Усовершенствование технологии промышленного производства вакцины против тейлериоза крупного рогатого скота

Обеспечение животноводства и ветеринарии эффективными и качественными препаратами — одна из главных задач ветеринарной службы России. Огромная роль в решении этих задач отводится биотехнологииуправляемому получению целевых продуктов полезных для народного хозяйства, в том числе и ветеринарии с помощью биологических агентов: микроорганизмов, клеток животных и растений, вирусов, ферментов и антител.

Тейлериоз — остро и подостропротекающее протозойное кровопаразитарное заболевание крупного рогатого скота, буйволов, зебу и др. диких животных. Возбудители заболевания относятся к семейству Theileriidae, которые имеют овальную, кольцевидную и др. формы, локализуются внутри эритроцитов, а размножаются множественным делением или шизогонией в ретикул оэндотелиальн ой системе с образованием внеклеточных или внутриклеточных скоплений. Наиболее часто встречаются виды Th. annulata, Tb. parva, Th sergenti, Th. mutans. При тейлериозе повышается температура тела, наблюдается увеличение лимфатических узлов, расстройство сердечнососудистой и пищеварительной систем, отмечают паразитемию лимфатических узлов, паренхиматозных органов и крови. Возбудители передаются от больных или переболевших животных к здоровым пастбищными клещами сем. Ixodidae. (DolanT.T. 1989)(110).

Тейлериоз — это наиболее опасная из протозойных болезней крупного рогатого скота. Она наносит большой экономический ущерб животноводству республик Средней Азии, Закавказья, юга Казахстана и РФ (Р.Х. Нораев, 1983; З. В. Кущенко, Т. Г. Яременко, Д. Г. Досжанов 1989; A.A. Тяженов 1989; .Баданов Э. Т., Нораев Р. Х. 1981; Тяженов A.A. 1989 — Р. Х. Нораев 1996) (5−35−44−54−75).

За пределами СНГ тейлериоз зарегистрирован в Африке (Алжир, Египет, Тунис, Марокко, Судан, Ливия, Кения, Танзания, Уганда и др) в Центральной и Юго-Восточной Азии (Турция, Иран, Афганистан, Ирак, Сирия, Израиль, Индия, Китай, КНДР и др.) и, наконец, в Европе (Болгария, Румыния, 5.

Югославия, Греция, Испания, Италия, Кипр, Франция и др.) Т.Т. Dolan, 1989; Е. Pipano 1989; Hashemi-Fesharki R., 1986; Uilenberg G.- Uilenberg G., Sahrender В., Silayo R., 1978; Hashemi-Fesharki R., 1978; Hashemi-Fesharki R., 1986 — Morzaria S.P.- Nene V., 1990 (110−134- 136- 137−164- 181- 227−228).

Из 175 стран мира тейлериоз К PC встречается постоянно в 57 странах, при этом в 40 странах — спорадически (14 стран Африки, 18 — Азии, 3 — Европы, 4 — Океании и России, Казахстана, Узбекистана), в 7 странах наиболее часто (5 стран Африки и 2 — Азии) и в 10 странах в форме энзоотии (4 страны Африки, 5 — Азии и 1- Океании). Однако по многим странам мира отсутствуют данные по этому заболеванию. Для некоторых стран тейлериоз имеет большое экономическое значение, поскольку смертность достигает 60% и более (Эфиопия, Марокко, Корея, Иран, Тайвань, Уганда, Замбия, Зимбабве). Потери от тейлериоза определяются высокой смертностью (30−90%) заболевших животных, абортами, яловостью и снижением молочной продуктивности коров, уменьшением массы и ухудшением качества мяса убойных животных, расходами на содержание и лечение больных животных (Hashemi-Fesharki R. et. al., 1988(138).

Профилактика и меры борьбы с тейлериозом основаны на проведении мероприятий против клещей путем купания животных в специальных ваннах с акарицидами или опрыскивания животных этими препаратами. Практическую иммунизацию животных против тейлериоза проводят в следующих странах: Иран, Израиль, Россия, Казахстан, Узбекистан, Замбия и др. Для лечения больных животных применяют парвакон, диминазин, тетрациклин, окситетрациклин и др. антибиотики широкого спектра действия. Dolan Т. Т 1989; Subramanian G.- Bansal G.C., Ray D.- Srivastava R.V.N. 1989 -Subramanian G.- Srivastava R.V.N., Bansal G.C.- Ray D. 1988; Subramanian G., Ueitheni R., 1978, -Shukla P.C., Sharma R.D.,. 1991 — Subramanian G., Bansal G.G., Ray D., Srivastana R.V. N — Young A., Brown С. Burridge M., Cunningham M, Kirimi I., h-vin A, 1973; Шахматов Г. М., 1966. (78−110−203−204−205−206−211−233). 6.

Экономический анализ показал неэффективность проведения акарицидной обработки крупного рогатого скота против тейлериоза без ее сочетания с вакцинацией (Е. Pipano 1989). В связи с этим в течение 60 лет ведутся интенсивные исследования в области разработки более эффективной вакцины против данной инвазии. (Morzaria S.P. et. al., 1988; Нораев Р. Х., 1987 — Нораев Р. Х., 1988; Сахимов М. Р., Нораев Р. Х., Бадалов Э. Т., 1991; Dolan Т.Т., 1987 (47−49−66−109−166).

Большой экономический ущерб тейлериоз причиняет станциям искусственного осеменения при заболевании племенных быков-производителей, у которых нарушаются половая активность и сперматогенез. В условиях Казахстана, где все районы в эпизоотическом отношении отнесены к латентной зоне наиболее тяжело болеет завезенный высокопродуктивный скот породы лебединской улучшенной со швицкой, аулиеатинской и с наименьшими потерями мясного направления — казахской белоголовой. (Досжанов Д.Т. и др 1987)(19).

Об экономическом ущербе, наносимом этим заболеванием можно судить хотя бы по тому, что, например, в Кении ежегодно гибнет от тейлериоза (Th parva) 60−85 тыс. голов крупного рогатого скота. Ежегодные расходы Кении на обработку скота отклещей составляют 6−10 млн американских долларов (Pearson Т., et. al, 1979) (172).

Учеными Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им Я. Р. Коваленко создана культуральная высокоэффективная вакцина против тейлериоза крупного рогатого скота, профилактическая эффективность которой при производственном применении достигает 98−100%. Существующая промышленная технология изготовления вакцины против тейлериоза включает роллерное культивирование инвазированных тейлериями лимфоидных клеток теленка. Данный метод культивирования является технологически устаревшим, требует больших затрат труда, большого количества стеклянной посуды, не дает возможности 7 поддерживать оптимальные значения параметров культивирования. Метод глубинного культивирования клеток для приготовления вакцины является перспективным, снижает себестоимость вакцины, повышает гарантию надежности и экологическую безопасность.

Многие вопросы данного направления не были решены и нуждались в теоретическом обосновании, дальнейшей разработке и внедрении в практику. Работа выполнена в связи с программой Государственного комитета по науке и технике по решению научно-технической проблемы «Разработать и внедрить новые методы и средства, обеспечивающие стойкое ветеринарное благополучие сельскохозяйственных животных».

Цель и задачи исследований.

Целью исследований явилась разработка современной промышленной технологии производства вакцины против тейлериоза с использованием метода глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЬ. атш1а1а.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи: -провести анализ существующей промышленной технологии производства вакцины против тейлериоза;

— обосновать методы глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЬ. атш1а1а;

— разработать современную технологию производства вакцины против тейлериоза с использованием метода глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЬ. амшЫа.

Научная новизна. Обоснован, разработан и внедрен в промышленное производство метод глубинного периодического суспензионного 8 культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных тейлериями. Разработан алгоритм оптимального управления параметрами процесса глубинного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных тейлериями. Разработана современная промышленная технология производства вакцины против тейлериоза крупного рогатого скота с использованием метода глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЬ. ашш1а1а, защищенная патентом Российской Федерации (№ 1 828 915).

Практическая значимость. На основе проведенных исследований и практики разработана современная оптимизированная промышленная технология производства вакцины против тейлериоза с использованием метода глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЬ. ашшЫа. Разработаны изменения и дополнения к инструкции по изготовлению вакцины против тейлериоза, утверждены директором ВНИТИБП 25 ноября 1991 года.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены: на Всесоюзной конференции «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов», г. Москва, 1991 г.;

— на конференции «Производство и контроль медицинских, ветеринарных препаратов, опыт применения и реализации их в странах СНГ», посвященной 30- летаю Покровского завода биопрепаратов, 27−28 мая 1999 г.;

— на международной научно-практической конференции, посвзпценной 80-летию МАВМ и Б им. К. И. Скрябина — «Проблемы инфекционных и инвазионных болезней в животноводстве на современном этапе» — Москва, июнь, 1999 г.;

— получен патент на изобретение №:1 838 915 «Способ изготовления вакцины против тейлериоза» от 13октября 1992 г. 9.

По материалам диссертации опубликовано 3 печатных работы, получен патент на изобретение №: 1 838 915 «Способ изготовления вакцины против тейлериоза» от 13 октября 1992 г.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Обоснование и практическое использование метода глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных тейлериями в биореакторах;

2. Разработка современной промышленной технологии глубинного периодического суспензионного культивирования в биореакторах лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЬ. ашшЫа при производстве вакцины против тейлериоза;

3. Разработка алгоритма управления параметрами процесса глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных тейлериями;

4. Результаты сравнительных испытаний ранее существующей и предлагаемой промышленной технологии производства вакцины;

5. Практические предложения, вытекающие из разработанной оптимизированной современной технологии.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Учеными Всесоюзного научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Коваленко создана высокоэффективная культуральная вакцина против тейлериоза крупного рогатого скота, эффективность которой составляет- 98−100% (24).

Основной мишенью иммунного ответа крупного рогатого скота при тейлериозе являются инвазированные макрошизонтами лимфоциты. Антител к инвазированным лимфоцитам у больных тейлериозом и иммунных животных не обнаруживали. Клеточный иммунитет связан при данной инвазии с активацией цитотоксических клеток, в том числе и естественных киллеров.

В большинстве случаев тейлериоза наблюдают 2 пика повышения активности клеточного иммунитета. Важную роль в иммунитете животных при тейлериозе играют цитостатистические клетки. Максимальной концентрации эти клетки достигают через 3−4 недели, после иммунизации крупного рогатого скота спорозоитами или инвазированной макрошизонтами клеточной линией, а затем в течение 2 недель их количество постепенно снижается. У иммунных животных после заражения отмечают второй пик концентрации цитостатических клеток. Одним из основных иммуногенов макрошизонтов тейлерий оказался гликозилированный белок с молекулярной массой 95−120 кДт. Сыворотка крови животных, инвазированных тейлериями в первый раз, ингибирует проникновение паразита в лейкоциты. Этот эффект характеризуется видоспецифичностью и его выраженность одинакова дня всех штаммов тейлерий. Данные об иммунном ответе на пироплазмы и микромерозоиты тейлерий отсутствуют (Hall F.R., 1988) (132).

Морфологическую структуру мерозоитов Theileria sergenti в эритроцитах, взятых биопсией из костного мозга и селезенки экспериментально инвазированных тейлериозом телят в возрасте 8−10 мес. живой массой 150 кг, изучали методом электронной микроскопии. Проведенными исследованиями.

11 опыт продолжался 90−120 дней) выявлено, что длина мерозоитов Th. sergenti составила 1,0−2,5 мкм, они содержали ядро, рибосомы, вакуоли и хорошо выраженную эндоплазматическую сеть. Были обнаружены митохондриоподобная структура и экскреторноподобный феномен канальцев. У паразита выявлены 2 функции: питательная — выполняется через цитоплазму и экскреторная — через канальцы. (Higuchi S. et. al., 1984) (141).

Проблема иммунизации крупного рогатого скота против тейлериоза издавна интересовала многих исследователей. В различное время для иммунизации скота против тейлериоза применяли: кровь переболевших или больных животныхсуспензию клеток селезенки, лимфатических узлов и других органов больных тейлериозом животных, содержащую гранатные телатканевую стадию развития тейлерий (шизонты) — слабовирулентные штаммы паразита, полученные путем пассирования тейлерий через теплокровного хозяина без участия клещей-переносчиковинактивированные вакциныдозированную суспензию клеток слюнных желез инвазированных клещейметод двойной иммунизации, когда вначале вводят кровь донора, зараженного слабовирулентным штаммом, а спустя определенное время инокулируют более вирулентный местный штамм возбудителятейлерии, подвергнутые воздействию ионизирующего излученияметод введения стабилята тканей инвазированных клещей с одновременной обработкой животных антибиотиками тетрациклинового ряда и, наконец, живые вакцины, приготовленные из гранатных тел тейлерий, выращенных в культурах лимфоидных клеток крупного рогатого скота.

В 1903 г. R. Koch впервые с целью иммунизации применил кровь от переболевших тейлериозом животных (возбудитель Th. parva) (154). Однако привитые животные не давали никакой реакции на введение крови, оставались восприимчивыми к тейлериозу, заболевали при выпасе на пастбище и часто погибали. Theiler A., Stockmen S., в 1905 сообщили о том, что все без исключения животные, многократно привитые кровью по методу Коха.

12 заболели тейлериозом при выпасе на заклещеванных пастбищах (214). Theiler, А (1911;1912) применил с целью иммунизации крупного рогатого скота против тейлериоза материал, состоящий из клеток селезенки и лимфатических узлов, пораженных гранатными телами тейлерий (215). Со времени первых опытов Тейлера и до сентября 1912 г. по его методу было привито более 130 000 животных, но только 50−60% животных приобретали иммунитет. Е. Sergent, A. Donation and F. Lestoguard (1945) выделили слабовирулентный штамм тейлерий (Th dispar), названный «Куба», который был использован после 174 пассажей на крупном рогатом скоте без участия клещей — переносчиков. Его вирулентность была настолько слаба, что из 484 телят, через которых он проводился, пало только 12 (197). По данным Е. Sergent с соавторами (1945) с 1924 по 1942 г, в Алжире, Тунисе и Марокко тейлериями штамма «Куба» было вакцинировано 36 631 животное. Заболевание среди иммунизированных животных наблюдалось в 0,5−9% случаев, а среди не вакцинированных переболевало до 40% (197). Adler S., Ellenbogen V., (1934;1936) разработали метод двойной иммунизации скота против тейлериоза, который в дальнейшем усовершенствовали и применили в Израиле Tsur I., с соавторами (1941;1959) (87−89- 220−226). Вакцинированным телятам вначале вводили кровь донора, зараженного слабовирулентным штаммов «Куба» и др., а спустя 2−4 мес. инокулировали более вирулентный местный штамм Th. ammlata («Това»). При такой иммунизации смертность среди телят 0,6−3% (S Adler, V. Ellenbogen, 1935; L. Tsur 1949). Благодаря систематической иммунизации телят в энзоотических зонах потери от спонтанного тейлериоза снизились (88- 224).

Г. А.Оболдуев, И. Г. Галузо, З. М. Бернадская в 1926,1927 гг. для иммунизации крупного рогатого скота против тейлериоза (Th annulata) использовали дефибринированную кровь и суспензии, приготовленные из лимфатических узлов, селезенки, печени от больного животного. Среди привитых животных падеж составил в среднем 37,7% (55).

Исследования по использованию маловирулентных штаммов ТЬ ашшШа для иммунизации провел Д. В. Богородицкий (1946;1955). Для ослабления вирулентности через организм теплокровного хозяина без участия клещей-переносчиков пассировали четыре штамма возбудителя (937, 489, и Ватан). Наиболее пригодным для иммунизации оказался Ватан. В производственном опыте в Узбекистане иммунизировали 499 и бычков. Отход в процессе иммунизации составил 2,6% - за счёт тейлериоза, остальные животные легко переболели и приобрели стойкий иммунитет (12−15).

Е.А.Муратов (1955) изучал возможность иммунизации крупного рогатого скота против тейлериоза, пироплазмоза и бабизиоза в Таджиской ССР. Автор брал кровь от больных животных и разводил её изотоническим раствором хлористого натрия Разведенную кровь он вводил животным в подхвостовую складку. Этот метод был применен в 1952 г на 20 телятах, а в 1953 г. — на 25 коровах. На основании своих опытов автор сделал вывод, что иммунизация скота против смешанных форм пироплазмидозов методом введения под кожу постепенно возрастающих доз вирулентной крови безопасна и создает нестерильный иммунитет (43).

Р1рапо Е. е! а! (1969) для иммунизации использовали гранатные тела ТЬ. ашш1а1а из культуры лимфоидных клеток после инактивирования ультразвуком в течение 5 минут и добавления адъюванта Фрейнда. Получены положительные результаты при иммунизации телят в возрасте 3−5 месяцев. Телята приобрели напряженный иммунитет и не реагировали на контрольное заражение инвазированной кровью (175). Спустя 6 лет и Р1рапо Е., др., (1977) провели опыт по изучению возможности иммунизации крупного рогатого скота против тейлериоза вакцинами из убитых гранатных тел ТЬ. ашш1а! а. В опыте использовали три местных штамма тейлерий, которые вызывали смертность у восприимчивых животных в пределах 20−52%. Для приготовления вакцины использовали гранатные тела тейлерий, выращенные в культуре лимфоидных клеток крупного рогатого скота. Инвазированные лимфоидные клетки.

14 отмывали буферным солевым раствором, концентрировали, затем лиофилизировали и восстанавливали до первоначального объема деионизированной водой. И в завершении полученный материал подвергали воздействию ультразвука, а затем длительному центрифугированию, в результате которого получали опалесцирующий супернатант названный авторами «растворимой» вакциной, и осадок — «корпускулярная» вакцина. В результате эксперимента, проведенного на 57 животных, авторы пришли к выводу, что наивысшая степень защиты от заболевания при контрольном заражении инвазированной кровью обнаруживается у телят, привитых вакциной в смеси с адъювантом. Корпускулярная часть разрушенных паразитов являлась более эффективной, чем растворимая. Привитые инактивированной вакциной телята, которые противостояли контрольному заражению инвазированной кровью, оставались полностью восприимчивыми к тейлериозу, передаваемому инвазированными клещами-переносчиками (179). Результаты исследований Е. Pipano et. al., (1977) полностью совпадают с результатами, полученными Wilde et. al., (1967) и Wagner G. et.al., (1974) которые с целью иммунизации также использовали инактивированные вакцины (Th. parva) в смеси с адъювантом. В их опытах все привитые телята оказались восприимчивыми к тейлериозу при питании на них инвазированных клещей, несмотря на то, что в сыворотке крови многих животных антитела обнаруживались в очень высоких титрах (179−231−232).

Опыты по применению инактивированных вакцин против тейлериоза (возбудитель Th. annulata) проводили в 1966;1970 гг в лаборатории протозоологии и арахнологии ВИЭВ Л. П. Дьяконов, Н. И. Степанова, Э. М. Аскаров (1975). Изучали превентивные свойства инактивированных гранатных тел тейлерий и их комбинированное действие в сочетании с заключительной иммунизацией живыми (нативными) гранатными телами. Авторы пришли к выводу о принципиальной возможности иммунизации против тейлериоза путем одновременного или последовательного применения инактивированных.

15 нативных гранатных тел (макрошизонтов), полученных из органов больных тейлериозом животных (20).

W. Jarret et. al., (1966) для иммунизации скота применили суспензию из органов животных, зараженных Th. parva приготовленную в последней гиперпластической фазе болезни. Результаты опытов оказались неудовлетворительными, так как все привитие животные заболели, и часть из них пала (131).

Brocklesby D., et. al., (1965) с целью иммунизации против восточно-береговой лихорадки восприимчивым телятам внутривенно вводили кровь или суспензию из пораженных органов, взятых от больного животного. Большинство телят приобрели достаточно напряженный иммунитет. (94).

H. Pirie, et. al., (1970) использовали для иммунизации шизонты в дозированном количестве. Восприимчивый скот вакцинировали против тейлериоза путем внутривенного введения суспензии из лимфатических узлов больных животных, содержащей макрошизонты Th. parva в дозе 2×108, 2×109, 2×1010 на одно введение. После контрольного заражения выжило 80% животных. Из 22 контрольных животных пало 20. В дальнейшем авторы установили (1977), что убитые шизонты тейлерий Th. annulata непригодны для иммунизации скота против тейлериоза (182).

Д.А.Мирзабеков, А.К.Мовсун-заде и А. Н. Годдаев (1971) предложили способ ослабления вирулентности возбудителя тейлериоза, который заключается в том, что восприимчивым животным вводится смесь селезеночной суспензии (ослабляющий компонент) и инвазированной тейлериями крови (инвазионный материал). Указанный способ был проверен на 44 нетелях, завезенных из Прибалтийских республик. Из них одно животное переболело тейлериозом в тяжелой форме, а 27 перенесли инвазию бессимптомно, а остальные на ведения материала не реагировали (38).

Исследователи из Кении Cunningham et. al. (1970, 1974) использовали для вакцинации животных против тейлериоза инвазивные формы Th. parva выделенные из зараженных клещей и сохраняемые в жидком азоте (103−106).

С целью получения материала, пригодного для вакцинации крупного рогатого скота против тейлериоза, многие исследователи применили ионизирующее излучение, являющееся мощным фактором воздействия на биологические объекты. Г. Н. Шахматов, 1969,1972; В. Д. Баранников, 1970; Cunningham М., et. al., 1970 — И. В. Абрамов, В. Т. Заблоцкий, 1971;1972;1973 — W. Munyua et. al, 1973 -Р. Srivastava et. al., 1977;D. Singh et. al., 1979;S. Samantaray et al., 1980 -Srivastava P., Sharma N. 1977 и другие в своих исследованиях показали, что как спорозонты, так и гранатные тела Th. annulata и Th. parva, подвергнутые воздействию радиации в определенной дозе, способны вызывать у зараженных ими животных слабую реакцию и прочный иммунитет (1−4-8−9-78−79−103−168−198−193−199−200).

Gill В. et. al., (1976,1977) для иммунизации крупного рогатого скота против тейлериоза (возбудитель Th. annulata) использовали метод «заражения-лечения». Авторы для иммунизации телят применили стабиляты, приготовленные из тканей только одного или 10 клещей, с одновременным введением хлортетрациклина в дозе 16 мг/кг. Обработку антибиотиками одной группы животных продолжали 4 дня, другой — 8 дней. Все опытные телята оказались иммунными и не заболели при питании на них инвазированных клещей, хотя среди 5 контрольных животных 4 погибли от тейлериоза (118−119). В последующие годы Gill В. et. al,. (1977,1978) расширили исследования по отбору антибиотиков, ослабляющих клиническое проявление тейлериоза у животных, зараженных стабилятами из тканей инвазированных клещей. Так, помимо хлортетрациклина они испытали пролонгированную форму окситетрациклина, который вводили в дозе 20 мг/кг подкожно однократно или двукратно с 3-дневным интервалом. Все животные, привитые по методу В Gill., а с соавторами, оказались иммунными и не заболели тейлериозом при.

17 контрольном заражении, хотя среди 4 непривитых телят 3 пало от тейлериоза (паразитемия у них достигала 47,5%). Е. Pipano (1981) также испытали метод «заражения-лечения» для иммунизации крупного рогатого скота против тейлериоза. Животным подкожно вводили стабилят инвазированного клеща и одновременно внутривенно — окситетрациклин гидрохлорид в дозе 10 или 20 мг/кг S. Jagdish et. al., (1979,1980) с той же целью использовали риверин, Dolau Т. Et al, (1980) пролонгированную форму тетрациклина в дозе 20 мг/кг. Аналогичную работу провели Radley D. et. al., (1975) — Mchardy N., Haigh A., Dolan Т., (1976) (111−121−122−129−130−160−185−186).

Полевые испытания эффективности вакцинации зебу против тейлериоза тремя изолятами Th. parva провели в Уганде I. Robson et. al (1977) (190).

Brown С. et. al., (1977) изучали возможность иммунизации против тейлериоза (возбудитель Th. parva) путем введения стабилятов тейлерий из слюнных желез инвазированных клещей и N-пирролидинометил-тетрациклина в дозе 5 мг/кг. На основании проведенных экспериментов авторы пришли к выводу, что тейлерии наиболее чувствительны к действию тетрациклиновых препаратов в первые 5 дней развития в организме животных, поэтому предлагаемый метод может быть эффективен для проведения иммунизации крупного рогатого скота против тейлериоза. Подобные исследования проводились так же в Танзании В. Schrender et. al,. (1977) и G. Uilenberg et. al., (1978) в Кении Radley D" et. al., (1975)(97−194−185−229).

Важным фактором в дальнейшем изучении возбудителей тейлериоза крупного рогатого скота явилась установленная I.Tsur., возможность культивирования гранатных тел Th. annulata вне организма теплокровного хозяина.

Можно проследить три этапа в истории изучения культивирования тейлерий in vitro. Первый этап относится к середине 40-х годов, когда ряд исследователей наблюдали непродолжительный рост гранатных тел в плазменных культурах эксплантатов различных органов больных тейлериозом.

18 животных. Так, в первых опытах, Tsur I (1946) небольшие кусочки печени или селезенки, полученные от больных тейлериозом животных культивировал на дне культуральных сосудов, используя для этого бычью плазму и экстракт куриного эмбриона. Питательная среда состояла из солевого раствора Тироде с добавлением глютамина, пиридоксина, рибофлавина и телячьей сыворотки. Эти культуры оставались жизнеспособными только в течение 1−3 недель. С использованием более сложной питательной среды № 199 D. Brocklesby.et. al., (1958) удалось продлить рост таких культур до двух месяцев (93−222).

Второй этап начался с усовершенствования метода культивирования клеток (новые методы диспергирования клеток, сложные синтетические питательные среды и т. д.). Большой прогресс был достигнут при использовании различных ферментов, в частности трипсина, для дезагрегации тканей. Это позволило получать монослойные первично-трипсинизированные культуры инвазированных лимфоидных клеток теленка, инвазированных Th. annul ata. лимфоидных клеток (Tsur I., Adler S., 1962; L. Hulliger et. al., 1964, 1965; Заблоцкий В. Т., 1966 — HocshmandRed et al., 1971; Gaur S. et. al., 1978 — Gill В., Bhattacharyulu Y., Kaur D., Singh A., 1977) (9−25−117−134−144−148−149).

Преимущество этих культур заключалось в том, что их рост можно было поддерживать в течении нескольких месяцев и, следовательно, появилась возможность получать большую массу паразитов. Уже на этом этапе были предприняты попытки субкультивирования клеток, инвазированных тейлериями. Для этих целей Hulliger et. al., (1964) предложили метод совместного культивирования In vitro пораженных гранатными телами лимфоидных клеток больного тейлериозом скота с клетками перевиваемой линии ВНК-21, которая, не будучи зараженной протозоа, использовалась в целях обеспечения благоприятных условий для размножения инвазированных клеток крупного рогатого скота. Данная клеточная ассоциация, а вместе с ней и тейлерии, обладали способностью культивироваться на протяжении нескольких месяцев (148).

Третий этап относится к концу шестидесятых, началу семидесятых годов, когда ряду исследователей в Советском Союзе, Иране и Кении удалось получить перевиваемые линии клеток лимфатического узла и селезенки, инвазированных гранатными телами Th ammlata которые размножаются в суспензии (Hooshmand-Rad Р. et. al., 1971, Van den Ende et. .al., 1971; Hooshmand-Rad P. et. al., 1975; Мутузкина З. П. 1977). Успешно размножаются в суспензионных культурах и гранатные тела Th parva (Moulton J. et. al., 1971). Почти 100% лимфобластов в этих культурах были инвазированы гранатными телами тейлерий (41−144−146−167−230).

Использование культур тканей при изучении тейлерий открыло широкие возможности в выяснении таких сторон жизнедеятельности паразита, которые до этого были слабо изучены или совсем неизвестны. Так, например, с помощью этого метода был прослежен In vitro цикл развития тейлерий, который происходит в организме теплокровного хозяина, изучена характеристика иммуногенных и вирулентных свойств паразита в процессе роста вне организма хозяинаполучен антигенный материал, пригодный для серологических реакций и иммунизациивыяснена роль клеточных факторов в иммунитете при тейлериозевыявлена возможность отбора лекарственных препаратов тейлериоцидного действияосуществлена гибридизация инвазированных тейлериями клеток крупного рогатого скота с клетками других видов животныхрасширен поиск лабораторной модели для изучения тейлериозаа также проведены исследования некоторых сторон обмена веществ у паразита и изучено много других вопросов.

Для изучения цикла развития тейлерий Brown С., Stagg D. et. al., (1973), Brown C" Radley D. et. al., (1979) предложили оригинальный способ получения культур лимфоидных клеток крупного рогатого скота, инвазированных гранатными телами Th parva и Th annulata. Вначале готовят культуры лимфоидных клеток от здорового крупного рогатого скота, использовав для этого лейкоциты периферической крови и клетки лимфоидных органов,.

20 которые выравнивали на «кормящем» слое фибробластов в питательной среде, обычно используемой для культивирования лимфоидных клеток человека. Затем получали суспензию спорозоитов тейлерий из слюнных желез, предварительно питавшихся на кролике инвазированных клещей. После центрифугирования фильтрат вносили в лимфоидную культуру. Обычно первые внутриклеточные паразиты обнаруживались через 24 часа, а гранатные тела — на второй день после заражения. В культуре наблюдалась бластгрансформация лимфоцитов, которая, по мнению авторов, была связана с присутствием паразитов. Удвоение популяции паразитов происходило через 18−21 час. Пораженность клеток в культурах достигала 90−100%. Количество ядер в гранатных телах оставалось постоянным на протяжении 300 пассажей, в течение 3 лет непрерывного культивирования. В результате опытов стало доступным изучение In vitro той части жизненного цикла тейлерий, которая протекает в организме крупного рогатого скота с момента внедрения спорозоитов и до появления шизонтов (96−97).

Действие лимфы теленка и неинвазированных эритроцитов крупного рогатого скота на культивирование лимфоидных клеток, пораженных гранатными телами Th parva, наблюдали D. Danskin et. al., (1976). Добавление лимфы во всех случаях стимулировало деление клеток и шизонтов паразита. Наиболее благоприятное действие оказало внесение 10% лимфы и 1020% фетальной сыворотки. В культуре наряду с макрошизонтами обнаруживали микрошизонты, а также микромерозоиты. Авторы наблюдали внедрение паразитов в эритроциты крупного рогатого скота при их внесении в культуру. Пораженность эритроцитов тейлериями составляла 0,1%. Таким образом, была доказана возможность развития внутриэритроцитарной стадии тейлерий In vitro, что позволило, с учётом работ Брауна, изучить весь жизненный цикл паразита вне организма теплокровного хозяина (108). Как известно, выращивание гранатных тел тейлерий в культурах клеток позволяет получать большие количества однородного инвазионного материала.

Воспользовавшись этой возможностью, многие исследователи, как у нас в стране, так и за рубежом, стали использовать выращенных In vitro паразитов для приготовления антигенов с целью использования их во всевозможных серологических реакциях. Так, Hooshmand-Rad Р., Hashemi-Fesharki (1971) в Иране впервые успешно использовали гранатные тела Th annulata, выращенные в культуре лимфоидных клеток для крупного рогатого скота, в качестве антигена в реакции связывания комплемента (РСК) (143). Значительные исследования по применению гранатных тел Th parva и Th lawrencei, выращенных в культурах клеток, в качестве антигена в непрямой реакции иммунофлюоресценции для диагностики тейлериоза провела группа исследователей под руководством Burridge М., Kimber С., (1972) — Burridge М., et. al., (1973;1974). Положительный результат был также получен при использовании культуральных тейлерий в качестве антигена в реакции длительного связывания комплемента (Мутузкина З.П., 1977). Была подтверждена высокая чувствительность и специфичность РДСК при диагностике паразитоносительства у переболевших тейлериозом и анаплазмозом животных. (Сахимов, 1986)(41−65−98−99−100).

Pearson Т et. al., (1979), установили, что длительно культивируемые инвазированные тейлериями клетки имеют на своей поверхности специфические антигены, которые распознавались лимфоцитами ответчиками, выделенными из крупного рогатого скота иммунных к тейлериозу сингенных животных, в результате чего образовались цитотоксические лимфоциты, способные убивать пораженные тейлериями клетки. Авторы считают, что введение восприимчивым животным инвазированных тейлериями клеток вызывает сенсибилизацию иммунной системы организма. Вторичное воздействие антигена вызывало цитотоксический эффект и гибель инвазированных клеток. Таким образом, по мнению Пирсона с соавторами, в основе невосприимчивости к тейлериозу лежит клеточный иммунитет (172).

Культуры лимфоидных клеток крупного рогатого скота, инвазированные гранатными телами тейлерий, широко используются для отбора различных химиотерапевтических соединений, эффективных при лечении тейлериоза (Мс Hardy et. al., 1976)(161).

С начала первых работ по выращиванию тейлерий in vitro и до настоящего времени, в основном, используются культуры клеток различных органов и тканей крупного рогатого скота. В 1974 г. ряду исследователей удалось получить несколько перевиваемых линий клеток, инвазированных гранатными телами Tn lawrencei возбудителя тейлериоза буйволов Stagg D et. al., 1974; Burridge M., Young A., Stagg D. et. al, 1974. Для получения первичной культуры использовали лейкоциты крови инвазированных тейлериями буйволят (Syncerus caffer), которые выращивали на монослое клеток эмбриона коровы. Без этих клеток лейкоциты буйволов не развивались (101−201).

Malmquist W. Е et. al., (1974) при получении клеточных линий, инвазированных Th parva в качестве питающего слоя использовали перевиваемую культуру клеток селезенки эмбриона коровы (BE Р) (159).

Позднее Young et. al.,(1978) установили, что процент получения культур из материала от прирученных южноафриканских буйволов был значительно выше, чем от диких. Исследователи объясняют этот факт тем, что экстенсивность поражения буйволов, содержавшихся в неволе, значительно выше (235).

В 1975 г. Hooshmand-Rad P., Hawa N применив метод, который обычно используется для культивирования гранатных тел Th annulata, получили две перевиваемые линии клеток овцы, инвазированные шизонтами Th annulata. Клетки этих линий размножались в суспензии (суспензионное культивирование). Одна линия клеток прошла 80 пассажей, другая — 60. Антиген, приготовленный из этих шизонтов, был с успехом применен (Hawa N. Et. а1.,(1976) в непрямой реакции флуоресцирующих антител для диагностики тейлериоза овец. Позднее эти авторы (Hawa N., Latif В., et al, 1981) испытали.

23 на овцах превентивные свойства шизонтов, выращенных в культурах клеток. Для иммунизации использовали паразитов, прошедших 3, 30 и 63 пассажа in vitro (139−140−145−147).

Stagg D et. al., (1976) впервые получил от больной антилопы (Taurotragus oryx) 5 клеточных линий, зараженных тейлериями рода Cytarotragus. В четырех линиях шизонты тейлерий развивались в лимфобластоподобных клетках, которые росли в виде суспензионной культуры. Пятая линия росла как монослой, и шизонты содержались в макрофагоподобных моноцитарных клетках, к 5 пассажу до 96% которых содержали шизонты (202).

З.П.Мутузкина (1977) изучала в сравнительном аспекте кариотип инвазированных лимфоидных клеток в процессе 6−7 и 16−20-месячного их культивирования. Инвазированные гранатными телами лимфоидные клетки из лимфатических узлов и селезенки через 6−7 месяцев культивирования, имели диплоидный набор хромосом. Процент диплоидных клеток в этих культурах составлял 74,7−81,8. Остальные клетки имели в преобладающем большинстве кариотип с гиподиплоидным набором хромосом. При изучении пораженных тейлериями лимфоидных культур на более поздних этапах культивирования (16−20 месяцев) цитогенетичеекая характеристика была иной. В этих культурах отмечали резкое возрастание метафаз с увеличенным числом хромосом (гипердиплоидные и полиплоидные) и уменьшение до 33,9−57,4% диплоидных клеток. Значительно увеличивалось количество полиплоидных метафаз, которые были представлены наборами из 120, 180, 240 хромосом. Цитоморфологические изменения некоторых из этих культур характеризовались также наличием большого количества гигантских и многоядерных ретикулярных клеток, напоминающих иногда клетки Березовского-Штернберга (40).

Основным достижением в работе по выращиванию разных видов тейлерий в культурах клеток животных явилось установление того факта, что паразит в процессе культивирования вне организма хозяина снижает свою вирулентность.

Pipano E., Tsur I., 1966). Это послужило отправным моментом к проведению в некоторых странах мира исследований по изысканию различных способов аттенуации возбудителя и изучению возможности использования таких паразитов для целей специфической профилактики тейлериоза (174).

Pipano Е., Tsur I. (1966) установили, что после двух лет непрерывного культивирования in vitro паразит (Th armulata) теряет свою патогенностъ и при введении восприимчивому скоту не вызывает появления какой-нибудь клинической или паразитарной реакции. Однако такой скот обнаруживает полную защиту против контрольного заражения вирулентным гомологичным штаммом тейлерий, поддерживаемым путем пассажей на крупном рогатом скоте без участия клещей-переносчиков (173).

В лаборатории протозоологии Всероссийского института экспериментальной ветеринарии были проведены исследования по выяснению возможности использования тейлерий, выращенных в культуре ткани, для целей специфической профилактики тейлериоза (В.Т.Заблоцкий, 1966; 1967; 1968;1969; В. Абрамов, В. Т. Заблоцкий, 1973; В. Т. Заблоцкий, Н.А., Казаков 1975. Проведенные исследования показали, что гранатные тела тейлерий при культивировании in vitro снижают свою вирулентность, сохраняя иммуногенные свойства, что позволяло использовать их для иммунизации. Свойства не изменялись при хранении в жидком азоте (-196°С) (4−23−25−29).

Н.И. Степановой и др (1977) на основе выращивания шизонтов в культурах клеток разработана методика получения живой культуральной противотейлериозной вакцины. Ее испытание в хозяйствах Узбекистана показали, что она слабореактогенна и формирует у всех привитых животных стойкую невосприимчивость к тейлериозу. Л. П. Дьяконов и др (1975) изучали в экспериментах клинические и иммунологические показатели у крупного рогатого скота, вакцинированного различными дозами нативных шизонтов с целью выбора оптимальной дозы (20−68).

По сообщению R. Hashemi-Fesharki (1978) в Иране за последние 7 лет в различных климатических зонах страны вакцинировано 10 тыс. голов крупного рогатого скота в возрасте 2−12 месяцев. Использовали живую ослабленную вакцину из местных штаммов, выращенных в культуре лимфоидных клеток. Побочных явлений не было отмечено, за исключением незначительного повышения температуры тела у отдельных животных. По сообщению автора вакцинированный скот был устойчив к спонтанному заражению, в то время как невакцинированный тяжело переболевал и были случаи его падежа (135).

Pipano Е., et., aL, (1969,1973) при изучении реактогенных свойств противотейлериозной вакцины в лабораторных опытах использовали 59 спленэктомированных телят 2−5-месячного возраста, а в производственных условиях — 3650 коров разного возраста. Каких-либо симптомов болезни и осложнений у привитого скота при наблюдении в течение 27−35 месяцев не отмечено. Антитела к тейлерийному антигену после вакцинации выявляли в разведении сыворотки от 1:128 до 1:2048 (174- 176).

В Израиле, по сообщению Pipano Е., (1974), за 5-летний период привито вакциной из культуральных тейлерий приблизительно 4,5 тыс. голов крупного рогатого скота всех возрастных групп, причём в крови привитых животных эритроцитарные формы тейлерий не обнаруживали. Появление таких форм у иммунизированных животных рассматривалось как показатель нападения на них инвазированных клещей (естественное заражение). Вакцина, по мнению автора, создавала удовлетворительный иммунитет у молодняка и взрослого мясного скота, а также у животных в ранней стадии стельности (177).

Brown С., Malmquist W, et. al., (1971) с целью выяснения возможности заболевания животных тейлериозом после введения им выращенных вне организма хозяина тейлерий использовали три инвазированные Th. parva (штамм Мугуга) клеточные линии, полученные Malmquist W et. al., (1970). При этом было установлено, что телят можно заразить, если вводить им подкожно или внутривенно 10 млн. или более лимфобластов, содержащих.

26 макрошизонты. Путем предварительной титрации инвазионного материала было установлено, что большинство телят, которым вводили от 105 до 109 инвазированных лимфобластов, слабо или совсем не реагировали на заражение, хотя титр антител повышался у всех животных. Все телята, привитые тейлериями в указанной дозе, оказались устойчивыми к контрольному заражению с помощью клещей (95- 157).

Существует мнение (Brown, 1971 — цитата, по R. Purneil 1980), что большие различия в проявлении поствакциональной реакции связаны с групповой принадлежностью лимфоцитов животного реципиента и исходных лимфоцитов донора. Учитывая, что материал, обладающий остаточной вирулентностью, не пригоден для применения в качестве вакцины, были предприняты исследования по ослаблению паразита путем продолжительного культивирования его in vitro. Длительное выращивание шизонтов Th parva (штамм Мугуга) в культуре клеток привело к постепенному снижению их вирулентности, однако это сопровождалось потерей иммуногенности. Освобождение шизонтов из лимфобластов различными физическими и химическими методами не привело к усилению их иммуногенности (183).

Young А., Brown et. al., (1973) установил, что крупный рогатый окот, вакцинированный шизонтами Th. lawrencei, выращенными в культурах клеток, легко переболевал тейлериозом при контрольном заражении клещевым материалом, содержащим Th. lawrencei. Авторы считают, что культуральные шизонты могут быть использованы в целях иммунизации скота против тейлериоза (234).

В последние годы развернулись исследования по созданию культуральной вакцины против тейлериоза крупного рогатого скота в Индии, где это заболевание наносит значительный экономический ущерб животноводству. Так, Gill В., et., al.,. (1976), для профилактики тейлериоза, использовали шизонты вирулентного штамма тейлерий — Гиссар, выращенные в культуре лимфоидных клеток крупного рогатого скота. G Subramanial et. al., (1978).

27 провели испытание иммуногенных свойств шизонтов Th. annulata, выращенных в культурах лимфоидных меток крупного рогатого скота. В опыте использовали помесных бычков в возрасте 5−6 мес., которым ввели подкожно по 4−6 млн. инвазированных клеток четвертого субпассажа. Спустя I, 2 и 6 месяцев после иммунизации шесть привитых телят заразили тейлериозом (по два животных на каждый срок). У всех животных наблюдали легкую лихорадку, которая продолжалась в течение 3−4 дней и увеличение лимфатических узлов. Паразитемия достигла 2−3%. Шесть контрольных телят заболели тейлериозом. Пораженность эритроцитов крови тейлериями у них достигла 20−25%. Два контрольных животных из шести погибли от тейлериоза (119−206).

В своих исследованиях Shukla P.C., Sharma R.D., (1988) провели биопсию увеличенных лимфатических узлов телят, экспериментально инвазированных Th. annulata. Затем фракцию лимфоцитов биопсированного материала и крови инвазированных животных культивировали in vitro. Ростовой средой служила среда RPMI-1640. На первых пассажах в нее добавляли 20% сыворотки крови плодов коров, а затем заменили ее сывороткой крови безмолозивных телят, которая поддерживала репродукцию лимфобластоидных клеток на высоком уровне. Провели 139 пассажей культур — их перевивали вначале с интервалом в 5−19 дней, а затем, после обнаружения трансформации лимфоцитов, — 3 раза в неделю. В этих культурах митотический индекс составлял 7%, а инвазированностъ достигала 99,98%. Концентрация клеток в суспензионных культурах на 3 день культивирования варьировала от 1,2×106 до 2×106 кл / мл при исходном уровне 2×105 кл / мл. Хронически инвазированные тейлериями культуры клеток использовали для иммунизации крупного рогатого скота (208).

По данным Pipano Е., (1989) культивирование штаммов Th. annulata в первичных культурах клеток различных органов телят (почки, печени, селезенки и др.), а также в лейкоцитарных культурах привело к аттенуации возбудителя и полной потере им вирулентности. У привитого аттенуированной вакциной КРС развивался выраженный гуморальный иммунный ответ,.

28 мерозоиты в эритроцитах не образовывались. Это исключало возможность передачи возбудителя с клещами. В опытах на коровах, спленэктомированных телятах и хомяках показана безвредность вакцины. Испытание препарата в полевых условиях свидетельствовало о его эффективности как для местных, так и для экзотических пород КРС. За последние 20 лет около 3000 гол. КРС было завезено в Израиль из Западной Европы. Однократная их вакцинация аттенуированной вакциной создавала пожизненный протективный иммунитет у всех привитых животных. В опытах G. Subramanian (1989) использовали 55 помесных (Bos taurus, Bos indicus) серонегативных к Th. annulata новорожденных телят. Животным подкожно вводили по 0,5−2,0×10б инвазированных макрошизонтами тейлерий лимфобластов, выращенных в условиях культивирования in vitro. Инвазированные лимфобласты инокулировали животным в области левого преддопаточного лимфатического узла. Поствакцинальных осложнений не наблюдали, за исключением 3 случаев падежа от тейлериоза привитых (181−207).

Большинство зарубежных исследователей, работающих над созданием и испытанием культуральной противотейлериозных вакцин, отмечают, что их препараты не обеспечивают полной защиты иммунизируемых животных от заболевания тейлериозом, передаваемым инвазированными клещами (Cunninghem М., et. al., (1974) — Pipano Е. et. al., 1976) Учеными Всесоюзного научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им Коваленко создана культуральная высокоэффективная вакцина против тейлериоза крупного рогатого скота. Профилактическая эффективность вакцины при производственном ее применении на поголовье 2230 тыс животных — 98−100% (105−178).

Технология культивирования in vitro лимфоидных клеток инвазированных тейлериями (Th annulata) состоит из следующих этапов: получения культур клеток инвазированных тейлериями, трипсинизации ткани, выращивания культур клеток, пересева суспензионных культур, контроля за интенсивностью.

29 размножения гранатных тел в культурах клеток, сбора выращенных клеток. Этот метод использован для получения небольших объемов вакцины.

По данным В. Т. Заблоцкого (1983) поствакцинальный иммунитет при тейлериозе сохраняется 3,5 года (срок наблюдения). В. Т. Заблоцкий, И. К. Расулов (1983) сообщают о возможности иммунизации противотейлериозной вакциной нетелей (21−24).

Противотейлериозная вакцина ВИЭВ слабореактогенна и надежно предохраняет привитых животных от заболевания при естественном заражении через клещей переносчиков в период пастбищного содержания скота (Р.Х. Нораев). По данным Р. Х. Нораева (1985), противотейлериозная вакцина ВИЭВ как годичного так и пятилетнего срока хранения в жидком азоте не теряет свою иммуногенность и надежно предохраняет привитых животных от тейлериоза (45).

В.Т. Заблоцким (1985)обобщены материалы по технологии получения противотейлериозной вакцины ВИЭВ, методика проверки ее безвредности, реактогенности и иммуногенности, а так же применения в животноводстве (22).

Р.Х. Нораев (1986) установил, что противотейлериозная вакцина является слабореактогенной для телят 4−5 месячного возраста и надежно предохраняет привитых животных от заболевания тейлериозом (46).

Н.И. Степанова и др. (1987) в течение ряда лет в неблагополучных по тейлериозу крупного рогатого скота хозяйствах Средней Азии и Казахстана иммунизировали противотейлериозной вакциной более 25 тыс. голов молодняка, причем среди вакцинированных животных заболевания тейлериозом не было зарегистрировано (70).

Установлено, что иммунитет у однократно вакцинированных телят сохраняется пожизненно.

По сведениям Р. Х. Нораева (1987), И. Х. Расулова, Н.И. (1992), Степановой и др (1987), Б. Диванова (1987), Д. Т. Досжанова и др. (1987) применение противотейлериозной вакцины в условиях Таджикистана,.

Узбекистана, Туркмении и Южного Казахстана дало положительные результаты (18−19−48−60−69−70).

Культуральная противотейлериозная вакцина (серия № 4, изготовленная 10.11.1982 г. Щелковским биокомбинатом) у привитых телят 2−3 месячного возраста вызывала слабую реакцию и надежно предохраняла привитых животных от тейлериоза (Р.Х. Нораев 1987)(53).

В работах Р. Х. Нораева, (1991), Э. Т. Бадалова, Р. Х. Нораева, (1988), Э. Т. Бадалова и др., (1989) сообщается об эффективности специфической профилактики тейлериоза крупного рогатого скота противотейлериозной вакциной ВИЭВ в отдельных районах Таджикистана и вариантах совмещения вакцинации с обработкой скота акарицидами (6−7-52).

По данным R. Hashemi-Fesharki, (1986) в последние 14 лет в Иране иммунизировано причем без осложнений более 100 тыс. голов чистопородного и помесного скота с помощью аттенуированной вакцины из трех местных изолятов Theileria annulata, выращенных в культуре лимфоидных клеток. Два штамма (S-11 и S-15) составляют основу вакцины, они поддерживаются пассированием в суспензионной культуре тканей. Аттенуация достигнута в результате пассирования инвазированных шизонтами лимфоидных клеток в культуре ткани. Третий штамм (S-3) является стандартным проверочным штаммом и поддерживается заражением телят, этот пггамм очень вирулентный (отход до 80% восприимчивых чистопородных телят). Инвазированные шизонтами лимфоидные клетки размножают в стандартной суспензионной культуре с 10% сывороток лошади или овцы, клетки собирают, концентрируют (6 мл, 12 мл концентрата помещают в ампулы объемом 20 мл с 9,5% глицерина для криопрезервации и замораживают при — 70 °C до применения). Каждая партия вакцины содержит 4000−7000 доз, по 6 доз в ампуле (137).

По сообщению (Sharma R.D.- Shukla P.C.- Nichani A.K. 1987) тропический тейлериоз крупного рогатого скота представляет для Индии серьезную проблему, поэтому актуальна разработка эффективной.

31 культурально-клеточной вакцины. С этой целью макрошизонты Th. annulata размножали in vitro в среде RPMI 1640, обогащенной фетальной сывороткой, сывороткой новорожденных телят, козлят и ягнят, не получавших молозива. Перечисленные сывороточные препараты обладали по отношению к тейлериями приблизительно одинаковыми ростовыми свойствами, но стоимость сыворотки крови безмолозивных животных была значительно ниже, чем фетальной сыворотки. В среде, обогащенной сывороткой крови безмолозивных телят, макрошизонты T. annulata прошли 135 пассажей. На 10, 50 и 100 пассажах исследовали патогенность и иммуногенность возбудителя для телят. С этой целью культивированные in vitro макрошизонты.

4 6 8 соответствующего пассажа вводили телятам в дозах 10, 10 и 10. У телят, f Q зараженных 10 и 10 макропшзонтов 100 пассажа, наблюдали слабую клиническую реакцию, отсутствие паразитологической реакции и выявили в реакции иммунофлуоресценции высокие титры специфических антител. Перевозку вакцины осуществляют в сухом льду или жидком азоте (192).

В опытах Ouhelth H.- Innes Е.А.- Brown C.G.D (1989), использовали серонегативных к Th. annulata помесных телят (голштинская и фризская) в возрасте 8−14 мес. Животных опытных групп (31 голов) привили различными.

2 4 6 8 дозами (10% 10″, 10°, 10й) лимфобластоидных клеток 4 линий, инвазированных марокканским изолятом Th. annulata. Контрольное заражение спорозоитами тейлерий высокопатогенного штамма «Стеб 35» показало, что вакцинация создавала у привитых животных иммунитет к инвазии, напряженность которого зависела от дозы и линии лимфобластоидной вакцины. В течение 2-летнего периода наблюдений у привитых животных сохранялся высокий уровень продуктивности. Все контрольные (непривитые) телята пали в течение 2 дней после экспериментального заражения спорозоитами тейлерий (171).

По данным З. В. Кущенко и др. (1989) у вакцинированных животных иммунитет сохраняется в течение 4 лет (срок исследований) Ouhelth H.- Innes Е.А.- Brown C.G.D. S.P. 1989, Morzazia, V. Nene (1990), Young A.S., Leitch B.L.,.

Dolan T.T. (1990) — H.T. Koch et. al., (1990) — F.R. Hall (1990) — P.C. Shukla, R.D. Sharma, (1991) сообщают об иммунизации скота вакцинами против Th. annulata, Th parva в отдельных странах Африки и Азии (35−152- 170−163−164−208−236).

По данным Ш. Ж. Кутлымуратова, (1991) в условиях Каракалпакии наиболее эффективной является профилактика тейлериоза культуральной вакциной ВИЭВ и последующие прививки против других болезней не оказывают отрицательного влияния на напряженность противотейлериозного иммунитета (по результатам клинических наблюдений) (34).

Н.М Ширинов и др., (1991) сообщают о положительных результатах четырехлетнего производственного испытания противотейлериозной вакцины ВИЭВ в Азербайджане (80).

Р.Х.Нораевым, X. Георгиу, (1991) — М. Сахимовым и др., (1991) — Р. Х. Нораевым (1995) изучена реактогенность и иммуногенность противотейлериозной вакцины для стельных коров. Выявлено, что в Таджикистане, где тейлериоз КРС широко распространен, особенно в зонах отгонного скотоводства, применение вакцины экономически и экологически оправдано (52−52−66).

И.Х. Расуловым, (1992) приводятся данные многолетних исследований по применению противотейлериозной вакцины ВИЭВ в условиях Узбекистана (60).

Как считает Б. Ш. Ибрагимов, (1992) противотейлериозную вакцину можно применять для специфической профилактики тейлериоза у молодняка КРС с 2 -месячного возраста (30).

Р.Х. Нораевым, Х. Георгиу, (1992) установлена возможность передачи антител от привитых противотейлериозной вакциной потомству через молозиво (53).

Климатические условия жаркого времени года (июнь-июль) не оказывают отрицательного влияния на течение поствакциональной реакции и формирование иммунитета достаточной напряженности с высоким титром.

33 антител у привитых противотейлериозной вакциной телят (Р.Х. Нораев 1993X50).

По сведениям Р. Х. Нораева, (1995) и Ибрагимова Б. Ш., (1992) у иммунизированных противотейлериозной вакциной клинически здоровых коров поствакцинальная реакция не оказывает отрицательного влияния на молочную продуктивность (30−51).

История изучения тейлериоза насчитывает около 100 лет. Метод выделения и культивирования тейлерий был разработан более 30 лет назад и только сравнительно недавно была получена вакцина против этой болезни.

Существующая промышленная технология изготовления вакцины против тейлериоза включает роллерное культивирование инвазированных тейлериями лимфоидных клеток теленка. Данный метод культивирования является технологически устаревшим, требует больших затрат труда, большого количества стеклянной посуды, не дает возможности поддерживать оптимальные значения параметров культивирования. Был использован метод глубинного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных Th. annulata. Метод глубинного культивирования клеток для приготовления вакцины является перспективным, снижает себестоимость вакцины, повышает гарантию надежности и экологическую безопасность.

Управляемое культивирование клеток животных, как метод биотехнологии, находит все более широкое применение при производстве культуральных вакцин.

Среди первых работ по культивированию клеток животных необходими отметить работы Карреля (Carrel, 1912, 1913, 1914,). Далее исследования продолжили Свим (Swim,), Паркер (Parker) (1957), Хейфлик (Hayflik), Морхед (Moorhead) (1961), Смит (Smith), Хейфлик (Hayflik) (1974), Мец (Mets) (1980), Оно (Ohno) (1980), Гринберг, Витковский (1982).

Основы теории глубинного культивирования даны в работах :

Моно (Monod) (1942,1950), Пирт (Pirt)(1957), Работнова (1957), Иерусалимский (1964), Аиба (Aiba) (1965), Уэб (1965), Диксон, Уэб (1966), Басканьян (1974), Позмогова (1978).

Различают два основных способа культивирования — выращивание на поверхности твердой фазы (монослой) и глубинное культивирование.

Существует несколько методов глубинного культивирования статическое и динамическое. При статическом культивировании массоперадача между клетками, питательной средой и газом осуществляется за счет диффузии.

Система статического культивирования в основном применяется для всех типов клеток при небольших масштабах производства.

Динамическое глубинное культивирование в свою очередь подразделяется на три основных метода: при первом методе поверхность для культивирования клеток (матрица) движется, а питательная среда (жидкость) находится в статическом состояниипри втором методе поверхность (матрица) находится в статическом состоянии, жидкость движется и, наконец, при третьем способе в движении находятся все фазы культивирования (клеткажидкость — газ).

Всю аппаратуру для поверхностного и глубинного культивирования клеток животных можно подразделить на следующие группы: -культуральнотканевые контейнеры- -качалки, роллеры, (спиннер), инкубаторы- -биореакторы.

Принципиальным шагом в развитии методов выращивания клеток стал переход к суспензионному культивированию (Cherry W.R., et., al., 1960; Rightsel W.A. et. al. 1960; Moore G.E. et., al., 1968; Fontanges, R., 1971; Girard H.C., et. al.,. 1973; Zwerner. R. K., et. al., 1975; Acton R. T., et. al., 1977 (86−107−168−114−123−188−237).

Системы суспензионного культивирования подразделяются на замкнутые и открытые (Перт С. Дж. 1978). Замкнутыми являются системы.

35 периодического (циклического) культивирования и периодического культивирования с подпиткой (отьемно-доливное)(57).

К открытым системам культивирования относятся диализная (с фильтрацией), перфузионная (гетерогенная) перфузионная с рециркуляцией (квазигомогенная), непрерывная гомогенная (хемостат) и непрерывная гетерогенная (турбидостат).

К биореакторам для культивирования предъявляются ряд требований: обеспечение стерильности процесса культивированияобеспечение стерильности посева и взятия пробгомогенность культуральной среды и культурыоптимальные массобменные характеристики по потреблению питательных веществ и отвод продуктов метаболизмапростота наладки и обслуживаниястандартность блоков оборудования для культивированиявозможность осуществления масштабного переходавозможность автоматического контроля регулирования основных параметров культивирования (Рубан Е.А., 1999). В зависимости от системы культивирования биореакторы подразделяются на биореакторы с механическим перемешиваниемэрлифтные биореакторы, биореакторы с биофильтром и протоком средыбарбатажные реакторы (колонны) — биореакторы для культивирования в микрокапсулахс пористыми ячейкамис полыми волокнамимембранные биореакторы (Биотехнология клеток животных, под редакцией Р. Д. Спира и Дж. Грифитса 1989, Биотехнология клеток в культуре/ Под редакцией АС Трошина, 1984. Откинсон Б. Биологические реакторы, 1979 (16−17−56−64).

Большинство работ в области суспензионного культивирования клеток животных было выполнено на биореакторах с механическим перемешиванием и аэрацией. Позднее эти биореакторы были модифицированны с учетом особенностей клеток животных (Telling, R. С. et. al., 1971). Опубликованные данные (Tolbert W.R. et. al., 1981) показывают, что выбор подходящей системы перемешивания должен быть в каждом конкретном случае всесторонне.

36 обоснован. Были испытаны реакторы с виброперемепшванием и с мешалкой импеллером типа морского винта (Pollard D.M. et. al., 1981). Так же были испытаны реакторы эрлифтного типа для культивирования клеток в суспензии (Katinger H.W.D. et. al., 1979). Другой системой является биореактор для культивирования с вращающимся фильтром (Feder J. et. al ., 1983;, Hemmelfard P., Thayer P. S. 1969; Tolbert W. R., Peder J. m, Kimes R.C. 1981). Этот биореакгор относится к реакторам перфузионного типа, где клетки удерживаются в реакторе и только среда удаляется из суспензии посредством фильтрации через вращающийся патрон. Важным шагом в усовершенствовании методов выращивания клеток и вирусов является использование мембранных биореакгоров (NilssonK., Scheirer. W., et.a.l., 1983) (113−149−151−169−183−212−215).

Иммобилизированные культуральные системы с использованием мембранных биореакторов обеспечивают более высокий выход клеток.

Наиболее часто и широко для культивирования клеток используются реакторы промышленного типа с механическим перемешиванием. Данные реакторы не удовлетворяют всем требованиям и не могут считаться оптимальными, но нашли широкое применение при культивировании клеток животных. Физические функции стандартных реакторов изучены достаточно подробно и описаны во многих публикациях (Cherry W.R., et. al., 1960; Rightsel W.A. et. al., 1960 — Moore G.E. et. al, 1968; Fontanges, R., 1971; Girard H.C., et. al., 1973; Zwerner. R. К et. al., 1975; Acton R. T., e. t al., 1977).Биореакторы данного типа были выбраны автором для проведения работы (86−107−114−123−168−188−237).

Современные требования к промышленному производству вакцин для профилактики болезней животных в том числе и против тейлериоза включают санитарно-экологические аспекты: защита готовой продукциизащита сырья и промежуточных, конечных продуктовзащита обслуживающего персоналазащита окружающей среды. Требования к чистоте биологического.

37 производства регулируются на основе общих правил GMP. (Richtlinien der IKS vom 13 Mai 1982 betreffend die Herstellung von Arzneimittein in verwendungsfahiger FormInterkantonale Kontrollstelle fur Heilmittel IKS, Berne, Switzerland.(l 87).

Как показал литературный обзор, метод глубинного периодического суспензионного культивирования клеток для приготовления вакцины против тейлериоза является перспективным, позволит снизить себестоимость вакцины, повысит гарантию надежности и экологическую безопасность, его разработка представляется весьма актуальной.

4. ВЫВОДЫ.

1. Научно обоснован метод глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЬ. ашшЫа.

2. Определены оптимальные значения и величины допустимых отклонений технологических параметров культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЬ. ашшЫа.

3. Разработан алгоритм управления технологическим процессом культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЬ. ашш1Ма.

4. Разработана современная промышленная технология производства вакцины против тейлериоза с использованием метода глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка, инвазированных ТЬ. аппиЫа. Технология защищена патентом Российской Федерации.

5. Сравнительный анализ существующей и разработанной технологии промышленного производства вакцины против тейлериоза показал, что предложенная технология обеспечивает значительное снижение трудоемкости и себестоимости производства вакцины, повышает гарантию надежности технологического процесса и экологическую безопасность.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

На основе проведенных исследований и практики разработана современная оптимизированная промышленная технология производства вакцины против тейлериоза с использованием метода глубинного периодического суспензионного культивирования лимфоидных клеток теленка инвазированных ТЬ. ашшЫа. Разработаны изменения и дополнения к действующей инструкции по производству вакцины против тейлериоза утверждены директором ВНИТИБП 25 ноября 1991 года. Получен патент на изобретение №: 1 838 915 «Способ изготовления вакцины против тейлериоза» от 13октября 1992 г.