех пор, пока животное не было убито или не погибало в ходе опыта.

Зараженные кошки были убиты через 2, 5, 8, II, 14, 17, 20 дней после заражения (по 3 животных в каждый период). С поверхности слизистой оболочки тонкого кишечника на всем его протяжении делали скальпелем соскобы через каждые 5 см, отступя от желудка. Всего от одного животного брали обычно 14−18 проб.

Толстый отдел кишечника делили на три части и соответственно исследовали. Соскоб изучали компрессорно между предметным и покровным стеклами, используя различные объективы биологического микроскопа. Всех обнаруженных паразитов сразу же измеряли. Кусочки кишечника из разных его участков консервировали для последующего гистологического исследования. Из внутренних органовСсерд-це, печень, почки, селезенка, головной мозг), а также мезентери-альных лимфатических узлов и мышц делали мазки, подсушивали фиксировали спиртом ректификатом и красили по Романовеному-Гимзе в течение 40−60 минут. Часть материала консервировали для последующего гистологического исследования.

Три котенка, свободные от изоспор, в возрасте трех недель, двух и четырех месяцев, были убиты как контрольные для сопоставления с результатами микроскопии соскобов кишечника подопытных животных.

Изучение жизненного цикла Cystoisospora rivolta проведено на щенках 2−3 месячного возраста. В опыте было 7 щенков от собак -дворняжек (5 подопытных, а 2 — в контроле). Все щенки до начала опыта трижды, в течение недели, были обследованы не гельминтозы и цистоизоспорозы. Четыре щенка с токсокарами подвергнуты дегельминтизации декариеом. Щенков содержали индивидуально в клетках, кормили овсяной кашей, хлебом и кухонными отходами.

Исходным материалом для заражения были клонированные культуры ооцист C. ohioensis, полученные первоначально от щенка со спонтанной инвазией C.ohioensis. д0зы для заражения составляли 10.000−30.000 спорулированных ооцист одному щенку при перораль-ной даче. Двух контрольных щенков заражению не подвергали. Подопытные щенки были убиты, а их кишечники обследованы на наличие и локализацию эндогенных стадий цистоизоспор через 2,3,4,5,6дней после заражения. Контрольных щенков обследовали постмортально на 7-й день опыта. Методы паразитологического исследования кишечника щенков аналогичны таковым для c.feiia.

Для сравнительного изучения энтеральных стадий развития в кошке, а также стадий, образующихся в культурах тканей у Toxoplasma gondii u Besnoitia besnoiti после инокуляции спорозои-тов этих паразитов намечено было получить в больших количествах ооцисты этих двух видов кокцидий.

Для сравнительного изучения с другими цистообразующими кок-цидиями энтеральных стадий развития Toxoplasma gondii u Besnoitia besnoiti в кошке, а также в культурах тканей после инокуляции спорозоитов этих паразитов, намечено было получить в больших количествах ооцисты токсоплазмы и В.besnoiti.

С этой целью в 1975 году из лаборатории токсоплазмоза ЙЭМ им. Н. Ф. Гамалеи АМН СССР (от Д. Н. Засухина, М.А.Савиной) получена белая мышь с цистами авирулентного штамма токсоплазмы в головном мозге.

После скармливания кусочков мозга с цистами токсоплазмы двум котятам двухмесячного возраста, свободным от кокцидий, через 5 и 7 дней соответственно начали выделяться с фекалиями в колоссальных количествах неспорулированные ооцисты токсоплазмы. Процесс ввделения ооцист у одного котенка составил 7, а у другого Юдней. Ооцисты токсоплазмы из фекалий выделяли, используя центрифужный метод Дарлинга, где глицерин заменили насыщенным раствором №аС1. Отмытые (путем трехкратного центрифугирования) свежевнделенные ооцисты переносили в колбу со стерильной дистиллированной водой. Для лучшей аэрации колбу соединяли резиновыми шлангами с микрокомпрессором МК-2. Воздух, нагнетаемый микрокомпрессором, пропускали (по методике Т.А.Шибаловой) через колбу с серной кислотой.

Перед проведением опыта спорулированные ооцисты токсоплазмы (споруляция проходила за 2−3 дня при комнатной температуре) подвергали «обезвреживанию» по методике Джексона (Jackson, 1964). Спорозоиты получали по методике Дорана и fappa (Doran, Parr, 1962) в модификации Т. А. Шибаловой (1968) с небольшими изменениями: епороцисты инкубировали при 38 °C с добавлением кошачьей желчи. Полученные спорозоиты отмывали теплым буферным раствором, посредством центрифугирования и после суспеццирования использовали для заражения культуры клеток. Заражению подвергали первично трипсинизированную линию культуры куриных фибробластов (К#), полученную из 10−12 дневных эмбрионов цыплят. Питательной средой, для культуры клеток, служили первые два дня 10%-ный гидролизат лактальбумин на растворе Хенкса, к которому добавляли 10% сыворотки крови крупного рогатого скота, а также индикатор феноловый красный из расчета 10 мг/мл, стрептомицин и пенициллин по ЮОед. каждого на I мл питательной среды. рН питательной среды поддерживали на уровне 7,1−7,2. Температуру в термостате поддерживали в пределах 38³⁹°С. После двухнедельного культивирования в пробирках на половинках покровных стекол развивался монослой клеток. На этот слой клеток вносили спорозоиты токсоплазмы, предварительно проверенные под микроскопом на жизнеспособность. Дозы заражения составляли 100.000 спорозоитов на одну пробирку. Последующее обновление среды производили каждые 20−24 часа. Зараженный монослой клеток периодически подвергали микроскопии (после фиксации в метиловом спирте и последующей окраски гематоксилин-. эозином). Контролем служила извлеченная в те же часы и также окрашенная, но не зараженная культура Ж.

Для изучения эндогенного развития токсоплазмы был проведен опыт по скармливанию котятам цист и спорулированных ооцист токсоплазмы. С целью получения ооцист Besnoitis besnoiti трем котятам (при двух контрольных) трехмесячного возраста были скормлены по 50, 150 и 400 цист безноитий, выделенных из кожи и подкожных фасций крупного рогатого скота и интенсивной инвазией (

-250 цист безноитий на I см) (материал для заражения получен был в 1975 году из Казахского ШВИ от М.В.Хвана). Копрологичес-кие исследования котят проводили через 5 дней после заражения в течение месяца. Заражения котят не произошло.

Поскольку, проводя многократно опыты по скармливанию собакам сырой саркоцистозной говядины, иногда наряду со спороциста-4 ми саркоспоридий, мы в фекалиях выявляли неспорулированные ооцисты Hammondia heydorni, то мы провели опыт по заражению спору-лированными ооцистами этой кокцидии собак, а позднее — мышечной тканью этих собак накормили подопытных собак.

Все стадии развития кокцидий в опытах были сфотографированы микрофотонасадкой М#Н-1,

§-Н-2.

Результаты опытов обработаны статистически, достоверность различий оценивали по Стъюденту.

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Видовой состав Sarcocystis у крупного рогатого скота, овец, коз, свиней, лошадей в зоне Среднего

Урала

В Свердловской области экстенсивность саркоцистозной инвазии крупного рогатого скота варьировала в различных районах от 10 до 90 $. С возрастом животных экстенсивность и интенсивность инвазии нарастает. Отмечена обратная зависимость между упитанностью животных и интенсивностью инвазии. При исследовании 4−6 месячных плодов от коров с интенсивной саркоцистозной инвазией внутриутробной инвазии не установлено. Не было ее и у телят первых двух недель жизни.

Если применять с щелью диагностики саркоцистозной инвазии метод переваривания мышечной ткани в трипсине или желудочном соке, то процент пораженных животных значительно возрастает. Доминирующим видом у крупного рогатого скота выявлен S.cruzi. иснов' ная локализация этого вида — сердце. Количество саркоцист в 26 срезах компрессория колебалось (в случаях интенсивной инвазии) в пределах 100−250. Максимальное количество саркоцист (до 200 и более) обнаружено в левых желудочках сердца. Саркоциеты в сердечной мышце имели удлиненно-овальную форму с закругленными краями. Размер — 0,08−0,33×0,02−0,08 мм. В мышечных волокнах диафрагмы преобладали тонкие длинные саркоцисты размером 0,14−0,5×0,02−0,11 мм. Саркоцисты в мышечных срезах из диафрагмы иногда были видны невооруженным глазом (при просмотре окрашенных срезов в компрессории на источник света) в виде мелких темных штрихов. Диаметр саркоцист, локализовавшихся в миокарде, часто в 5−6 раз превышал диаметр мышечных клеток. Стенка (оболочка) саркоцист тонкая (около I мкм) гладкая со слабо заметными редкими ворсинчатыми выростами. Полость цисты поделена септами на отдельные сегменты, заполненные мерозоитами длиной 10−13 мкм.

У свиней экстенсивность саркоцистозной инвазии составила &% (Вершинин, 1990). Наиболее часто саркоцисты находили в пищеводе" диафрагме. Величина саркоцист (п=70): 150−380 мкм в длину и 25 100 мкм в ширину- толщина стенки цисты 2,5−3,7 мкм (в среднем 3,2 мкм), оболочка цисты имеет поперечную исчерченность. Размер мерозоитов в зрелых цистах — 13,7−18,8 мкм в длину (в среднем 10,7 мкм) и 3,5−5,4 мкм в ширину (в среднем 3,7 мкм). В результате опыта по скармливанию саркоцистозной свинины собакам и кошкам заражение произошло лишь у собак. Таким образом, у свиней выявлен вид S. miescheriana («S.suicanis).

Зараженность саркоспоридиями лошадей составила 19,1% (Вершинин, 1990). Саркоцисты чаще находили в пищеводе, диафрагме, реже в скелетной мускулатуре. Величина саркоцист (п=50) была 370−850 мкм в длину и 41,6−70 мкм в ширину- толщина оболочки цисты в среднем 2 мкм. Имеется поперечная исчерченность оболочки цисты. Размер мерозоитов в зрелых цистах колебался в пределах 15−20 мкм (в среднем 18,7 мкм) в длину и 4,4 (в среднем) в ширину. Скармливание мышечной ткани лошадей трем щенкам и трем котятам в возрасте от 2 до 5 месяцев вызвало заражение лишь у щенят. Препатентный период составил 11,13 и 14 дней. Таким образом, у лошадей выявлен вид S.fayeri.

У овец, как правило, преобладает зараженность видом S. tenel-la (=S.ovicanis) — до 95−100%, а ВИД S. gigantea (=S.ovifelis) регистрируется у 45% овец старше двухлетнего возраста.

У коз саркоцисты выявлены у 38,3% в пищеводах, диафрагме, скелетных мышцах. Саркоцисты имели размер 145=900×55−80 мкм, хотя у отдельных животных их величина достигала 1,5−2 мм и, более. Оболочка (стенка) цисты — 2,5−3 мкм с поперечной исчерченностью. Ме-розоиты в зрелых цистах были 11,5−15,5×3,0−4,5 мкм. Мышечной тканью коз с саркоцистами накормили трех щенков и двух котят. Через 7 и 8 дней соответственно щенки стади выделять спороцисты величиной 13−15×8,5−10 мкм. Котята спороцист не выделяли. Таким образом, у домашних коз выявлен вид S.capracanis.

Ниже в таблице приведена сравнительная оценка поетмортальных методов выявления саркоцист у группы животных разных видов.

2.2.2. Развитие Sarcocystis cruzi в дефинитивном и промежуточном хозяевах

Результаты постмортального паразитологичеекого обследования II подопытных собак, которых накормили саркоцистозной мышечной тканью сердец крупного рогатого скота, были следующими: у собаки, убитой в первый день после заражения (через 10 часов) гамонты обнаружены в бокаловидных клетках кишечных ворсинок. Мужские гамонты (микрогамонты) имели размер 7,0×5,2 мкм, а женские (макроганонты) — б, 7×5,5мкм. Все гамонты были заключены в паразитофорные вакуоли и распологалиеь возле верхушек ворсинок. Женских макрогамонтов было в десятки раз больше (по сравнению с мужскими). Макрогамонты на второй день имели размер 9−15 мкм в диаметре и у них было компактное хроматиновое ядро (при окраске по Романовеному-Гимзе).Количество микрогамет в зрелых микрогамОнтах варьировалось от 3 до 12. Микрогамонты имели овальной формы остаточные тела. Весь процесс гаметогонии, по-видимому, происходит очень быстро, так как у собаки, убитой через три дня после заражения уже встречалось большое количество молодых, с очень тонкой оболочкой, ооцист. То же можно было наблюдать у собаки, убитой через четыре дня после заражения. В цитоплазме только что сформировавшейся ооцисты видны крупные гранулы диаметром до 1,5 мкм. Такие гранулы хорошо видны в свежем материале при световой микроскопии. По-видимому, гаметогония происходит асинхронно, поскольку и ооцисты и гамонты можно находить в одно и то же время.

Дцро неспорулированной ооцисты часто располагалось на периферии ооцисты.

Во все последующие дни после заражения (с 5 по 9-й) происходит спорогония ооцист в клетках етромы кишечных ворсинок (то есть субэпителиально). Особенно четко заметны последовательные деления ядра в ооцисте в период с 5-го по 7-й день. Вначале ядро ооцисты делится на два более мелких ядра, которые располагаются по полосам цитоплазмы. Одновременно с делением ядра происходит «перешнуровка* на две части цитоплазмы ооцисты. После второго ядерного деления образуются два споробласта, каждый с двумя ядрами, расположенными также по полюсам., которые, вскоре сформировав оболочку, становятся спороцистами. Затем в каждой споро-цисте формируется по четыре спорозоита и остаточное тело, состоящее из мелких гранул. Тонкая оболочка зрелых ооцист прогибается, плотно облегая спороцисты, или совсем разрывается и спороцисты оказываются свободными. Именно поэтому, как правило, в фекалиях окончательных хозяев находят свободные спороцисты.

Спороциста (в отличие от ооцисты) имеет довольно толстую оболочку, форма у нее яйцевидная, обычно с несколько упрощенной одной стороной. Средний размер ее 10,8×16,3 мкм. Особенно много спороцист (и ооцист) находится в строме верхушек кишечных ворсинок. Стадий бесполого развития саркоспоридий в кишечной стенке (ворсинках) не выявлено.

С целью выяснения возможности отыскать иных (кроме собаки) дефинитивных хозяев S. cruzi, в ноябре-декабре 1973 года в Мра-морском зверохозяйстве Полевского района Свердловской области четырем песцам, свободным от кокцидиозной инвазии, скормили свежее сырое мясо крупного рогатого скота (сердце, пищеводы, диафрагму), полученное на Свердловском мясокомбинате сразу же после убоя животных. Через 14 дней после заражения их убили. В соско-бах слизистой оболочки тонкого кишечника (главным образом в тощей и подвздошной к иже) обнаружены спороцисты размером 14−16 мкм в длину и 9−10,5 мкм в ширину. Форма спороцист эллипсоидаль^ ная с несколько уплощенной одной стороной. В спороцистах заметны четыре, банановидной формы, спорозоита и гранулярное остаточное тело. Значительно в меньшем количестве встречались зрелые ооцисты с очень тонкой, прогнувшейся наружной оболочкой. Размер ооцист был 18,9−19,8 мкм в длину и 14,8−15,3 мкм в ширину (Вершинин, Леонтьева, 1974). Таким образом, песец был зарегистрирован как дефинитивный хозяин для S. cruzi (8 норок, находившихся в аналогичных условиях и одновременно с песцами, кормившиеся сар-коциетозным мясом крупного рогатого скота — не заразились).

В 1975 году в том же Мраморском хозяйстве шести песцам скормили однократно свежий мясной фарш из мяса Овец (сердце, диафрагма) с микросаркоцистами S. tenella (=S-ovicanis). Этим же фаршем накормили б норок. Двум норкам скормили по 10 макросарко-цист из пищеводов овец. В результате заражение произошло лишь у песцов, но не норок (Вершинин, 1977).

В опыте, целью которого было изучить развитие s. cruzi в организме телят, всем 12-и телятам подопытной группы перорально было дано по 100.000−150.000 спороцист. В ходе опыта через каждые 5 дней (от начала заражения) убивали по одному теленку для паразитологического обследования. Результаты опыта: у теленка, убитого через 5 дней после заражения (ДПЗ), отклонений в состоянии не отмечено, температура тела была нормальной, аппетит хороший. Стадий развития паразита постмортально не выявлено.

У теленка, убитого через 10 ДПЗ, также ничего не обнаружено при паразителогическом обследовании. Клинически животное в период наблюдения за ним было здорово.

У теленка, убитого через 15 ДПЗ, в день его выведения из опыта отмечено повышение температуры тела до 40,2°С, но без какого-либо ухудшения в состоянии (теленок был бодр, аппетит хороший). В эндотелии артериол тонкого кишечника в небольшом количестве обнаружены зрелые меронты первой генерации s.cruzi. Размер меронтов в среднем (п"15) 38,5×22,5 мкм. Количество мерозоитов в меронте — 80−105. Величина мерозоитов — 6,1×1,4 мкм.

У теленка," убитого через 20 ДПЗ, в капиллярах печени, почек, сердца, тонкого кишечника в небольшом количестве найдены незрелые меронты второй генерации. Размер меронтов — 18,5×10,2 мкм с количеством ядер в меронте от 6 до 32 (1Ы2).

У теленка, убитого через 25 ДПЗ, на 22-й день опыта температура тела повысилась до 39,9°С, теленок заметно угнетен, наружные лимфатические узлы несколько увеличены, болезненны при пальпации, аппетит понижен, животное часто лежит. На 23-й, 24-й ДПЗ состояние животного резко ухудшилось. Отмечена почти полная потеря аппетита, шерстный покров стал тусклым, взъерошенным, видимые слизистые оболочки анемичны. Температура тела повысилась до 41,1°С, появился понос, тахикардия (90−100 ударов в минуту), дыхание стало шумным, учащенным (35−40 дыхательных экскурсий в минуту). Появилась шаткость походки, упитанность заметно снизилась. Такое состояние продолжалось и через 25 ДПЗ, то есть до дня убоя животного. При паразитологическом обследовании меронты второй генерации обнаружены в эндотелии капилляров, реже мелких артерий практически всех внутренних органов (сердце, селезенка, почки, лимфатические узлы, печень и др.). Особенно много меронтов обнаружено в клубочках почек. Встречались как зрелые, так и незрелые меронты. Размер и форма меронтов зависела от органа или ткани, где они локализовались. В мышечной ткани меронты всегда были значительно длиннее, чем в других тканях. Следует отметить, что меронты и первой и второй генерации никогда не располагались в пара-зитофорной вакуоли, а лежали непосредственно в цитоплазме инвазированной клетки. Размер зрелых меронтов был 19,0×11,5 мкм (п" 25), а размер мерозоитов, число которых в одном меронте варьировалось от б до 35, составлял 7,6×1,4 мкм.

У телят, убитых через 30, 35, 40 ДОЗ, отмечена аналогичная картина (как клиническая, так и патологоморфологическая). Выражен был резко геморрагический диатез, отечность тканей и органов, увеличение лимфатических узлов.

Незрелые саркоцисты появились у телят, убитых через 40−5070 дней ДПЗ. Саркоцисты с зрелыми мерозоитами и тонкой стенкой цисты появились у телят, убитых через 80, 90 и 100 ДПЗ.

2.2.3. Развитие S. oruzi в культуре ткани при заражении спорозоитами

Через 14 часов после заражения клеток монослоя Ж в большом количестве встречались епорозоиты, один конец которых был всегда заострен. Размеры их (по результатам измерения 20 экземпляров) были 8-II мкм в длину и 2−2,5 мкм в ширину. Отчетливо были заметны ядро и цитоплазма. Через 20 часов оба конца спорозоита округлялись и некоторые из них уже превращались в шаровидные формы, очень похожие на трофозоиты с хорошо заметным шаровидным ядром и цитоплазмой. Диаметр этих шаровидных форм был 7−7,5 мкм (п=5). Как епорозоиты, так и формы, похожие на трофозоитов, локализовались в цитоплазме клетки часто в непосредственной близости от ядра, которое иногда вследствие близости паразита несколько деформировалось.

Через 36, а особенно через 56 часов, находили многочисленные скопления мелких паразитов, в каждом из которых насчитывались десятки особей. Через 72 часа после заражения монослоя преобладали большие скопления паразитов (до 150−200 и более). В одном препарате их находили более десяти. Форма таких скоплений была различная — от шаровидной до овальной. Диаметр шаровидных скоплений достигал 55 мкм- овальной формы скопления были 88×59 мкм- 77×46 мкм, хотя встречались скопления и значительно меньших размеров, в которых насчитывалось от 10−15 до 50 паразитов. При микроскопии под иммерсионным объективом можно было видеть, что паразиты, составлявшие различной величины скопления, не однородны. Среди них встречались особи шаровидной, яйцевидной и удлиненно-грушевидной формы, различной величины, а также формы в виде розеток, состоявшие из трех, четырех и пяти «лепестков». Дальнейшее наблюдение за развитием саркоспоридий было прекращено из-за гибели монослоя.

В контрольных пробирках с монослоем ® ничего подобного не было обнаружено.

Анализируя полученные данные, следует отметить исключительную репродуктивную способность и выраженное цитопатогенное действие эндозоитов Sarcocystis на клетки монослоя. Если через 14 часов после заражения спорозоит внутри клеток был еще неактивен (не изменялись форма, величина), то через 20 часов спорозоит превращался в шаровидной формы трофозоит, а через 36−56 часов встречались уже многочисленные скопления мелких паразитов, состоявшие из десятков особей. Через 72 часа большая часть клеток монослоя гибла (от единичных клеток оставались лишь ядра), а скопления паразитов сферической и овальной формы насчитывали уже до 150−200 и более паразитов. Из-за гибели монослоя дальнейшие наблюдения были прекращены.

Таким образом, интенсивное развитие паразитов уже через 72 часа привело к гибели клеток монослоя. Накопленные к настоящему времени факты относительно типов агамной репродукции эймериидных кокцидий invivo u in vitro позволяют сравнить эти наши наблюдения с данными других авторов по развитию ряда близко родственных организмов:

Как известно, у Toxoplasma gondii вне зависимости от того, что вносится в культуру клеток — эндозоиты или епорозоиты -репродукция паразитов происходит по типу эндодиогении (а также эндополигении). После ряда повторных делений паразитов образуются большие скопления токсоплазм, расположенных беспорядочно или в форме розеток (Акиншина, 1963, 1964).

Различные по величине скопления паразитов в нашем опыте (особенно шаровидной и овальной формы), по-видимому, являются ме-ронтами первой генерации S.cruzi. В пользу такого предположения можно привести следующие доводы:

1. Диаметр шаровидных скоплений достигал 55 мкм, а овальных

— 88×59 мкм- 77×46 мкм. В опыте

§-ейера (Payer, 1977), а также в нашем опыте шизонты S. cruzi первой генерации имели аналогичные размеры и насчитывали до 100 и более мерозоитов.

2. Наличие в скоплениях, наблюдавшихся нами, особей шаровидной, яйцевидной и удлиненно-грушевидной формы, а также паразитов в виде розеток, состоявших из трех, четырех, пяти «лепестков» свидетельствует о том, что репродукция паразитов наряду с шизогонией осуществляется, по-видимому, и путем эндополигении. При электронной микроскопии установлено, что в организме телят одновременно с шизогонией часть мерозоитов s. cruzi делилась по типу эндодиогении (Mehlhorn, Heydorn, 1978) и эндополигении.

Репродукция по типу эндодиогении установлена в культурах клеток у Isospora canis (Payer, M&hrt, 1972), у кокцидий кошек

— I. rivolta (Payer, 1972). По типу эвдодиогении бесполое размножение может происходить в кишечнике собаки у I. canis (Hilaili et al, 1979), у I. felis (Ferguson et al, 1980j Daly, Markus, 1981). Шолтизек (Scholtyseck, 1973) считает, что шизогония у кокцидий происходит в два этапа. На первом этапе в результате митотического деления ядра паразита формируется многоядерный ши~ зонт, который затем дает начало одноядерным цитомерам, на втором этапе ядро каждого цитомера делится по типу эндодиогении и это ведет к образованию двух дочерних клеток (мерозоитов). По-видимому, нечто подобное наблюдали и мы в нашем опыте культивирования S.cruzi.

Следует отметить, что in vivo, то есть в организме экспериментально инвазированных спороцистами s. cruzi телят, шизонты первой генерации появляются через 15−16 дней в эндотелии мелких и средних артерий тонкого и толстого отдела кишечника, почках, поджелудочной железы, головном мозге через 15−16 дней после заражения (Payer, 1977), а у телят, зараженных спороцистами S. cruzi от койота — уже на 7-й день после заражения в мезентери-альных лимфоузлах (Dubey, 1982).

Появление меронтов первой генерации уже через 36−72 часа после инокуляции спорозоитов S. cruzi в монослой клеток следует объяснять, по-видимому, необычной средой обитания, поскольку паразиты не встречают защитного иммуногенного противодействия, как это имеет место in vivo.

Способность дальнейшего развития спорозоитов S. cruzi в культуре ткани фибробластов куриных эмбрионов (а не в клетках эндотелия кровеносных сосудов крупного рогатого скота — промежуточного хозяина паразита) еще более сближает Sareocystis с классическими эймериидными кокцидиями, спорозоиты и шизонты которых in vitro также могут развиваться в клетках, в которых в естественных условиях паразиты не локализуются. Надо полагать, что если для получения клеточного монослоя использовать клетки эмбриона крупного рогатого скота, то результативность культивирования спорозоитов S. cruzi будет выше.

2.2.4. Развитие Sarcocystis gigantea в культурах тканей при заражении цистными мерозоитами

Через 18 часов после заражения в культурах клеток Ш были видны многочисленные цистозоиты (мерозоиты), внедрившиеся в цитоплазму клеток. Размер цистозоитов был 9−12×2,25 мкм. Большинство паразитов локализовалось в непосредственной близости к ядрам клеток куриных фиброблаотов. Через 21−24 часа после заражения размер отдельных цистозоитов был меньше (5−7×1,5−2 мкм), края округлые. Такие паразиты (трофозоиты) были заключены в паразитофор-ную вакуоль и располагались возле самого ядра, в ядре или на ядре зараженной клетки. Встречались и совершенно округлившиеся зоиты. Аналогичная картина наблюдалась и в монослое iO.

Через 36 часов после заражения встречались паразиты овальной или шаровидной формы с признаками деления ядра, которые локализовались в цитоплазме клеток $ 0 обычно возле ядер и были окружены паразитофорной вакуолью. В это же время встречались в значительном количестве паразиты лимоновидной формы с несколько заостренными концами и крупным, преломляющим свет шаровидным образованием в центре. Длина их была 7−8 мкм, ширина — 3,5−5 мкм. В одной клетке можно было видеть I, 2 и 3 таких паразита. Локализовались они обычно возле ядра клетки. Наряду с вышеописанными, встречались паразиты эллипсоидальной формы, а также округло -овальные образования с нечетко просматривавшимися гранулами. Размер этих образований (п*30) был в среднем 10−12×8−10 мкм. Они всегда были заключены внутри паразитофорной вакуоли и, находясь в тесной близости с ядром клетки хозяина, приводили к его деформации.

Через 48 часов после заражения вблизи ядер клеток

§ 0 обнаруживались многоядерные образования шаровидной форм", имеющие диаметр 7−9 мкм. Такие многоядерные паразиты также располагались в^три паразитофорной вакуоли.

Через 54−60 часов после заражения в клетках

§ 0 обнаруживались те же формы, что и через 36 и 48 часов. Однако к этому времени наиболее многочисленными были шаровидные цистообразные стадии диаметром 14−15 мкм- их цитоплазма содержала отчетливо выраженные, одинаковые по размеру гранулы. Эти стадии также располагались в тесном контакте с ядром клетки хозяина.

К 72-му часу монослои Ш и Ж разрушались, что препятствовало дальнейшим наблюдениям. В контрольных пробирках паразиты обнаружены не были.

Проведенное исследование показало, что при культивировании S. gigantea монослой фибробластов эмбрионов овцы был более подходящей средой, чем монослой фибробластов куриного эмбриона.

Стадии бесполого развития (шизонты) s. gigantea обнаружены не были, и это объясняет столь быстрое появление стадий половой фазы цикла. Макрогаметы появлялись уже через 36 часов после заражения и достигали в среднем 10−12 мкм. Микрогаметоциты были видны отчетливо к 48 часу и достигали в диаметре 7−9 мкм- среднее количество дцер на микрогаметоцит составляло 6−10.

Сравнение развития в культуре тканей Sarcocystis sp. от вороньего дрозда (Payer, 1970, 1972) с развитием S. gigantea говорит о значительном сходстве в характере расположения и взаимоотношения с клетками хозяина эндогенных стадий сравниваемых объектов. Интересно отметить, что эндогенные стадии многих кокцидий, включая виды Eimeria, Isospora, Toxoplasma, Besnoitia, Sarcocystis, имеют тенденцию развиваться в тесном контакте с ядром зараженной клетки.

2.2.5. Натологоанатомические изменения при остром экспериментальном саркоцистозе телят

Ниже приведены результаты опыта, проведенного в июне 1980 г. в учхозе «Уралец» Свердловского сельскохозяйственного института.

Двум двухмесячным телятам перорально было дано соответственно 3 и 5 млн. спороцист S. bovicanis каждому. Третий теленок такого же возраста заражению не подвергался и служил контролем, на 25-й день после заражения подопытные" телята были вынуждено убиты из-за крайне тяжелого состояния. У подопытных животных наблюдали сильную слабость, исхудание, потерю аппетита, угнетение, бледность, конъюнктивиты, лихорадку (у одного теленка температура тела была 41,5°С, у другого — 41, б°С), тахикардию, учащение дыхания, одышку (выдох сопровождался стоном), скрежет зубами, серозно-слизистые выделения из глаз (у одного теленка), периодическое подергивание соматических мышц, понос, шаткость походки (животное передвигалось с трудом), повышенную жажду, взъерошенность шерстяного покрова.

При визуальном патологоанатомическом исследовании обнаружено сильное увеличение всех наружных и внутренних лимфатических узлов. Они были отечны с многочисленными точечными кровоизлияниями. В грудной и брюшной полостях находилась в небольшом количестве желтого цвета прозрачная жидкость. На серозных покровах сычуга, преджелудочков и особенно тонкого и толстого кишечника — обширные кровоизлияния (на многих участках кишечник, казалось, был залит кровью). Кровоизлияния находили в мочевом пузыре (обширные, сплошные), почках, поджелудочной железе, надпочечниках (точечные и пятнистые), эндокарде (разлитые) и эпикарде, легких (точечные). Мышцы были темно-коричневого цвета с мраморным рисунком. Результаты гистологического исследования отдельных органов и тканей приведены ниже.

СЕРДЦЕ. Мышечные волокна пропитаны эритроцитами и гемоси-дерином. Цйет их при окраске гематоксилин-эозином коричневатый. На участках с лизированными мышечными волокнами — полиморфно-клеточная инфильтрация (мононуклеарные клетки, клетки РЭС, лимфоциты). Под эндокардом — множественные геморрагические инфаркты. Мышечная ткань в этих очагах полностью некротизирована и пропитана кровью. В патологический процесс вовлечены и волокна Пуркинье. Оболочка их и большая часть клеток лизированы. В других волокнах, лежащих более глубоко, наблюдаются регенерацион-ные процессы в виде появления четырехъядерных клеток, расположен ных, как правило, в центре волокна. В межуточной соединительной ткани наблюдается тромбоз кровеносных сосудов малого и крупного калибра. Эндотелий сосудов в состоянии активной пролиферации. Шизонты паразитов найдены среди клеточных элементов в участках лимфоидной инфильтрации. Здесь же встречались единичные плазматические клетки с интенсивно окрашенной цитоплазмой. Почти во всех гистосрезах отмечается диапедез эритроцитов.

СКЕЛЕТНЫЕ МЫШЦЫ, икрашенн неравномерно, что типично для зернистой дистрофии мышечных волокон. В межмышечных пространствах обильная полиморфноклеточная инфильтрация, представленная в основном клетками РЭС, макрофагами и клетками типа эпителиоид-ных. Поперечная исчерченность выражена не во всех волокнах. Между волокнами видны ряды эритроцитов. Клетки эндотелия кровеносних сосудов в состоянии активной пролиферации.

ЛЕГКИЕ. Кровенаполнены с интерстициальными геморрагиями междольчатая ткань и альвеолы отечны. Клеточная инфильтрация представлена в основном лимфоцитами и макрофагами.

МОЗГ. Очаговые кровоизлияния разной величины в обоих слоях мозга. Перицеллюлярный отек и некроз единичных нервных клеток с превращением их в клетки-тени. Наблюдаются периваскулярные муфточки из клеток глии и клеток РЭС: в белом веществе обнаруживаются рассеянные глиальные узелки, некоторые из них находятся в непосредственной близости с кровоизилияниями.

ЛИМФАТИЧЕСКИЕ УЗДЫ, (мезентериальные и медиастинальные). Центральные синусы резко расширены и затоплены полиморфномлеточ-ным инфильтратом, состоящим в основном из гиетиоцитов, незрелых плазматических клеток (плазмобластов), лимфобластов, клеток ЕЭС. В центральных синусах народу с клеточной инфильтрацией обнаруживаются шизонты. Здесь же наблюдается диапедез эритроцитов и их распад. Лимфатические сосуды расширены, эндотелий их в состоянии активной пролиферации. Периваскулярно появляются фибробласты и фиброциты, которые дают основу роста соединительной ткани. Кроме этого, обнаруживается большое количество эозинофилов, причем некоторые из них в состоянии дегрануляции (идет процесс освобождения биологически активных веществ: гистаминаза и др.). Соединительнотканные элементы перегородок и ворот лимфатических узлов в состоянии активного размножения. Некоторые кровеносные сосуды, расположенные в области ворот, полностью облитерированы размножающимися клетками эндотелия.

СЕЛЕЗЕНКА. В центральных артериях — активная пролиферация эндотелия. Красная пульпа обильно инфильтрирована эритроцитами, незрелыми клетками лимфоидного ряда. В трабекулярных сосудах наблюдается набухание стенки и периваскулярный эритродиапедез и плаз-моррагии. Соединительнотканные клетки трабекул в состоянии активного размножения и представлены в основном властными формами.

ПЕЧЕНЬ. В междольковой соединительной ткани и внутри долек — инфильтраты из лимфоидных клеток разной степени зрелости, клеток ЮС и единичных плазматических. Пространства Диссе расширены, в них также обнаружен клеточный инфильтрат и единичные шизонты саркоспоридий. В некоторых клеточных очагах наблюдаются кровоизлияния. Центральные вены запустевшие, капилляры обескровлены. Просвет артерий закрыт, клеточные элементы стенок в состоянии активной пролиферации.

ПОЧКИ. Рисунок почки не везде выражен четко. Встречаются довольно обширные участки, в которых вся почечная ткань обильно инфильтрирована полиморфноклеточным инфильтратом с преобладанием молодых форм лимфоидных клеток. Среди диффузной инфильтрации встречаются очаги величиной с почечный клубочек, представленные клетками РЭС, фибробластами и крупными мононуклеарами. Просветы канальцев сужены, заполнены слабо оксифильным содержимым. Границы клеток эпителия выражены нечетко. Эндотелий капиллярной сети мозгового слоя в состоянии активной пролиферации. В периваскуляр-ной зоне дуговых артерий — инфильтрат преимущественно из клеток РЭС, фибробластов и лимфоидных клеток разной степени зрелости. Встречаются также единичные лейкоциты.

ТОНКИЙ ОТДЕЛ КИШЕЧНИКА. Слизистая оболочка сильно инфильтрирована незрелыми лимфоидными клетками, эозинофилами, клетками типа эпителиоидных, отдельными плазматическими клетками. В слизистой отмечается геморрагическое пропитывание и десквамация эпителия. Бокаловидные клетки редуцированы. Массовые кровоизлияния наблюдаются в обоих слоях мышечной оболочки. Вокруг нервных сплетений — лимфоидноклеточная инфильтрация. Очень сильно выражено диффузное геморрагическое пропитывание серозной оболочки.

ТОЛСТЫЙ ОТШ КИШЕЧНИКА. Массовые кровоизилияния в мышечной оболочке. Диффузное геморрагическое пропитывание серозной и слизистой оболочек. В мышечной соединительной ткани активная мак-рофагальная реакция с наличием клеток РЭС, плазмобластов, лимфо-идных клеток разной степени зрелости. В области крипт обильная полиморфноклеточная инфильтрация с преобладанием эозинофилов, лимфоцитов и клеток РЭС.

Следует отметить, что диффузная инфильтрация эозинофилами, лимфоцитами, клетками РЭС, плазматическими клетками и активная пролиферация эндотелия сосудов отмечена практически во всех внутренних органах обоих телят.