Экспериментальное изучение фармакокинетики и метаболизма оригинального селективного анксиолитика афобазола

Актуальность проблемы.

Проблема создания селективных анксиолитиков, сходных по противотревожным свойствам с бензодиазепинами, но не обладающих их гипноседативными, миорелаксантными, амнестическими эффектами, не вызывающих зависимости и синдрома отмены, является центральной в современной психофармакологии [19, 44].

Фундаментальные исследования генетических различий в действии типичных транквилизаторов и анализ механизмов диссоциации их анксиолитического и седативного влияния показали, что анксиоселективный эффект может быть достигнут при коррекции изменений в ГАМКд рецепторе, развивающихся при эмоционально-стрессовой реакции и приводящих к снижению связывающей способности бензодиазепинового участка [18,19,111]. Итогом этих работ явился целенаправленный синтез, выполненный под руководством В. Л. Савельева, и фармакологическое изучение соединения 5-этокси-2-[2-(морфолино)-этилтио]-бензимидазола дигидрохлорида, получившего название афобазол. Установлено, что афобазол предотвращает стресс индуцированное падение бензодиазепиновой рецепции в нейрональных мембранах и обладает селективными анксиолитическими свойствами [19,109].

Экспериментальные результаты подтверждены в клинических исследованиях [14]. Препарат зарегистрирован в РФ в качестве селективного анксиолитика 3 ноября 2005 г, № ЛС — 861.

Необходимым этапом разработки оригинального лекарственного средства является экспериментальное изучение его фармакокинетики и метаболизма. При этом выясняется, в каком количестве от введенной дозы препарат всасывается из места введения и поступает в системный кровоток и, соответственно, к месту его биологического действия. При введении внутрь важно знать, какая часть препарата подвергается биотрансформации, а какая попадает в системный кровоток в неизмененном виде. Необходимо изучить основные пути метаболизма исследуемого соединения с идентификацией и дальнейшим изучением фармакологической активности метаболитов. Другой задачей фармакокинетических исследований является изучение абсолютной и тканевой биодоступности соединений, что помогает выбрать оптимальный путь введения препарата и оценить интенсивность его проникновения в орган-мишень [6].

Диссертация выполнена в соответствии с плановой темой НИР ГУ НИИ фармакологии им. В. В. Закусова РАМН «Изучение механизмов эндо-и экзогенной регуляции функций ЦНС, разработка новых оригинальных нейропсихотропных средств» (№ госрегистрации 01.2006 6 601).

Целью работы явилось экспериментальное изучение фармакокинетики афобазола и его метаболитов. Для ее достижения были поставлены следующие задачи:

1. Разработать аналитический метод количественного определения афобазола и его метаболитов в биологическом материале с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2. Провести идентификацию метаболитов афобазола на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии.

3. Изучить фармакокинетику неизмененного афобазола и его основных метаболитов в плазме крови и органах крыс после однократного внутрибрюшинного введения.

4. Изучить фармакокинетику афобазола и его основных метаболитов в плазме крови крыс после однократного перорального введения.

5. Определить абсолютную биологическую доступность афобазола.

6. Изучить экскрецию неизмененного препарата и его метаболитов с мочой и калом в эксперименте.

7. На основании результатов проведенных исследований выработать рекомендации по фармакологическому изучению метаболитов афобазола.

Научная новизна работы Впервые изучена биотрансформация и фармакокинетика нового селективного анксиолитика афобазола у крыс, определены стандартные фармакокинетические параметры. Установлено, что при различных путях введения афобазол подвергается интенсивной биотрансформации, и уже в первые минуты в плазме крови и органах крыс регистрируются значительные концентрации его метаболитов. По данным масс-спектральных характеристик и встречного химического синтеза были идентифицированы 5 метаболитов афобазола. Установлено, что основными продуктами биотрансформации афобазола являются: метаболит М-3 (гидроксилированный по ароматическому кольцу бензимидазольного цикла) и метаболит 11 (окисленный по морфолиновому кольцу). Афобазол и его метаболиты определяются в плазме крови и органах животных в течение 3-х часов. В результате проведенного исследования установлено, что для афобазола характерна средняя степень проникновения в орган-мишень мозг и высокая абсолютная биодоступность.

Практическая значимость работы На основании данных исследований методом высокоэффективной жидкостной хроматографии идентифицированы метаболиты афобазола. Синтезирован метаболит М-11, который предложен для дальнейшего фармакологического изучения. Перспектива создания лекарственных форм для орального применения афобазола подтверждена его высокой степенью абсолютной биодоступности в эксперименте. Фармакокинетические параметры, установленные в настоящей работе, использованы для разработки схем применения афобазола в клинике, для проведения работ по оценке безвредности препарата. Совокупность данных диссертационного исследования вошла в комплект документов, представленных для регистрации афобазола в качестве лекарственного средства в Министерство здравоохранения и социального развития РФ.

Положения, вынесенные на защиту:

1) Разработаны высокочувствительные методы ВЭЖХ и масс-спектрометрии для количественного определения афобазола и его метаболитов в биологических средах.

2) Идентифицированы основные метаболиты афобазола.

3) Установлены фармакокинетические параметры афобазола и его основных метаболитов при внутрибрюшинном и пероральном введении крысам в дозе 25 мг/кг.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на IV Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2006г), XV Международном конгрессе по фармакологии «Pharmacology in the 21st Century: A Bridge between the Past and the New Molecular Frontiers» (Пекин, 2006г), научно-практической конференции «Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)» (Ростов-на-Дону, 2006г), XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007г), на лабораторной конференции лаборатории фармакокинетики ГУ НИИ фармакологии им. В. В. Закусова РАМН (Москва, 2007г).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 4 тезисов.

Выводы:

1) На основе ВЭЖХ разработана высокочувствительная и селективная методика количественного определения афобазола и его метаболитов в биологическом материале.

2) В результате анализа масс-спектрометрических характеристик наряду с неизмененным препаратом идентифицировано 17 продуктов его биотрансформации. Встречным химическим синтезом подтверждены структуры следующих 5 метаболитов афобазола: гидроксилированного по бензимидазольному циклу, окисленного по гетероатому серы, гидроксилированного по алифатическому радикалу, окисленного по морфолиновому фрагменту и циклизованного по атому азота.

3) Установлены различия в количественном содержании и величинах дозозависимых фармакокинетических параметров афобазола и его метаболитов при разных путях введения. После перорального способа введения отмечена более интенсивная биотрансформация, что связано с выраженным «эффектом первого прохождения» препарата через печеночный барьер.

4) Определены основные пути и параметры выведения афобазола и его идентифицированных встречным химическим синтезом метаболитов. Установлено, что за 24 часа после внутрибрюшинного и перорального введения афобазола с мочой и калом крыс выводится не более 0,1% неизмененного соединения и 42,1% метаболитов от введенной дозы препарата.

5) На основе анализа структуры метаболитов афобазола в органах, тканях и экскрементах крыс определены основные пути биотрансформации препарата: гидроксилирование по ароматическому кольцу бензимидазольного цикла и окисление по морфолиновому фрагменту.

6) Целесообразность создания лекарственных форм для орального применения афобазола, в том числе и пролонгированного действия, подтверждена его высокой степенью абсолютной биодоступности в эксперименте (43,6%).

Ill.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В настоящей диссертационной работе изучены биотрансформация и фармакокинетика производного бензимидазола — нового селективного анксиолитика афобазола, разработанного в ГУ НИИ фармакологии им. В. В. Закусова РАМН.

Из анализа литературы следует, что производные бензимидазолов подвергаются интенсивным метаболическим превращениям в организме человека и животных. Так, омепразол полностью метаболизируется в печени, в моче при этом регистрируются 6 метаболитов данного препарата [107,108]. Аналогично, ланзопразол интенсивно метаболизируется в печени, в сыворотке крови регистрируются его 2 основных метаболита [67]. После внутривенного введения 80% от введенной дозы пантопразола подвергается интенсивной биотрансформации с образованием метаболитов, выводимых с мочой [117]. Афобазол в данном случае не является исключением. В результате масс-спектрометрического анализа нами наряду с неизмененным препаратом идентифицировано 17 продуктов его биотрансформации. Ни для одного известного представителя бензимидазольного ряда не обнаружено столь большого числа метаболитов.

По данным масс-спектральных характеристик и встречного химического синтеза были идентифицированы основной метаболит афобазола — 2-[2-(3-оксоморфолин-4-ил)этилтио]-5этоксибензимидазолМ-11, а также метаболиты М-3, М-6, М-7 и М-14.

Следует отметить, что большинство метаболитов относятся к продуктам окисления афобазола. На основании идентифицированных метаболитов в плазме крови крыс очевидно, что основными направлениями биотрансформации афобазола являются гидроксилирование по ароматическому кольцу бензимидазольного цикла и окисление по морфолиновому кольцу. Полученные в данном исследовании результаты по биотрансформации афобазола в плазме крови крыс согласуются с литературными данными. Так, например, ланзопразол и Н259/31 интенсивно метаболизируются в печени с образованием основных гидрокслированных метаболитов вследствие окисления ароматического кольца бензимидазольного цикла [24,75,98].

Из литературных данных известно, что в катализ реакций сульфоокисления и гидроксилирования производных бензимидазола основной вклад вносят такие изоформы цитохромов, как CYP2C19, CYP3A4, CYP1A1 и CYP2C9. Abelo et al. [24] на примере родственного по химической структуре афобазолу соединения омепразола было показано, что образование гидроксилированной формы омепразола катализируется CYP2C19, тогда как в биотрансформацию сульфона омепразола в основном вовлечен CYP3A4, кроме того, омепразол — умеренный конкурентный ингибитор CYP2C9 [80]. Аналогично, реакция образования сульфона ланзопразола катализируется преимущественно изоформой CYP3A4 [98,101], также, показано, что ланзопразол является мощным конкурентным ингибитором CYP2C19 [80]. Для целого ряда производных бензимидазола: омепразола, тиабендазола, ланзопразола, карбендазима показана возможность активации транскрипции гена CYP1A1 [35].

Таким образом, на основании структурного сходства, а также сходства основных направлений биотрансформации афобазола с целым рядом производных бензимидазола, таких как ланзопразол, омепразол, пантопразол, альбендазол, тиабендазол и др., можно предположить, что в катализе реакций гидроксилирования, являющихся основными в метаболизме как афобазола, так и вышеперечисленных препаратов, задействованы те же изоформы цитохромов, а именно CYP2C19, CYP3A4, CYP1A1 и CYP2C9.

Если в ходе дальнейших экспериментов подтвердится данное предположение, то афобазол можно будет целенаправленно назначать совместно с метаболизируемыми системой CYP препаратами, изменяя активность микросомальных монооксигеназ в нужном направлении с целью повышения эффективности проводимой фармакотерапии.

Очень важно отметить, что для изоформ CYP2C9 и CYP2C19 выявлен полиморфизм, то есть распределение в популяции активности этих ферментов не является однородным, а характеризуется наличием двух или более групп, что отразится на эффектах лекарственных средств. Данная проблема межиндивидуальных различий при приеме препаратов, метаболизируемых полиморфными изоформами ферментов, является одной из центральных в клинической фармакологии.

В литературе, описывающей полиморфизм окисления лекарственных средств, часто употребляются другие характеристики фенотипов. Индивидуумов с недостаточным метаболизмом некоторых препаратов называют «poor metabolizers» (или РМ-фенотип) по сравнению с нормальными — «extensive metabolizers «(или ЕМ-фенотип) (U.A. Meyer, 1996) [92]. Метаболический путь, приводящий к полной элиминации лекарства, имеет большое значение. Если поврежденный метаболический путь является минорным, то другие метаболические пути, вовлекающие различные изоформы цитохрома Р-450, могут компенсировать эти потери, следовательно, больших различий в распределении между фенотипами не будет. Однако, если нарушения ассоциированы с основным путем, между фенотипами возникают существенные различия. Повышение концентрации препарата в плазме у пациентов с недостаточно интенсивным метаболизмом может сопровождаться усилением фармакологического эффекта.

Поэтому, базируясь на нашем предположении о вовлеченности полиморфных изоформ CYP2C9 и CYP2C19 в метаболизм афобазола, в клинике чрезвычайно перспективным является исследование количественного соотношения афобазола и его образующихся метаболитов, что позволит выявить и разделить пациентов на группы, характеризующиеся различной степенью интенсивности метаболизма.

Отсюда косвенно можно судить о фенотипе окисления: РМ-фенотип или ЕМ-фенотип.

Афобазол, как и многие другие производные бензимидазолов, характеризуется выраженными мембранотропными свойствами, поэтому при различных способах введения интенсивно проникает в органы и ткани, в том числе, участвующие в I фазе биотрансформации ксенобиотиков, следствием чего является его выраженная биотрансформация.

При внутрибрюшинном и пероральном введении афобазол, подобно другим производным бензимидазола, быстро всасывается, интенсивно биотрансформируется, распределяется по органам и элиминирует из организма с периодом полувыведения 0,53 ч. Из литературных источников известно, что многие производные бензимидазола с большой скоростью всасываются в системный кровоток, и в то же время характеризуются незначительными периодами полувыведения из организма. Например, элиминация бемитила из крови носит двухфазный характер с периодом полувыведения, составляющим в а-фазе 1,11ч, в Р-фазе — 1,86 ч [4], период полувыведения этомерзола составляет 2,43 ч [2,8], период полувыведения омепразола у здоровых лиц равен в плазме 0,5−1 ч [106,107], период полувыведения пантопразола — 1,9 ч [104].

В ходе настоящего исследования было установлено, что несмотря на эффект первого прохождения через печень, при пероральном способе введения для афобазола характерна высокая степень абсолютной биодоступности, которая составляет 43,6%, что еще раз указывает на значительную мембранотропность препарата. Поэтому перспективным является применение пероральных лекарственных форм селективного анксиолитика афобазола.

Установлено также, что афобазол и его метаболиты обладают средней интенсивностью проникновения в орган-мишень мозг.

Сравнительный анализ величин степеней превращения афобазола в основные метаболиты показал, что препарат интенсивнее метаболизируется в биопродукт М-11 при пероральном введении (0,680), чем при внутрибрюшинном (0,253). Таким образом, в данном случае очевиден эффект первого прохождения через печень при пероральном введении афобазола. В то же время величины степеней превращения афобазола в метаболиты М-6 и М-7 после перорального и внутрибрюшинного способов введения характеризуются приблизительно одинаковыми величинами. Для биопродукта М-6 величина степени превращения составляет при пероральном введении — 0,153, при внутрибрюшинном введении — 0,145. Для метаболита М-7 аналогичный параметр составляет при пероральном введении — 0,044, при внутрибрюшинном введении — 0,066. Из этого следует, что эффект первого прохождения афобазола через печень практически не влияет на интенсивность образования метаболитов М-6 и М-7.

Высокие величины степеней превращения афобазола в метаболит М-11 свидетельствуют о том, что один из основных путей биотрансформации препарата заключается в окислении морфолинового кольца.

Анализ абсолютных величин концентраций афобазола и его метаболита 11 при пероральном способе введения показал, что данные величины имели близкие значения, а в некоторых биологических образцах величины концентраций М-11 превышали таковые исходного соединения. Основываясь на полученных данных, можно предположить, что в случае наличия фармакологической активности у метаболита 11, данное соединение внесет соответствующий вклад в реализацию фармакологических эффектов афобазола.

В моче и кале животных, как показали проведенные исследования, основным метаболитом афобазола является М-3 (гидроксилированная форма по 5-му положению бензимидазольного цикла). Причем, содержание его в моче превышает содержание в кале в 17 раз. Кроме того, в моче крыс обнаружена глюкуроноконъюгированная форма метаболита М-3. Также в значительных количествах по сравнению с исходным соединением и метаболитом М-6 в моче регистрировались М-7 и сульфон афобазола. Метаболит М-6 (сульфоксид афобазола) вторично необратимо окисляется с образованием сульфона афобазола.

Важно отметить, что циклизованная форма метаболита М-7, присутствующая в плазме крови, в моче и кале крыс не обнаружена даже в следовых количествах.

Остальные метаболиты афобазола в суточной моче и кале определялись в чрезвычайно малых количествах, в том числе и метаболит М-11, являющийся основным метаболитом в плазме крови крыс. Связано это, скорее всего с тем, что 5-й атом углерода бензимидазольного цикла подвергается вторичной реакции гидроксилирования. Данное предположение подтверждается литературными примерами образования вторичного метаболита омепразола гидроксисульфона [32], а также двух гидроксилированных по алифатической цепи вторичных метаболитов альбендазола — 2-гидроксипропилсульфона и 3-гидроксипропилсульфона [61].

Таким образом, полученные в исследовании результаты подтверждают тот факт, что выведение производных бензимидазола в большей степени происходит за счет образования гидроксилированных метаболитов по ароматическому кольцу как в конъюгированных, так и в неконъюгированных формах [31, 32, 49, 67].

Следует также отметить, что за одни сутки от введенной дозы препарата с мочой выводится 40% идентифицированных метаболитов, тогда как с калом не многим более 1,3%, что подтверждается рядом литературных данных по изучению экскреции производных бензимидазола. Показано, например, что 80% метаболитов от введенной дозы омепразола экскретируются с мочой и лишь небольшая часть с калом [106]. После однократного перорального введения ланзопразола приблизительно 20% выводится с мочой в виде конъюгированных и неконъюгированных метаболитов [67]. Паитопразол подвергается интенсивной биотрансформации с образованием метаболитов, которые на 80% выводятся с мочой. Оставшаяся часть от введенной дозы подвергается желчной экскреции и выводится в виде метаболитов с калом [117].

Анализируя в целом результаты изучения экскреции афобазола и его метаболитов с мочой и калом крыс, важно отметить, что элиминация афобазола из организма крыс происходит главным образом за счет биотрансформации препарата в печенисуммарное выведение метаболитов с мочой крыс за сутки в среднем в 30 раз превышает выход за то же время метаболитов с каломодним из главных направлений биотрансформации препарата является образование гидроксилированных по ароматическому кольцу бензимидазольного цикла метаболитов афобазола.

На основании проведенных фармакокинетических исследований, а также сопоставления полученных результатов с литературными данными, вследствие высокой абсолютной биодоступности афобазола можно рекомендовать применение его пероральных лекарственных форм.

Кроме того, подтверждена целесообразность применения афобазола в качестве дневного анксиолитика и средства премедикации, поскольку афобазол характеризуется быстрым всасыванием, распределением (в течение 15 мин) и выведением из организма (после 3-х часов определяются следовые количества в плазме как самого препарата, так и его метаболитов).

Полученные результаты по изучению фармакокинетики афобазола и его метаболитов при внутривенном, внутрибрюшинном и пероральном способах введения препарата позволяют заключить, что лекарственное вещество и его метаболиты элиминируют из организма животных с высокой скоростью. Поэтому для поддержания эффективных концентраций афобазола в системном кровотоке рекомендуется применение таблетированной лекарственной формы через короткие временные интервалы и в течение длительного времени. Это не может привести к передозировкам, так как афобазол вследствие особенностей своего химического строения и величин тканевой доступности не способен к кумуляции в органах. В то же время для упрощения режима дозирования афобазола необходима разработка лекарственной формы с пролонгированным действием.

В результате исследования количественного соотношения афобазола и его метаболитов возможна косвенная оценка фенотипа окисления (РМ/ЕМ-фенотип) в клинике.

Наконец, афобазол и его метаболит М-11 характеризуются близкими значениями абсолютных величин тканевой доступности в мозге, поэтому очевидна перспектива изучения фармакологической активности основного продукта биотрансформации афобазола — метаболита 11.