Изучение механизмов реализации информации, заложенной в геноме, в процессе онтогенеза является одной из фундаментальных проблем биологии. Важной задачей молекулярной биологии развития является поиск и исследование молекулярно-генетических механизмов и сигнальных каскадов, необходимых для нормального развития и регионализации головного отдела зародышей позвоночных животных. Особый интерес в этой области представляют исследования механизмов развития: головного мозга,-в частности, его переднего отдела, отвечающего за высшие формы нервной деятельности.
Известно, что важную роль в регионализации и клеточной дифференцировке в ходе развития головного мозга, играют гомеодоменные транскрипционные факторы и их геномные мишени [Ermakova et al., 1999; Boyl et al., 2001; Kiecker and Lumsden, 2005]. Так, одним из ключевых звеньев молекулярных механизмов, обеспечивающих развитие переднего мозга, у позвоночных является-гомеодоменный белок Anf. Ген Anf специфически экспрессируется на ранних, стадиях развития зародышей позвоночных в зачатке переднего мозгаиз которого в ходе развития формируются большие полушария мозга (т.н. конечныймозг) — а также промежуточный отдел головного мозга, включая глаза [Zaraisky, 1992, Kazanskaya et al., 1997]. В результате поиска геномных мишеней Anf «на: модели: эмбрионов Xenopus laevis был идентифицирован ген, кодирующий ранее неизвестную Ras-подобную малую ГТФазу. Было установлено, что в раннем эмбриогенезе найденный ген экспрессируется вдоль границы, отделяющей-зачаток: переднего мозга, расположенный! в передней части спинной стороны, зародыша, от брюшной его части [Novoselov et al., 2003]. На основании подобной, пограничной, локализации экспрессии данного гена, а также принадлежности, кодируемой им малой ГТФазы к суперсемейству Ras ГТФаз,. он получил название — Ras-dva (последнее сокращенно — dorsal-ventral-anterior: спина-брюхо-перед).
Малые ГТФазы представляют собой суперсемейство регуляторных ГТФ-гидролаз, в котором выделяют 8 семейств: Ras, Rab, RJL, Ran, RGK, Rho/Rac/Cdc42, Arf/Sar и Gie. Белки этих семейств принимают участие в таких разнородных клеточных процессах, как трансдукция сигналов: и регуляция экспрессии генов (Ras, Rho), реорганизация цитоскелета (Rho, RGK), организация микротрубочек и их функционирование (Ran, Gie), везикулярный (Rab, Arf/Sarl) и ядерно-цитоплазматический транспорт (Ran) [Hall, 2000; Finlin et al., 2000; Takai et al, 2001; Nepomuceno-Silva et al., 2004; Okai et al., 2004].
Учитывая специфичную экспрессию Ras-dva вдоль границы зачатка переднего мозга, логично предположить, что малая ГТФаза Ras-dva может играть важную роль в сигнальных механизмах, регулирующих развитие мозга и прилежащих головных структур. В связи с этим, поиск гомологов Ras-dva и дальнейшее изучение их биологических функций представляется перспективным подходом для понимания механизмов раннего эмбрионального развития переднего мозга.
Кроме того, сравнительно низкая степень гомологии Ras-dva с представителями восьми других известных семейств малых ГТФаз делает изучение ГТФазы Ras-dva и ее гомологов важным как с классификационно-структурной точки зрения, так и с точки зрения выявления возможных новых типов внутриклеточных сигнальных каскадов.
1.6 Заключение.
Обзор литературных данных о разных семействах малых ГТФаз показывает, что белки каждого семейства, наряду с общими характеристиками, .имеют особенности в первичных аминокислотных последовательностях, в частности, в строении G1-G5 консенсусов, сайтов пост-трансляционных липидных модификаций, эффектор-связывающих доменов и специфических консервативных доменов. В результате этого, степень гомологии между белками разных семейств составляет менее 35%, а между белками> одного семейства — более 50%. При этом белки разных семейств выполняют различные важные функции в клетке: трансдукция сигналов и регуляция экспрессии генов (Ras, Rho), реорганизация цитоскелета (Rho, RGK), организация микротрубочек и их функционирование (Ran, Gie), регуляция везикулярного (Rab, Arf/Sarl) и ядерно-цитоплазматического транспорта (Ran). А, следовательно, малые ГТФазы играют важную роль в обеспечении нормальной жизнедеятельности как клетки, так и многоклеточного^ организма. Многие малые ГТФазы вовлечены в процессы формирования и развития многоклеточных организмов на самых ранних этапах эмбриогенеза. В частности, была доказана важная роль малых ГТФаз в таких процессах, как созревание ооцитов, гаструляция, нейральная индукция, регионализация зародышевых тканей и их последующая дифференцировка. В тоже время, роль многих малых ГТФаз в развитии остается не изученной. Кроме того, остается актуальной задача поиска. и изучения функций новых членов этого суперсемейства белков — важных регуляторов эмбриогенеза.
2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
2.1 Систематическое положение новой малой ГТФазы Ras-dva в суперсемействе малых ГТФаз.
2.1.1 Поиск гомологов белка Ras-dva шпорцевой лягушки у разных организмов и анализ их аминокислотных последовательностей.
Известно, что более 200 малых ГТФаз, описанных на данный момент, формируют 8 семейств (Ras, Rab, Rho/Rac/Cdc42,Ran, RGK, RJL, Gie и Arf/Sar) внутри общего суперсемейства малых ГТФаз. Так как степень гомологии нового белка шпорцевой лягушки, малой ГТФазы Ras-dva, с белками известных семейств не превышает 35%, то поиск гомологов малой ГТФазы Ras-dva у разных живых организмов и их сравнение с другими малыми ГТФазами представляет интерес, как с классификационной точки зрения, так и с целью выявления их структурных особенностей.
С помощью пакета программ BLAST был проведен поиск гомологов, нового белка XIRas-dva (GenBank Accession Number: AF513854) у прокариот и эукариот (грибов, растений, позвоночных и беспозвоночных животных) в разных базах данных: NCBI Genbank (http://ncbi.nlm.nih.gov), Saccharomyces http://www.yeastgenome.org/, The Arabidopsis Information Resource (TAIR) (http://www.arabidopsis.org/), Xenbase (http://www.xenbase.org), JGI (http://genome.jgi-psf.org), University of California Santa Cruz (UCSC) Genome Browser Database (http://genome.ucsc.edu), Strongylocentrotus purpuratus sea urchin (морской ёж) genome project (http://sugp.caltech.edu), степень гомологии которых составляла 50% и более. В итоге было обнаружено и зарегистрировано 15 гомологов XIRas-dva у различных позвоночных огранизмов: 1 гомолог у бесчелюстной рыбы миноги (Petromyzon marinus, EU379655), 9 гомологов у костистых рыб: 2 — у D anio rerio (DQ278181, AY729884), 3 — у Takifugu rubipes.
DQ278182, DQ278183, DQ278184) и по одному у Gasterosteus aculeatus (DQ278185), Oncorhynchus mykkis (ABB84863) и Ozyrias latipes (DQ278187), Tetraodon nigroviridis (CAG02679), 3 — у лягушек X. tropicalis (AY729885, DQ278180) и X. laevis (ABM63371), 1 гомолог у ящерицы Anolis carolinensis (EU380237) и 1 гомолог у курицы Galliis gallas (AY729886). Кроме того, среди программно-предсказанных кДНК был обнаружен гомолог Ras-dva у опоссума (класс. Млекопитающие, отр. Сумчатые) Monodelphis domestica (XP001377674). У прокариот и растений гомологов малой ГТФазы Ras-dva не было выявлено. Кроме того, недавно при анализе генома морского ежа Stongylocentrotus purpuratus Beane W.S. и коллеги нашли ген, кодирующий малую ГТФазу наиболее гомологичную белкам Ras-dva [Beane et al., 2006]. Однако, степень гомологии упоминаемого в статье белка с перечисленными выше составляет менее 45%, что может говорить о его принадлежности к какой-то отдельной группе малых ГТФаз, близкой к белкам Ras-dva. В связи с этим, вопрос о представленности малых ГТФаз Ras-dva у беспозвоночных животных остается открытым.
Проведенный анализ позволяет сделать следующие предварительные выводы.
— Вероятно, малые ГТФазы Ras-dva впервые появились в эволюции только у позвоночных организмов. В связи с этим важно отметить, что ген, кодирующий гомеодоменный белкок Anf, чьей мишенью является ген Ras-dva у шпорцевой лягушки X. laevis, также впервые появляется лишь у позвоночных животных, где он выполняет функцию регулятора развития переднего мозга. Можно предположить, что именно появление новых генов, очевидно возникших путем дупликаций и последующей быстрой дивергенции каких-то генов-предшественников, создало предпосылки для возникновения у позвоночных таких новых анатомических структур как передний мозг, нервный гребень и единая область зачатков органов чувств (пан-плакодная зона).
— Обнаружение гена Ras-dva у опоссума, сумчатого млекопитающего, позволяет предположить, что и у высших млекопитающих могут присутствовать гомологи Ras-dva. Возможно, найти ген малой ГТФазы Ras-dva, кодирующая рамка которого составляет всего лишь около 650 пар оснований (п.о.) и не содержит интронов, у высших млекопитающих организмов пока не удается из-за недостаточной полноты геномных баз данных.
С целью выявления функциональных участков, характерных для группы обнаруженных малых ГТФаз К. аэ-с1уа, нами было проведено множественное выравнивание их аминокислотных последовательностей (Рис.9).
На множественном выравнивании видно, что белки Яаэ-ёуа имеют консервативные участки в районах консенсусов С1-С5, входящих в состав каталитического в-домена ГТФаз (Рис. 9, С1-С5 выделены красным). У малых ГТФаз 11аз-сЬ/а они имеют следующие консенсусные последовательности (Табл.3). Таблица 3. Консенсусные поледовательности С1-С5 участков белков Лаз-буа.
G1 G2 (switchl) G3(switch2) G4 G5.
GAAGVGKT HRRTVEE YXDTSGS VGNKXD FXEXSAK.
Кроме того, у всех Ras-dva белков было выявлено наличие С-концевого сайта пренилированияСХАХ, где Са.о. цистеина (Cys), -SH группа которого подвергается пренилированию, А — алифатический а.о., а X — любой а.о. (Рис. 9, выделен желтым). Известно, что такие сайты пренилирования могут обусловливать связывание белков с мембранными структурами клетки [Pechlivanis and Kuhlmann, 2006].
Рис. 9 Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей белков Яаз-йа (в программе СШБТАЬ (1.83)) в! 02 (switchl).
ТгИаз-С^аЗ МЭЬЕ — УКЕКТНУЯЬУП^еаАбУбкфЬ! 0ЕРЬ0РКРЕАКрШКТУЕЕ|МНЗКЕ УР1С — - СУК 57.
GaRas-dva МЗЬЕ-УКЕКТ0УНЬУРЬСААСУСКТАЬ^РЬ0ОТГЕРКНККТУЕЕШЗКЕУВ1О—СУК 57.
Оп&ав^уаЗ МЗЬУ-УКЕКТЕУНЬУРЬСААСУСКТАЫЗИГЬ0ВТГЕРКНГ®.ТУЕЕШЗКЕРШС—ИАК 57 МЗЬЕ-УКЕКТЕтаЬУГМСААСУСКТАЬ1КНЕЕ0РЗРЕРЮтКТУЕЕШЗКЕУЕУА—СУК 57.
ТгЕав-^а1 МЗРК-УКЕКТЕтаЬУРЬС2^АОТСКТАЫОКРЬКСТРЕРКНКаТУЕЕ1лНМСЕУУУа—СУК 57.
TnRas-dva МЗРК-УКЕКХЕУЕЬУРЬСААСУСКТАЫОНГЬКОТРЕРЮЮаТУЕЕЬНЯКЕУУУС—СУК 57.
НЫ1ав-ауа НЗМЕ-УКЕЯТЕУНЬУРЕСААСУСКТА110НРЬКВТРЕРКШЖТУЕЕШНКЕУЕУС—СМК 57.
01лаа-с^а М31А-УКЕКТВУЕЬУРЬСАССУСКТАЫНКРЬ0ВТГОРКНККТУЕЕ1НШСЕУЕУС—ОУК 57.
АсИаз-^а МЗЬА-УКЕКЗОУКЬУРЬОААСУСКТАЫОНРЬОВТРЕРКНКНТУЕЕЬНЗКЕУОУЗ—САТ 57.
G9Ras-dva МЗЬУ-СКЕКЗНУНЬУРЕСААСУаКТАЫЯИРЬЬОТРЕРКЮШ.ТУЕЕШЗКЕУЕУЗ- -йАТ 57.
Х^ав-^Уа2 МБЕБ-ТКЕКК01РЬУРЬСААСУОКТЭЬ 11тГЕ0ОТтРК1ПШ. ТУЕЕЬНЗТЕУЕАТС-йТО 58.
Хйиав-ауаг МЗЬЗ-ТКЕКНОШЬУРЬСААСУСКТЗЬХЗНРЬЬПТРВРКНШШ/ЕЕШЗТЕУЕАТС-СТО 58.
ПгИав^а1 МЗЬЬ-У0ЕНКТУНРУРЬСААСУСКТАЫТНЕЬаОНГПЗКУТаТУЕЕи1АЬЕУПТЕС—ЛН 57.
TrRas-dva2 МЗРР-ЛКТН-ТтаЬУРЬСААСУСКЗАЫННРЬИВЗРЕНКУТКТУБЕШУЬЕУАУТСЗССК 58.
Х^аз^Уа ИЭ—-У335ВТУРЬУРРСААСУСКТАЬ10НЕ12ГОЗРЕЕРУ1тТУЕЕМНСЕМРЕРС—ЕЕ0 55.
ХЬНаз-йУа МЗЬЗ-УЗРЗПТУКЬУРРСЛАСУСКТАЫ0РР1ЛВНРППКУККГУЕЕМУСЬНРЕРС—АЕ0 57.
ГЙНаз^Уа МАЕОРАКРКЗСУКЬУРРСААСУСКТЛЫ0РР1АПТРЕА0НКНТУЕЕЬУСЬЕУЕЬП- -ТОО 58.
TrRas Саиав Отдав Е^ав ТгКав Тгтаз НЬиаз 01Иаз АсИав Сдйаз Х1иав ХСИаБ РгКав ТгИав Х1наэ XtRas ШЯав.
ТгИаз GaRas ОтНав РгНав ТгИаз ТпИаз Н1Шаз 01Еав АоНав йдНав XlRas XtRas ИгНаа TrRas XlRas XtRas МйЛав.
— dvaЗуа dvaЗ уа1.
Зуа уа.
— йуа.
— йуа йуа уа2.
— йуа2 уа2 -dva.
— dva dvaЗ.
— йуа.
— ёуаЗ.
— dvalуа ^уаёуа уа2.
— dva2 уа1.
— dva2 уа.
— ауа1.
— dva.
1ТУЕ|и.РТЗСЗ|У5РРАМ1гКЬЗ ИЭМЗОЛРАЬУУАУЦОРЕЗЬЕУУКЗЬМЖIЬЕ1КЕБКРТР 117 1ТУЕ11Л) ТЗСЗУЗГРАЖКЪ510НЗРАРАЬУУАУБПРЕЗЬЕАУКТЬНШ1ЬЕ1КЕВКМТР 117 VTIHXMDTSGSYSFPAMRKLCIQNSDЛFALVYAINDPDSLEAVKSLRDEILAVKEDKFTP 117 УТ1Ы1МПТЗСЗУЗРРА1^1ЖЬ310КСОАРАЕУУЗУОЕРЕЗЬЕУУ13Г!Ъ1"гЕ1ЪЕУКЕОКРТР 117 УТ151№ТЗСЗУЗРРЛМЕКЬ510 113РЛРЛЬУУАУЕРР03ЬЕЛУКЗЕНЕЕ1ЕЕУКЕПКРТР 117 VT1SIMDTSGSУSFPAMRKLSIQNSDAFALVYAVDDPQSЬEЛVKSLREEILEVKEDKFTP 117 УТ1ШМОТЗСЗУЗРРАМНКЬ310НЗВАРАЬУУАТООРЕЗЕУАУК31ЛУ) Е11,ЕУКЕПК:РТР 117 VTINIIDTSGSYSFPAMRKLSI^TGDAFALVYSVDDPDSLETVKRLRDEI 1ЕЬКЕВКНАР 117 IKУEILDTSGSYSFPAMRKЪSIQNSDAFALVYAVDDAESFECVKSLHEEILELKEDKFPP 117 УТЬЕХШТЗСЗУЗРРАтКЬЗХОЫЗОАРАЬУУЛУВПАЕЗРЕЗХКЗЬЕЕЕХЬЕУКЕПКРРР 117 VRIEILDTSGSYEFPAMRKIlNMKSGDAFALVYTHDDPDSFEMVKHLREEILEAKGDKSPP 118 VRVEI^ШTSGSYEFPAMRKLNMKSGDЛFALVYTMDDPDSFEMVИ^LREEILEЛKGDKSPP 118 УН1Е1ЬРТ363УРРРАМНАЬС1НТСПАРАЬУУЛАВЕРВЗЬЕЕУ0КЬНЕЕ1ЬЕЬКСЕЗРТС 117 УКЬЕ1ЫЭТЗСЗУЗЕРАМРЕЬС1Ш15РЛРЛЬУУАУРВРСЗЬАЕУ0НЬНГ) Е11|0ЬРССКСАР 118 LRIQILDTSGSYSFPAMRKLSI^QGDAFALVFSLSEPDSFQEVERLRSEI ЮУКСРАЕУР 115 ЬК1011?>ТЗС8УЗРРАМККЕ3100СВАРАЬУРЗЬЗЕРПЗР0ЕУЕК1ЛЗЕ11С>УКСПАЕУР 117 таЬЕ ХМОТБСБ УЭ РРАМККЬСI КНСОАРЛЬУУЗЬОЕРЕЗРОЕУГЖЕРЛЬаЬЕТКСЕЛРЗР 118.
• ******.
04 й5.
—1УУ|УС:ЖТР[КЕО-ЕР0—УЗЗЕРУЬ5ТУЕЕРУгеЫЗ[У1ЕАБАК|Е11АМУУЕУРКЕЬЬ00У 172.
— IVWGNKTDREK-ERR- -УЗтеРУЬЗТУЕМЕНтЗТП/ЕАЗАКООТНУУЕУГКЕЬЬООА 172.
—1УУУС1ЖТОННС-ЕНТ—УЗЗЕОУЬЗТУЕизНШЗГЬЕТЗАКЕ1ЛШУЬЕУГКЕЬЬ00А 172.
— - ХУУУСШгаЖЫЕиг—УЗАРРУЬАКУЕХРЯЖСГМЕАЗАКЕ[)ЕМтаЕУЕКЕЫ00А 172 —цлшзтоижоз-^о- -ЬЗЗЕБУЪЗТУЕЬЕШНЗРМЕЗЗАК01Ш1УУЕЗРНЕЬЬЗОА 172 —1УУ1СНК10КОЗ-ЕЯО—ЕЕЗКВУЬЗТУЕЬЕ'ЛгаЗЕМЕ$ЗАКР111НУУЕЗЕКЕЬЬЗОА 172 —1УУ1СИКЮНдС-ВН0—УРЗга)УЬЗТУЕЬР'ЛШЗРЫ:ЗЗАКРИЮТЬЕАЕКЕЬЬЬ0А 172 —IWIGNKIDRHN-ERL—VSSRDVLAMVELDWDHIEVESSAKD1Ш1VLEAFMELL^QT 172.
— -1VWGNKAEVGG-LRQ- -УЪРЕРАЬЗЬУЕЬР'лИЗНЕЬЕАЗАКЕ^ЕИУУЕУЕНЕЬЬООА 172.
— - 1УУУСМКАЕЗСС-ЕЯ0- -УРАЕБА1,31|УЕ1ЛЭШЗНГУЕТЗАКИ1Е11УЬЕУЕНЕ1,ЬС0А 172.
— - 1УУУашаш1/зо-Р1 к—узнееаьзтуеьето-гнн1ХЕтзак011Ъ11Утеуетеуенеу 173.
—1УУУАИККЛ1/дС-1чМК- -УРНЕЕАЬЗТУЕЬЕНЫНЯЫ^ЕТЗАКЕПЪНУТЕУЕТЕУЬКЕУ 173.
— - 1ТУ1ЕША0ЬСЗ-НЗК—дАТАЕАМРАУЕЕОКСАСГУЕТБАКТСРНУТАУГКРЬЬООМ 172 —МУУУСЗКАРЬЗЕ-ЕЕСКУЬРААВУМАТУЕООНРАЕЕУЕАЗАКТССМАУОУЕКАЬЬОНУ 175 —1УУУС№МОЗЕРСУЕАС0МУВЕЕАААТАЕЬЕШЗССУУЕТЗАКУРУКУ110 у.е.0ЕЫККУ 173.
— -1УУУОНОМОЬРРаЬЕАСООУРЬНАААТАЕЬЕИВССТУЕТЗАКУОУКТООУЕН0Ъ1ККУ 175 РР1УУУ&ЗКЗБЬАР—-5СЗЕРН-АУ1ААУЕЬЕКСС1УЬЕАЗАКЯСЕ11УЬЗЬГ0ЕЬЬ0ЬУ 174.
ТгЕаа GaRas Опдаав DrRas TrRas ТпНав НЬИав 01Нав АсНав СдНаэ Х1нав XtRas DrRaв ТгНав ХШав ХЬНав Гй^ав.
•йуаЗуа •йуаз ауа2 dvaуа ^уа •йуа ¦ёуа.
— дуа2 с1уа2уа ¦с!уа1 ¦с!уа сайт прекщшрования.
НЬРЗНЬЗРАЬНННКЕТРРЮт^Р.— - РМИКТИЭ^УЕЗ!.208.
ИЬРЗКЬЗРА1^ии1НЕТРРКПЫШ1Р————-РМПК11НЗС1ЕЗ————208.
1Л.РЗЮ^ЗРА1Лиш*ЕТРР01ХЗНЮ1Р. .РМИКВНЗСЫЗЬСЕСАСаУ 216.
NLPSRLSPALRRRRETFPKDLSLRP.-РМНКТНЗСЗУЗ—-.208.
ИЪРЗИ.ЗРА1ЛЗи"Ш- -ТУЕСЗООР.РЬНКЫНБСЗУЗ————206.
1ТЬРЗИ1ЛРАЬСКЯКЕ- -РАЕЗБННР————-БЬИКТИБСЗУЗ————206.
ИЬРЗИЬиРАЬСННКЕТРРКЕЗМЮП1. -РМЫКТЫЗСПЗ— -.208.
Ш, Р301ЛРАЬСКККЕТЬРЕКСЗКНР————-РММКТИЗСЫЗ————208.
1ILPSRLSPALRRRRETLPKEPPLRP————-РМИКАИБСТУС————208.
НЬРИгЬЗРАХ^НРЕТРРЗЕНМЛР————-РМНКТИгСЗУС————208.
NLPSRLSPALRRRRETIPNGVKYKP————-РМ1ЖТНБС31С.
NLPSRLSPALRRRRETIPKGGSFKP————-РМИКТИБСЗК!
KLPSRVSPALRRRTQTMSRELTEKRE———КРРМККННЗСХЬЗ.
KSTERLSPAVWRRRGRQCTTSVTKR————РРЬККИЗЗСХЕЗ.
N3 PAWLSPALERRR—-АЭАОРЕ———ЗИНКАОИЕКРОЗСТЕЗ.
НЭ РАНЬЗРАЬЕНЕК- —АБАОРЕ———А1т300ЯНКР03СТ1,3.
НЬРЗКЬЗРАЗЖККЕОТГРбСРРОЕАУбТУБТККАСТШаШЗСАУЗ.
209 20Э 211 212 209 211 219.
2.1.2 Филогенетическое дерево суперсемейства малых ГТФаз с новыми белками, Ras-dva.
С целью проверки нашего предположения об обособленности группы ГТФаз Ras-dva и определения их систематического положения в суперсемействе малых ГТФаз было построено филогенетическое древо этого суперсемейства.
Известно, что малые ГТФазы имеющие степень гомологии между собой более 50% относят к одному семейству, но при степени их гомологии менее 40% -к разным семействам [Macaluso et al., 2002]. Кроме того, для отнесения малой ГТФазы к тому или иному семейству достаточно информации заложенной* в аминокислотной последовательности ее каталитического G-домена- [Jiang, Ramachandran, 2006]. Исходя из этого, для построения филогенетического древа в базе данных National Center for Biotechnology Information (NGBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov) были найдены аминокислотные последовательноти G-доменов малых ГТФаз представителей 8-ми уже описанных семейств (Ras, Rho, Rab, Ran, Arf, RJL, RGK и Gie). Далее при помощи программы Clustal W1.83 было проведено множественное выравнивание последовательностей G-доменов. малых I.
ГТФаз уже известных семейств и найденных нами белков Ras-dva. На основании, данных этого множественного выравнивания в программе Mega 2.0 (http://megasofitware.net) по алгоритму «ближайшего соседа» (neighbour-joining algorithm with p-distance model) было построено неукорененное филогенетическое древо суперсемейства малых ГТФаз, которое показало, что белки Ras-dva формируют отдельный кластер того же ранга, что и ранее известные семейства. (Рис.10). При этом степень гомологии между белками, входящими bi Ras-dva кластер и белками других кластеров составляет 10−40%. Степень же гомологии внутри Ras-dva кластера — более 52%. Таким образом, можно сделать вывод, что белки Ras-dva составляют отдельное, девятое семейство малых ГТФаз. Заметим, что белки нового семейства Ras-dva наиболее гомологичны белкам семейства Ras, которые в свою очередь являются важными элементами сигнальных каскадов в клетке (подробнее см. литобзор).
Рис. 10 Филогенетическое дерево суперсемейства малых ГТФаз, построенное при помощи программы MEGA 2.1, используя метод «ближайшего соседа» и модель попарных расстояний (neighbor-joining algorithm и p-distance model). Масштабный отрезок в левом нижнем углу соответствует значению параметра р равным 0.1 (p=nd/L, где ndколичество аминокислот различающихся у 2-х сравниваемых последовательностей и L — общее количество сравниваемых аминокислот). Hs — Homo sapiens (человек), Mm — Mus musculus (мышь), Md — Monoderphis domestica (опоссум), Gg — Gallus gallus (курица), Ас — Anolis carolinensis (ящерица), XI — X. laevis (лягушка), Tr — Takifugu rubripes (рыба), Eh — Entamoeba.
При сравнении представленнности каждого семейства малых ГТФаз в разных царствах/классах живых существ (бактерий, грибов, растений, позвоночных и беспозвоночных животных), мы обнаружили, что семейство Яаз^уа- -единственное, присутствующее только в 1 классе — у позвоночных организмов. Все другие семейства были представлены в 2-х и более классах/царствах живых организмов.
2.1.3 Сравнительный анализ консенсусных аминокислотных последовательностей G-домена белков Ras-dva и других малых ГТФаз.
Как известно, все ГТФазы, имеют каталитический G-домен, который включает в себя пять консенсусных аминокислотных последовательностей GlG5, отвечающих за взаимодействие белка с ГТФ и ГДФ, а также за его ГТФазную активность. Последние три свойства чрезвычайно важны для осуществления цикла активации/инактивации ГТФазы, который регулируется специфическими белками-помощниками GEP (guanine nucleotide exchange protein) и GAP (GTPase activating protein) соответственно (подробнее см. литобзор).
Ras.
Суперсемейство малых ГТФаз.
Rho/Rac/Cdc42.
Ras-dva.
RJL.
Rab.
Arf/Sar.
Gie histolytica (амеба).
В составе консенсусных последовательностей G1-G5 выделяют как высококонсервативные аминокислотные остатки (а.о.), присутствующие у малых ГТФаз всех известных семейств, так и а.о., консервативные только внутри отдельных семейств малых ГТФаз. Для того чтобы выяснить, есть ли у малых ГТФаз Ras-dva какие-либо особенности в строении консенсусных участков G1-G5 по сравнению с таковыми малых ГТФаз уже описанных семейств, мы провели сравнительный анализ последовательностей GlG5, характерных для белков Ras-dva и малых ГТФаз семейств Ras, Rab, Ran, Rho, RJL, RGK, Arf и Gie (Табл.4).
В результате, было выяснено, что у малых ГТФаз Ras-dva в консенсусных последовательностях G1-G5 присутствуют все высоко-консервативные а.о., но кроме того, имеется несколько особенностей в строении наиболее важных для ГДФ/ГТФ обмена и гидролиза последнего консенсусов, G2 (он же switch 1) и G3 (он же switch2). В частности, было показано, что в консенсусе G2 малые ГТФазы Ras-dva, в отличие от всех остальных малых ГТФаз, перед высоко-консервативным остатком треонина имеют 1−2 положительно заряженных аминокислотных остатка аргинина (выделены синим в Таблице 4) или лизина.