Влияние векторной составляющей на цитотоксическую активность и внутриклеточный транспорт конъюгатов, содержащих каталитическую субъединицу рицина

Конъюгаты, содержащие каталитическую субъединицу рибосоминактивирующего белка (РИБ) рицина и векторную молекулу, представляют собой препараты направленного действия, способные к избирательной элиминации клеточных популяций. Это одна из возможных реализаций концепции «магической пули», предложенной Паулем Эрлихом еще на рубеже 18 и 19 столетий. В настоящее время достигнуты определенные успехи в применении конъюгатов на основе РИБ при терапии лейкозов, а также в качестве специфических иммунодепрессантов в трансплантологии. Однако современный уровень реализации концепции не позволяет широко применять препараты этой группы в клинической практике. Несмотря на кажущуюся легкость создания и применения таких терапевтических агентов, пока не создано препарата, который являлся бы абсолютно эффективным при лечении онкологических заболеваний. Причина неудач кроется в недостаточном понимании механизмов взаимодействия конъюгатов, содержащих фрагменты РИБ, с клетками-мишенями. Интоксикация клеток такими молекулами — сложный многоступенчатый процесс, в ходе которого молекула токсина вступает во взаимодействие с различными клеточными структурами. Опубликовано много работ о внутриклеточном транспорте различных РИБ и рицин является одной из наиболее изученных молекул, однако существует мало данных, отражающих внутриклеточный транспорт конъюгатов, содержащих субъединицы РИБ. Связывающая субъединица рицина (RTB) не только обуславливает взаимодействие молекулы с поверхностью клетки, но и направляет ее в клеточные компартменты, откуда происходит транслокация каталитической субъединицы (RTA) в цитозоль, в результате чего RTA достигает своей клеточной мишени — рибосомы. Взаимодействие RTA с рибосомой приводит к остановке синтеза белка и гибели клетки. Замена векторной составляющей не только меняет специфичность связывания с поверхностными рецепторами, но и оказывает влияние на взаимодействие интернализуемой молекулы с клеточными структурами, что может приводить к доставке конъюгата в компартменты, из которых затруднена транслокация. Особый интерес представляют данные сравнительного анализа внутриклеточного пути и биологической активности рицина и его структурного и функционального аналога — вискумина (MLI) [Krauspenhaar et al, 1999]. Активность каталитической субъединицы вискумина (MLA) в бесклеточной системе сопоставима с активностью RTA [Barbieri et al, 1993]. Связывающая субъединица вискумина (MLB) отличается от RTB пространственной организацией галактозсвязывающих центров, что приводит к существенным различиям в цитотоксической активиости и внутриклеточном транспорте рицина и вискумина [Moisenovich et al, 2002].

Сравнительный анализ внутриклеточного транспорта пативиого рицина и различных конъюгатов на основе RTA позволит получить информацию о роли векторной части РИБ и их производных в интоксикации клетки. Эта информация необходима для создания нового поколения препаратов направленного действия, обладающих высокой специфической цитотоксической активностью и незначительными побочными действиями при клиническом применении.

Цель и задачи работы: Целью данного исследования является проведение сравнительного анализа транспорта и цитотоксической активиости конъюгатов RTA с векторными молекулами, использующими разные внутриклеточные пути.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методы дополнительной очистки и контроля чистоты препаратов субъединиц рицина.

2. Синтезировать и провести очистку конъюгатов трансферрин-RTA (TF-RTA), эпидермальный фактор роста-RTA (EGF-RTA), а также химерных молекул MLB-RTA, RTB-MLA.

3. Провести сравнительный анализ внутриклеточного транспорта EGF, трапсферрина, рицина и вискумина.

4. Оценить цитотоксическую активность TF-RTA, EGF-RTA, MLB-RTA, RTB-MLA, а также нативных молекул рицина и вискумина.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые проведен сравнительный анализ цитотоксической активности конъюгатов RTA с векторными молекулами, определяющими ее доставку в различные клеточные компартменты. Показано, что наибольшей цитотоксической активностью обладали коныогаты, содержащие вектор, который направляет RTA в компартмент, вовлеченный в транспорт основного пула нативного рицина. Полученная информация важна для разработки дизайна иммунотоксинов нового поколения. Синтезированные коныогаты EGF-RTA и TF-RTA представляют собой потенциальные терапевтические агенты.

Нами показано, что рицин влияет на внутриклеточный транспорт EGF, снижая процент молекул, попадающих в лизосомы.

Совместно с к.б.н. Е. Н. Поповой получена серия моноклональных антител, дискриминирующих изолированную каталитическую субъединицу рицина от нативного токсина. На основе этих антител разработана тест-система, позволяющая выявлять нанограммовые количества RTA в присутствие нативного рицина.

Разработаны методы дополнительной очистки компонентов цитотоксически-активных конъюгатов, позволяющие в дальнейшем минимизировать побочные эффекты при применении их в терапии онкологических заболеваний.

Выводы.

1) Дополнительная аффинная очистка связывающей субъединицы рицина позволила получить препараты RTB, пригодные для сравнительного анализа транспорта RTB с другими векторными молекулами.

2) Был получен препарат RTA, не содержащий минорных примесей RTB и не обладающий цитотоксической активностью при концентрации 10″ 7 М.

3) Сравнительный анализ внутриклеточного распределения векторных молекул и токсинов выявил существенные различия в транспорте TF и R60- при этом наблюдался высокий уровень колокализации EGF и R60.

4) На клетках линии А431 при взаимодействии с клеточными структурами рицин и вискумин проявляют специфичность, которая выражается в их ассоциации с разными доменами плазматической мембраны и эндосомального компартмента.

5) Цитотоксическая активность RTA в составе исследованных конъюгатов и химерных молекул зависит от особенностей внутриклеточного транспорта векторной части.

6) Наибольшей цитотоксической активностью обладали конъюгаты, содержащие векторную составляющую, которая обуславливает доставку RTA в компартмент, вовлеченный в транспорт основного внутриклеточного пула R60.

Заключение

.

Рицин способен проникать в клетку не только путем клатрин-зависимого эндоцитоза, но и клатрин-независимым путем (рис.5). Разнообразие способов интернализации рицина определяется разнообразием рецепторов, с которыми рицин может связываться благодаря своей лектиновой активности. После интернализации токсин обнаруживается в ранних эндосомах, куда он может направляться как из клатрин-окаймленных везикул, в случае клатрин-зависимого способа интернализации, так и из кавелосом, в случае клатрин-независимого захвата участка мембраны с иммобилизованным токсином кавеолами.

Затем рицин может либо вернуться на поверхность клетки с помощью ранних эндосом, либо быть доставлен в поздние эндосомы или в транс-Гольджи сеть. Приблизительно 5% интернализовавшегося токсина.

1,2,3 — >ндоц1гто1.

4 — pi НН 111*1 шлосомвльный.

КТ)М111|ТТМГМГ.

5 — неримуклеармый ришклинговый комлартиент.

6 — поишм эндосомы.

7 — .ihjocovih.

8 — япсирпт Гольджи.

9 — эндмиапиитический рстнкулум.

10 -ялро.

Рис. 5 Основные этапы внутриклеточного транспорта рицина (красные стрелки), TF (синие стрелки) и EGF (зеленые стрелки) пояснения в тексте). обнаруживается в, А Г и затем ретроградным транспортом направляется в эндоплазматический ретикулум, откуда транслоцируется в цитозоль.

Так называемые «грузовые (карго)» белки, к которым относятся EGF и TF, сортируются для дальнейшего транспорта тремя путями: быстрым рециклингом к клеточной поверхности [Sheff et al, 2002], медленным рециклингом через перинуклеарный рециклинговый компартмент и сеть транс-Гольджи, а также в лизосомы через поздние эндосомы (рис.5).

Комплекс, состоящий из трансферрина, присоединенных к нему двух атомов железа и TFR интернализуется в клетку путем клатрин-зависимого эндоцитоза и сначала вступает в клатрин-окаймленные ямки, а затем движется через ранние эндосомы. При низких значениях рН в эндосомах происходит процесс отщепления атомов железа, при этом связь TF-TFR сохраняется. Через аппарат Гольджи проходит 2025% этого комплекса. Затем TF направляется либо к поздним эндосомам, либо в (перинуклеарные рециклинговые эндосомы или аппарат Гольджи). Большая часть интернализованного трансферрина подвергается рециклингу и удаляется из клетки. Приблизительно 65−70% TF-TFR после диссоциации атомов железа напрямую возвращается на поверхность клетки.

Комплекс EGF-рецептор интернализуется как клатрин-зависимым, так и клатрин-независимыми путями (рис.5). После интернализации комплекс рецептор-лиганд доставляются в ранние эндосомы, расположенные на периферии цитоплазмы, которые участвуют в регуляции транспорта между плазматической мембраной и различными внутриклеточными компартментами. Оттуда EGF через специфический рециклинговый компартмент частично возвращается на поверхность плазматической мембраны. Однако, основная его часть гидролизуется в лизосомах.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1 Материалы.

Сухие культуральные среды RPMI-1640, ДМЕМ, (Gibco Laboratories, Германия) — Bodipy-ceramide, А1еха568, LysoTraker (Molecular Probes, Leiden, Нидерланды) — конъюгат кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши с пероксидазой, конъюгат стрептавидина с пероксидазой (ИМТЕК, Россия) — Sephadex G-25, протеин-А-сефароза, BrCn-активированная сефароза 4 В (LKB-Pharmacia, Uppsala, Швеция (Pharmacia, Sweden), рицин и вискумин (ML1) были любезно предоставлены профессором А. Г. Тоневицким (Научно-исследовательский институт трансплантологии и искусственных органов (НИИТиИО), Москва). Культуральная пластиковая посуда (Nunc, Дания и Costar, США) — полистироловые 96-луночные платы для твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА) (Costar, США). Мышиные моноклональные антитела серии RAK и монАт 2RBK1 были получены нами совместно с к.б.н. Е. Н. Поповой. Остальные реактивы были получены от Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Германия.

2.2 Методы.

2.2.1. Клеточные линии.

Клетки фибробластов линии NIH ЗТЗ, клетки эпидермальной карциномы человека линии А431, HeLa (эпителиоидной карциномы шейки матки человека) и CaOv (рака яичника человека) были любезно предоставлены профессором Ю. Бирайтером-Ханом (Университет им. Гете, Франкфурт-на-Майне, Германия). Клетки культивировали при 37 °C в присутствии 6.1% СОг в пластиковых флаконах в среде DMEM, содержащей 10% СПК. Клетки миеломы линии sp2/0 были любезно предоставлены с.н.с. Е. Р. Полосухиной (Институт Канцерогенеза, Москва). Клетки культивировали при 37 °C в присутствии 6.1% С02 в пластиковых флаконах в среде RPMI-1640, содержащей L-глутамин, 0.2% ЫаНСОз, 80 мкг/мл сульфата гентамицина, 10% СПК.

2.2.2 Получение гибридом.

Мышей линии Balb/c (НИИ биомоделей РАМН, Россия) иммунизировали RTA последующей схеме: 0 день — RTA 5мкг в полном адъюванте Фрейнда- 14 день — RTA 5 мкг в неполном адыованте Фрейнда- 22 день — RTA 5 мкг в ФСБ- 29 день — RTA 5 мкг в ФСБ- 57 день — RTA 2 мкг в ФСБ. Титр антител в сыворотках контролировали при помощи ТИФА. Слияние спленоцитов с миеломой линии sp2/0 проводили на третий день после последней иммунизации в ПЭГ [Davidson R.L. et al., 1977]. Первичные гибридомы культивировали на среде RPMI 1640 в присутствии HAT. В качестве дополнительного селективного фактора для отбора устойчивых к рицину гибридом в среду добавляли 10″ 11 М R60. Через две недели после слияния отбирали культуральную жидкость для выявления в ней активности антител. Супернатанты скринировали при помощи ТИФА с биотинилированными R60, RTA (R60-bi, RTA-bi). Культуры, представляющие интерес, были клонированы методом лимитирующих разведений, размножены и заморожены. Затем были отобраны гибридомы, взаимодействующие с RTA-bi, но не с R60-bi. Эти гибридомы многократно клонировали методом лимитирующих разведений. МАт накапливали в асцитной жидкости и выделяли методом аффинной хроматографии на протеин-А-сефарозе.

2.2.3 Системы ТИФА.

2.2.3.1 Твердофазный иммуноферментпый анализ для определения реакции антител с биотинилированными антигенами.

Очищенные моноклональные антитела в ФСБ иммобилизовали в лунках 96-луночной платы (по 1мкг в лунку) в течение 2-х часов при 37 °C. Для иммобилизации антител из сывороток или супернатантов использовали платы, предсенсибилизированные кроличьими антителами против иммуноглобулинов мыши. В лунки, содержащие иммобилизованные антитела добавляли на 60 минут биотииилированные антигены в ФСБ/ 0.05%(V/V) Твин-20/ 25 мМ a-D-лактозы. После удаления биотинилированных антигенов в лунки вносили конъюгат стрептавидин-пероксидаза в ФСБ/ 0.05%(V/V) Твин-20 и инкубировали 60 мин. Все инкубации проводили при 37 °C. В качестве хромогенного маркера пероксидазной реакции использовали 0.5 мг/мл ОФД в в 0.05 М цитрат-0.1 М фосфатном буфере (рН 5.0−5.5), содержащем 0.5% Н2Ог. После 15-минутной инкубации при 37 °C реакцию останавливали 10%-ной серной кислотой. Калориметрические измерения проводили на униплане «Пикон» при длине волны 492 нм.

2.2.3.2. Сэндвич-ТИФА для выявления свободной каталитической субъединицы рицина.

Очищенные моноклональные антитела иммобилизовали в лунках 96-луночной платы, оставшиеся на плате активные сайты связывания блокировали БСА. В лунки, содержащие иммобилизованные антитела добавляли на 60 минут антигены (R60, RTA) в ФСБ/ 0.05%(V/V) Твин-20/ 25 мМ a-D-лактозы. После удаления антигенов в лунки вносили вторые биотииилированные монАт (1мкг/мл в ФСБ/ 0.05%(V/V) Твин-20/ 25 мМ a-D-лактозы) и инкубировали 60 мин. После удаления биотинилированных антител проводили 60-минутную инкубацию с конъюгатом стрептавидин-пероксидаза в ФСБ/ 0.05%(V/V) Твин-20. В качестве хромогенного маркера пероксидазной реакции использовали 0.5 мг/мл ОФД в в 0.05 М цитрат-0.1 М фосфатном буфере (рН 5.5), содержащем 0.5% Н2О2. Все инкубации проводили при 37 °C. После 15-минутной инкубации при 37 °C реакцию останавливали 10%-ной серной кислотой. Калориметрические измерения проводили па униплане «Пикон» при длине волны 492 нм.

2.2.4 Биотинилирование белков.

Белки (R60, RTA, мАт) копъюгировали с биотинамид-N-гидросукцинимидным эфиром в соответствии с рекомендациями производителей («Sigma», США). Биотинамид-Ы-гидросукцинимидиый эфир растворяли в ДМСО (10мг/мл) и добавляли к белкам, находящимся в ФСБ или, в случае R60 и RTA, в ФСБ с 20 мМ лактозой, и инкубировали в течение 15 часов при +4°С. Концентрация белков составляла не менее 0,3мг/мл, молярное соотношение белок/биотин -1/20. Реакцию останавливали 0,01% NaN3. Белки очищали от несвязавшегося биотинамид-М-гидросукцинимидного эфира с помощью гельфильтрации на Sephadex G25. Белок элюировали с колонки ФСБ. Качество биотинилирования оценивали с помощью ТИФА.

2.2.5 Очистка моноклональпых антител (мАт).

Очистку мАт проводили на протеин-А-сефарозе. Асцитную жидкость центрифугировали 10 мин со скоростью 10 тыс об/мин. К супернатаиту добавляли равный объем 3 М глицина (рН 9.2) и сухой хлорид натрия NaCl до 3 М, суспендировали и центрифугировали 10 мин со скоростью 10 тыс об/мин. Полученный супериатант наносили па колонку с протеин-А-сефарозой, уравновешенную связывающим буфером (рН 9.0),.

48 содержащим 1.5 М глицин и 3 М NaCl, и промывали этим же буфером до 0.3 оптических единиц (о.е.). Элюцию антител с колонки проводили в два этапа: сначала элюирующим буфером I (рН 6.8), содержащим 0.03 М Трис и 0.01 М NaCl, до 0.5 о.е., а затем — элюирующим буфером II рН (3.0), содержащим 0.1 М цитрат натрия и 0.15 М NaCl, до 0.3 о.е. Нейтрализацию рН элюирующего буфера II проводили с помощью 1 М Трис (рН 8.8). После элюции колонку последовательно отмывали 10-кратным объемом ФСБ (рН 7.4), 3-кратным объемом регенерирующего буфера (рН 7.2), содержащего 2 М гуанидин-HCl и 0.1 М Трис, и уравновешивали 8-кратным объемом связывающего буфера (рН 9.0), содержащего 1.5 М глицин и 3 М NaCl. Чистоту полученных фракций контролировали с помощью электрофореза в ПААГ. Фракции мАт, не содержащие примеси, объединяли и диализовали против ФСБ.

2.2.6 Иммобилизация мАт 2RBK1 на BrCN-активироваппую сефарозу 4 В.

Иммобилизация антител проводилась согласно рекомендациям фирмы-производителя аффинного сорбента (Pharmacia Biotech, USA). BrCN-активированную сефарозу 4 В (1мг) замачивали в Змл 1 мМ НС1 на 15мин. Набухший сорбент «отмучивали» в 1 мМ НС1 3 раза по 15 мин. 700 мкл (8мг/мл) мАт 2RBK1 в 0,1 М гидрокарбонатном буфере, содержащем 0,5 М NaCl, рН 9,0, смешивали с подготовленным сорбентом и инкубировали в течение 16 часов при комн. температуре на «качалке». Сорбент переносили в колонку и промывали 10 объемами 0,2 М глицина, рН 8,0 для блокировки свободных имидокарбонатных групп. Раствор, выходящий с колонки, собирали фракциями по 1,5мл и оценивали количество неиммобилизовавшихся мАт спектрофотометрически. Сорбент несколько раз промывали попеременно ацетатным (0,1 М ацетат натрия с рН 4,0, содержащий 0,5 М хлорид натрия) и карбонатным (буфер для иммобилизации антител) буферами. Далее колонку промывали 10 объемами ФСБ с ЫаЫз и хранили в таком виде при +4°С.

2.2.7Дополнительная очистка RTA.

Дополнительную очистку цепей R60 проводили методом аффинной хроматографии. RTA очищали на 2RBKl-ceфapoзe 4 В. Для дополнительной очистки RTB использовали сорбент на основе монАт 1RAK3. Связывание примесных белков с сорбентом проводили в ФСБ с 20 мМ лактозой, рН 7,4, элюцию — в 0.2 М глициновом буфере, содержащем 1.5М NaCl, рН2.2. Чистоту полученных препаратов контролировали с помощью электрофореза в ПААГ и ТИФА.

2.2.8 Клеточные лизаты и супернатанты.

Клетки инкубировали 2 минуты в присутствии рицина. После чего трижды отмывали от несвязавшегося токсина и инкубировали 20 часов в СОг-инкубаторе. Затем супернатанты отбирали, а к клеткам добавляли лизирующий буфер из расчета 1 мл буфера на 106 клеток. Использовали лизирующий буфер следующего состава: 0,1 М NaCl, ЮмМ Na2HP04, 1% Triton Х-100 и 1 мМ PMSF, рН 7,4. Лизаты центрифугировали Юмин при 5000 об/мин и хранили при -20° С. Перед экспериментром лизаты разводили в 100 раз в ФСБ. Супернатанты при необходимости концентрировали в ячейке фирмы «Amicon» с фильтром РМ-10.

2.2.9 Трансфекция клеток линий Л431.

Для трансфекции использовали плазмидный вектор pEGFP СЗ, кодирующие белки rab4a, rab 11, включающий гены TRPV4 и GFP, находящиеся под одним опероном, (конструкция была предоставлена профессором Берейтер-Ханом) и набор Effectene Transfection Kit, состоящий из буфера ТЕ (рН 7−8), ДНК-конденсирующего буфера ЕС, энхансера (усиливающего агента), трансфекционного реагента Effectene.

За день до трансфекции на пластиковую чашку Петри диаметром 60 мм перенесли от 200 до 800 тыс. клеток А431 в 5 мл среды DMEM, содержащей 10% сыворотка FBS, так, чтобы в день трансфекции на чашке было 40−80% монослоя. Для трансфекции 1 мкг ДНК, растворённой в буфере ТЕ (рН 7−8), развели в ДНК-конденсирующем буфере ЕС до общего объёма 150 мкл. К полученной смеси добавили 8 мкл энхансера, интенсивно перемешали в течении 1 сек и инкубировали 2−5 мин при комнатной температуре. Затем добавили 25 мкл трансфекционного реагента Effectene к смеси ДНК-энхансер и перемешали пипетированием 5 раз. Для образования трансфекциопных комплексов образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 5−10 мин. Во время данной инкубации из чашки Петри аккуратно отобрали среду культивирования, отмыли клетки 1 раз в 4 мл PBS (рН 7.4) и добавили к ним 4 мл свежей среды DMEM, содержащей 10% сыворотки FBS. В пробирку с трансфекционными комплексами добавили 1мл среды DMEM (10% FBS), перемешали 2 раза пипетированием и по каплям добавили полученную смесь к клеткам, находящимся в чашке Петри. Инкубировали 24 часа при 37 °C в присутствии 6.1% С02.

Эффективность трансфекции клеток А431 составила 5%. Для увеличения количества гаЬ4- и rabl 1-позитивных клеток применяли культивирование на селективных средах с последующим отбором положительных клонов. После 30 дней культивирования на среде, содержащей 1 мг/мл G418 количество клеток, экспрессирующих гаЬ4 и rabl 1 составляло более 20% для обоих белков. Клетки культивировали на пластиковых флаконах в низкой плотности таким образом, что после 5 дней культивирования образовывались отдельшле клоны. Клон, дающий наиболее сильный положительный сигнал, целиком извлекли из флакона и пересадили в селективной среде DMEM (10% FBS, 1мг/мл G418) в новый флакон. Полученную клеточную линию А431 с 80% экспрессией клетками TRPV4-GFP использовали для дальнейшей работы.

2.2.10 Электрофорез в ПЛАГ.

Электрофорез проводили по методике, описанной ранее [Laemmli U.K., 1970]. 5−20 мкг белка растворяли в буфере, содержащем 0.125М Трис-НС1(рН6.8), 4% додецилсульфата Na, 20% глицерина, 10% 2-меркаптоэтанола, бромфеноловый синий, и кипятили 2 мин. Для проведения электрофореза в невосстанавливающих условиях образцы готовили в буфере, не содержащем меркаптоэтанол. Электрофорез проводили в 8% или 12% полиакриламидном геле (ПААГ), применяли пластины длиной 8 см и толщиной 0.75 мм. В катодный и анодный электродные резервуары заливали электродный буфер (рН 8.3), содержащий 25 мМ Трис, 192 мМ глицин и 0.1% додецилсульфата натрия. Молекулярные массы определяли в сравнении с маркерными белками. Электрофорез проводили в режиме постоянного тока: 10 мА при вхождении образца в гель и 15 мА в режиме разделения. После окончания электрофореза гель окрашивали 0.125% (в/о) раствором Кумасси R-250 в системе этанол/уксусная кислота/вода (50/10/40) в течение 60 мин и обесцвечивали в системе этанол/уксусная кислота/вода (5/7/88).

2.2.11 Конъюгаты EGF-RTA и TF-RTA.

Коныогаты получали по методике, описанной ранее [Carlsson et al, 1978], с использованием бифункционального реагента N-сукципимидил-3(2-пиридилтио-)пропионата (СПДП). Очистку полученных конъюгатов от несвязавшихся реагентов проводили гельфильтрацией на колонке Spherogel TSK 3000SW. Степень очистки проверяли с помощью электрофореза в ПААГ.

2.2.12 Получение конъюгатов трансферрина (Тф), epidermal growth factor (EGF), рицина и его субъединиц с различными флуорохромами.

Конъюгация с флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ). Сухой ФИТЦ разводили в ДМСО до концентрации 100 мг/мл. Белки (Тф, EGF, R60) переводили в карбонатный буфер (рН 9.0), содержащий 1 М NaHC03, 20 мМ лактозу (в случае R60 и RTA), и концентрировали до содержания 2 мг/мл. Затем смешивали растворы белка в карбонатном буфере и ФИТЦ в ДМСО так, чтобы получился 25-кратный молярный избыток ФИТЦа. Инкубировали с перемешиванием 24 ч при комнатной температуре. С помощью гель-фильтрации на колонке PD-10 с сорбентом Sephadex G-25 очищали пробы от несвязавшегося с белком ФИТЦ. Переводили белок в ФСБ (рН 7.4). Количество групп ФИТЦ, внесенных в одну молекулу белка, было оценено по следующей формуле:

Моль ФИТЦ/Моль белка = 2.87*ОП495/[ОП28о — ОП495*0.35].

Конъюгация с А1еха430, А1еха488, А1еха568. Для конъюгации использовали наборы Molecular Probes (Leiden, Нидерланды), в состав которых входят карбонатный буфер (рН 8.3), раствор гидроксиламина, колонка для гель-фильтрации, сосуд с А1еха430, А1еха488 или А1еха568, содержащий магнитную мешалку. Белок, растворенный в ФСБ (рН 7.4), концентрировали до содержания 2 мг/мл. К 0.5 мл раствора белка добавили 50 мкл карбонатного буфера (рН 8.3). Полученную смесь перенесли в сосуд с флуорохромом, содержащий магнитную мешалку. Инкубировали с перемешиванием 1 ч при комнатной температуре.

Реакцию останавливали 17 мкл раствора гидроксиламина. Инкубировали с перемешиванием 30 мин. С помощью гельфильтрации на колонке очищали пробы от несвязавшегося с белком красителя.

Количество групп А1еха568, внесенных в одну молекулу белка, было оценено по следующим формулам:

Моль А1еха568/Моль рицина = 1.85*ОП577/[ОП28о — ОП577*0.46],.

Моль А1еха568/Моль вискумина = 2.22*ОП577/[ОП28о — 0п577*0.46].

В результате были получены следующие конъюгаты: Тф-ФИТЦ, EGF-ФИТЦ, ЯбО-ФИТЦ, Тф-А1еха568, EGF-Alexa568, R60-Alexa568, RTB-Alexa568, RTA-Alexa430, RTA-Alexa488.

2.2.13 Реассоциация субъединиц токсинов.

Химерный токсин получали с помощью реакции тиолдисульфидного обмена. Изолированную В-субьединицу рицина или вискумина инкубировали в присутствии 5 мМ реактива Эллмана -5,5' -дитиобис-2-нитробензойная кислота (ДТНБ," Sigma", США) в течение 30 мин при комнатной температуре в ФСБ. Избыток реагента удаляли гель-фильтрацией на колонке PD-10 («Pharmacia»). А-субьединицу вискумина или рицина предынкубировали в присутствии 10 мМ ДТТ в течение 30 мин при комнатной температуре, затем с помощью гель-фильтрации на колонке с Sephadex G25 удаляли избыток ДТТ. 'Модифицированные субъединицы токсинов смешивали и инкубировали в течение 16 ч. Выход гетеродимеров, состоящих из А-субьединицы вискумина и В-субьединицы рицина или А-субъединицы рицина и В-субъединицы вискумина составлял 80−90% от общего количества белка. Очистку полученного химерного димера от мономерных субъединиц токсинов проводили гель-фильтрацией на колонке Superdex-75 HR (10×300мм) в системе FPLC. Химерный токсин анализировали электрофорезом в ПААГ в присутствии ДДС-Na.

2.2.14 Цитотоксический тест.

Цитотоксическое действие токсинов определяли по выживаемости клеток в присутствии токсинов по методике, описанной ранее [Mossman et al., 1983]. Клетки гибридом, находящихся в логарифмической фазе роста, трижды отмывали от продуцируемых мАт холодной средой RPMI 1640, ресуспендировали в среде RPMI 1640 с 10% ЭТС и распределяли по лункам 96-луночного плейта из расчета 5×104 клеток в 100 мкл на лунку. Предварительно в лунки того же плейта помещали токсины в разных концентрациях в среде RPMI 1640 с 10% ЭТС по 100 мкл в лунку. Клетки с токсинами инкубировали в атмосфере, содержащей 6% углекислого газа, при +37°С в течение 48 часов. По окончании инкубации клетки гибридом трехкратно отмывали от несвязавшегося токсина и в лунки вносили по 10 мкл раствора (2-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенил-тетразолиум бромида (МТТ) (5 мг/мл в ФСБ) и инкубировали при +37°С в течение 3 часов. После центрифугирования 96-луночного плейта (1200об/мин, ЗОмин), супериантную жидкость отбирали, осадок растворяли, добавляя в лунки по 200 мкл диметилсульфоксида (ДМСО, «Sigma»). Колориметрические измерения проводили на униплане «Пикон» при 540 нм. Согласно методике величина оптической плотности прямо пропорциональна числу живых клеток [Mossman et al., 1983]. За контроль (100%) принимали интенсивность окрашивания клеток, которых культивировали в отсутствии цитотоксических агентов. Контрольными клетками в экспериментах по устойчивости новых гибридомных клеток к действию цитотоксических агентов служила линия sp2/0.

2.2.15 Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия.

Для экспериментов клетки линии А431 так дикого типа, так и трансфецированные выращивали на покровных стеклах при 37 °C в присутствии 6.1% СОг. Перед получением изображений клетки фиксировали 4%-параформальдегидом и заключали в Мовиол. Для наблюдения за живыми клетками и получения временных серий изображений клетки выращивали на покровных стеклах, заключали в камеры для наблюдения, наполненные средой DMEM, содержащей или не содержащей 10% СПК и забуференной HEPES. В процессе получения изображений живых клеток их содержали в инкубационной камере микроскопа при 37 °C в присутствии 6.1% СОгЦифровые изображения были получены с помощью микроскопа Axiovert 200 М, оборудованного конфокальной сканирующей приставкой LSM51 ОМЕТА Zeiss, Германия. Серии оптических срезов получали либо с одного из каналов, либо синхронно с двух. Установку размеров pinhole для получения изображений с высоким разрешением проводили согласно рекомендациям производителей системы, для получения временных серий pinhole был открыт полностью для достижения максимальной глубины резкости. Для деконволюции изображений и подсчета колокализации использовали программное обеспечение Imaris 1, Imaris 3 и «Huygens» (Bitplane, Zurich, Швейцария). Дальнейшую обработку проводили с помощью программного обеспечения Adobe Photoshop 7.0.

Для полуколичественного анализа на изображении выделяли объекты, размеры которых превосходили 50 пикселей. Такие объекты интерпретировались как отдельные везикулы. Эта операция осуществлялась как для канала детектирующего изображение, обусловленное флуоресцентным сигналом, детектируемым от ФИТЦ (или GFP), так из канала, детектирующего флуоресцентный сигнал от Алекса 568. Считалось, что везикула содержит оба лиганда, если количество пикселей, полученных с каждого канала превышало 30% от общего числа пикселей. Данную процедуру проводили для каждого оптического (среза) слайда в конечном результате получали процент везикул содержащих оба лиганда.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

Одной из основных причин, по которой не удается создать иммунотоксин со свойствами «магической пули», является отсутствие векторных молекул, дискриминирующих в организме опухолевые клетки от клеток нормальных тканей. Одна из основных тенденций при конструировании современных иммунотоксинов — это уменьшение их молекулярной массы, что с одной стороны позволяет проникать токсинам в солидные опухоли, через межтканевые барьеры, а с другой стороны выводит иммунотоксины из-под действия иммунной системы. Как правило, такие иммунотоксины содержат один антиген-связывающий центр, вследствие чего их специфичность определяется специфичностью моновалентного взаимодействия антиген-связывающего центра с антигенной детерминантой. При этом взаимное расположение детерминант не влияет на сродство вектор-мишень, в то время как нативные токсины за счет поливалентного связывания обладают специфичностью к супрамолекулярным структурам. Конструирование векторных молекул с учетом различий в пространственном расположении детерминант является одним из путей создания высокоэффективных иммунотоксинов нового поколения. Интоксикация клетки-мишени РИБ или химерными молекулами, содержащими фрагменты РИБ — сложный многоэтапный процесс [Di Cola et al, 2005]. Финальной стадией этого процесса является взаимодействие каталитической субъединицы токсина с внутриклеточной мишенью — рибосомой. Этому взаимодействию предшествует многоступенчатый ретроградный транспорт цитотоксического агента [Iversen et al., 2001; Sandvig et al., 2000, Liu et al, 2006]. Нами проведен сравнительный анализ внутриклеточного транспорта и цитотоксической активности конъюгатов RTA и векторных молекул, направляющих RTA в различные участки эндосомального компартмента. Основная часть экспериментов выполнена на клетках линии карциномы человека А431, которые характеризуются повышенным уровнем экспрессии EGFи трансферрин-специфичных рецепторов [Zerial et al, 2001; Фильченков и др., 2000]. Для сравнительного анализа внутриклеточного транспорта использовали молекулы, меченные флуоресцентными красителями. Предыдущий опыт показал, что модификация молекулы флуоресцентным красителем способна влиять на внутриклеточный транспорт РИБ [Moisenovich et al., 2002]. Поэтому, предварительная часть экспериментов включала выявление влияния флуоресцентной метки на внутриклеточный транспорт и другие свойства молекулы, в том числе цитотоксическую и митогенную активности, а также способность модифицированной молекулы взаимодействовать со специфическими моноклональными антителами. Для дальнейших экспериментов отбирали только те фракции флуоресцентно меченых молекул, биологическая активность которых не отличалась от активности немеченых предшественников. Еще один фактор, который нам пришлось учитывать при проведении исследований — влияние сыворотки плода коровы на активность цитотоксических агентов. На рис. 6 представлена активность вискумина на клетках Sp2/0 при культивировании клеток в присутствии сыворотки Сс-pro (Германия) в сравнении с действием того же токсина на ту же линию клеток, но инкубированных в среде, содержащей сыворотку Gibco. Вероятно, подобная разница связана с неодинаковым соотношением ростовых факторов, определяемым технологическими особенностями приготовления сывороток. Все эксперименты по изучению цитотоксичности и транспорта проведены на сыворотке Gibco одного лота.

Сс-рго Gib go.

— IgM.

Рис. 6 Цитотоксическая активность вискумина на клетках Sp2/0 при использовании сывороток разных производителей.

3.1. Гибридомы, продуцирующие моноклоналыше антитела, дискриминирующие RTA от нативиого токсина.

При выращивании первичных гибридом в качестве дополнительного фактора селекции был использован рицин. В присутствии 10″ ПМ рицина выживали только клетки гибридом, способные продуцировать специфические антитела. Это позволило нам облегчить процедуру скрининга. Дальнейший отбор гибридом осуществлялся с применением системы ТИФА. Наряду с другими устойчивыми к интоксикации рицином гибридомами, было получено 6 клонов, продуцирующих моноклональные антитела, взаимодействующие с А-субъединицей рицина, но не с цельным токсином. Возможность получения данных клонов обусловлена присутствием на поверхности RTA области площадью около 1600 A2 [Katzin et al, 1991], экранированной в составе.

60 цельного токсина В-субъединицей. Кроме того, в этой области после диссоциации субъединиц рицина наблюдается частичное разворачивание полипептидной цепи, что способствует формированию уникальных эпитопов. Таким образом, наиболее вероятным местом локализации эпитопов, определяющих взаимодействие антител группы RAK с А-цепью рицина является область, расположенная в зоне контакта субъединиц.

Результаты цитотоксического теста показали, что клетки гибридом серии RAK являются более устойчивыми к действию рицина, чем клетки гибридом, не секретирующие антитела против этого токсина (табл. 1). Обладая устойчивостью к действию рицина, эти клетки сохраняют чувствительность к действию ML1 (табл. 1), который обладает сходным с R60 механизмом интоксикации клеток, но не связывается с антителами серии RAK. Таким образом, устойчивость гибридом серии RAK к действию R60 не связана с нарушением процессов ретроградного.

Клетки ЛД50 для ML1 (нг/мл) ЛД50 для R60 (пг/мл) sp 2/0 0,8 0,2.

1RAK3 0,9 120.