Помощь в написании студенческих работ
Антистрессовый сервис

Влияние базального уровня экспрессии генов эндонуклеаз Serratia marcescens и Anabaena sp. на свойства рекомбинантных штаммов Escherichia coli

Диссертация: Влияние базального уровня экспрессии генов эндонуклеаз Serratia marcescens и Anabaena sp. на свойства рекомбинантных штаммов Escherichia coli
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Как уже было сказано выше, введение клонированного гена в составе вектора в бактериальную клетку оказывает негативное влияние на ее физиологические и метаболические процессы и генетический материал, не нужный для ее размножения, в ходе деления клетки неминуемо утрачивается. По этой причине было необходимо провести исследования стабильности наследования плазмид pHisNucSma и pHisNucA в ряду… Читать ещё >

Влияние базального уровня экспрессии генов эндонуклеаз Serratia marcescens и Anabaena sp. на свойства рекомбинантных штаммов Escherichia coli (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Содержание

  • УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И
  • СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
  • 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12 1.1.Нуклеазы
    • 1. 1. 1. Нуклеаза Serratia marees cens
    • 1. 1. 2. Нуклеаза Anabaena sp. 19, 1.2. Ферменты, участвующие в структурной организации ДНК топоизомеразы)
    • 1. 2. 1. ДНК-гираза
    • 1. 3. Клонирование генов
  • 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
    • 2. 1. Материалы исследования
    • 2. 2. Получение компетентных клеток
    • 2. 3. Трансформация компетентных клеток методом теплового шока
    • 2. 4. Выделение плазмидной ДНК
    • 2. 5. Электрофорез в агарозном геле
    • 2. 6. Индукция экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и Nue А
    • 2. 7. Жб'-электрофорез в полиакриламидном геле
    • 2. 8. Определение активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA с помощью индикаторного агара
    • 2. 9. Определение динамики роста рекомбинантных штаммов
  • E. coli LK111A и E. coli TGE
    • 2. 10. Конструирование референс-плазмиды рЕТсосоАтрСт Al
    • 2. 11. Реакция рестрикции
    • 2. 12. ДНК-лигазная реакция
    • 2. 13. Амплификация фрагментов гена bla с помощью ПНР
    • 2. 14. Определение минимальной ингибирующей концентрации антибиотика '
    • 2. 15. Определение количества ß--лактамазы
    • 2. 16. Определение частоты спонтанной элиминации плазмид
    • 2. 17. Статистическая обработка результатов
  • 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
    • 3. 1. Получение рекомбинантных штаммов Е. coli LK111A и Е. coli TGE
    • 3. 2. Индукция экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз S. marcescens и Anabaena sp
    • 3. 3. Определение активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз S. marcescens и Anabaena sp. с помощью индикаторного агара
    • 3. 4. Влияние базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз Serratia marcescens и Anabaena sp. на выживаемость рекомбинантных штаммов
  • Е. coli LK11IX и Е. coli TGE
    • 3. 5. Определение уровня устойчивости к ампициллину для рекомбинантных штаммов Е. coli LK111A и Е. coli TGE
    • 3. 6. Получение референс-плазмидырЕТсосоАтрСт
      • 3. 6. 1. Конструирование референс-плазмиды рЕТсосоАтрСт на основе плазмиды рЕТсосоСт
      • 3. 6. 2. Определение дозы гена Ыа в рекомбинантном штамме
  • Е. coli DH5a рЕТсосоАтрСт
  • ЪП. Определение количества генов Ыа в рекомбинантных штаммах
  • E. coli LK111A и E. coli TGE
    • 3. 8. Определение стабильности наследования плазмид pHisNucSma и pHisNucA в рекомбинантных штаммах
  • Е. coli LK1 ИХ и Е. coli TGE
    • 3. 9. Определение устойчивости рекомбинантных штаммов E. coli LK11IX и Е. coli TGE900 к антибиотикам — ингибиторам репликации ДНК

Актуальность проблемы. В настоящее время методы генетической инженерии применяются для решения широкого круга задач в области микробиологии, биохимии, молекулярной биологии и биотехнологии [Глик и др., 2002]. Одной из таких задач является создание на основе технологии реком-бинантной ДНК штаммов, обладающих способностью синтезировать в большом количестве необходимый белок. Такой сверхсинтез может осуществляться как в результате повышения количества копий гена в клетке, так и в результате повышения интенсивности его транскрипции [Щелкунов, 2004].

Введение

клонированного гена в составе вектора в бактериальную клетку может оказывать как положительное, так и отрицательное влияние на ее физиологические процессы. С одной стороны, векторная ДНК сообщает клетке-хозяину новые свойства, дающие ей селективные преимущества. С другой стороны, сверхсинтез продукта чужеродного гена, а также сам продукт могут оказывать негативное влияние на скорость роста и деления клеток [Su et al., 1990]. Поэтому необходимо контролировать процесс транскрипции для того, чтобы клонированный ген экспрессировался только на определенной стадии жизненного цикла клетки-хозяина и в определенный промежуток времени [Herman-Antosiewicz et al., 2001].

Для регуляции транскрипции клонированных генов часто применяют сильные промоторы, такие, как триптофановый [Стручкова И.В. и др., 2010], лактозный [Kalodimos et al., 2002], промоторы бактериофагов X [Valdez-Gruz et al., 2010], T7 [Du et al., 2009] для грамотрицательных, промоторы SPAC [Chen X. et al., 2009] и degQ [Nishito et al., 2010] для грамположительных микроорганизмов. Контроль за работой таких промоторов осуществляется с помощью специфических белков-репрессоров [Palomares et al., 2004], которые в случае trpи /яс-оперонов действуют в операторном участке. Однако большинство используемых в настоящее время промоторов, транскрипция которых контролируется с помощью репрессора, допускают слабую экспрессию клонированного гена даже в присутствии репрессора в клетке, в результате чего происходит синтез репрессируемого белка в небольших количествах — так называемый базальный уровень экспрессии гена [Herman-Antosiewicz et al., 2001; Bahar et al., 2011].

В последние годы эндонуклеазы Serratia marcescens {NucSma) и Anabaena sp. (NucA) находят широкое применение в биохимии, молекулярной биологии, медицине и сельском хозяйстве [Аликин и др., 1998]. Эти ферменты принадлежат к одному семейству родственных эндонуклеаз, активные сайты которых имеют одинаковую высококонсервативную аминокислотную последовательность, так называемый DRGH-мотив [Pingoud et al., 1999; Ghosh et al., 2007]. Для некоторых представителей семейства родственных нуклеаз показано участие в процессах, включающих размножение прай-меров для репликации митохондриальной ДНК в случае бычьей нуклеазы EndoG [Ruiz-Carillo et al., 1993], репарации и рекомбинации ДНК в случае Nucl [Dake et al., 1988; Rangarajan et al., 2001]. Для других представителей этого семейства и внеклеточных эндонуклеаз NucSma и NucA показана трофическая функция.

К настоящему времени гены эндонуклеаз NucSma и NucA проклонирова-ны в клетках Escherichia coli [Ball et al., 1987; Гимадутдинов и др., 1993; Meiss et al., 1998], но до сих пор не имеется достаточно данных о влиянии этих эндонуклеаз на клетки-хозяев и о влиянии клеток-реципиентов на свойства плазмид, содержащих эти гены. Ранее было показано, что экзогенные ДНКаза 1 и эндонуклеаза NucSma в малых дозах усиливают пролиферативные процессы в микробной клетке, а именно синтез ДНК, рост и деление клеток [Куприянова-Ашина, 1991], но до настоящего времени мало что известно о влиянии эндонуклеаз NucSma и NucA на гетерологичные клетки, в которых они экспрессируются на базальном уровне.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы — определить влияние базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз Serratia marcescens (NucSma) и Anabaena sp. {NucA) на свойства рекомбинантных штаммов Escherichia coli.

В соответствие с данной целью были поставлены следующие задачи:

1. Определить наличие базального уровня экспрессии генов исходных и му-тантных вариантов эндонуклеаз Serratia marcescens и Anabaena sp. в ре-комбинантных штаммах Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900.

2. Сконструировать референс-плазмиду с известным числом копий для косвенного определения количества содержащихся в рекомбинантных штаммах Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 генов Ыа по количеству синтезируемой клетками ß—лактамазы.

3. Установить зависимость между количеством генов Ыа в плазмидах, количеством синтезируемой ß—лактамазы, уровнем устойчивости к ампициллину и активностью исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз Serratia marcescens и Anabaena sp. при базальном уровне экспрессии их генов в рекомбинантных штаммах Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900.

4. Изучить влияние базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA на выживаемость рекомбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900.

5. Установить влияние базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз Serratia marcescens и Anabaena sp. на стабильность наследования плазмид pHisNucSma и pHisNucA в рекомбинантных штаммах Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900.

6. Установить зависимость уровня устойчивости рекомбинантных штаммов Е. coli LK111X и Е. coli TGE900 к ингибиторам репликации ДНК от активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз Serratia marcescens и Anabaena sp. при базальном уровне экспрессии их генов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Увеличение активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов повышает устойчивость рекомбинантных штаммов Е. coli LK111X и Е. coli TGE900 к ампициллину.

2. С увеличением активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов увеличивается количество плазмид pHisNucSma и pHisNucA в клетках рекомбинантных штаммов Е. coli LK111X и Е. coli TGE900.

3. Экспрессия генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA на базальном уровне оказывает положительное влияние на выживаемость рекомбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900.

4. С увеличением активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов, в рекомбинантных штаммах Е. coli LK111X и Е. coli TGE900 плазмиды pHisNucSma и pHisNucA наследуются более стабильно.

5. Увеличение активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов повышает устойчивость рекомбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 к налидиксовой кислоте.

Научная новизна. Впервые показано, что величина базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA зависит как от клетки-хозяина, так и от плазмиды. Установлено, что ба-зальный уровень экспрессии генов исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA оказывает положительное воздействие на выживаемость бактерий. Получена референс-плазмида рЕТсосоАтрСт для косвенного определения количества генов Ыа по количеству синтезируемой бактериальной клеткой ß—лактамазы. Установлено, что в клетках рекомбинантных штаммов Е. coli LK111X и Е. coli TGE900 количество генов Ыа в плазмидах pHisNucSma и pHisNucA зависит от активности исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов. Впервые показана возможность участия эндонуклеаз NucSma и NucA в репликации плаз-мидной ДНК в рекомбинантных штаммах Е. coli.

Научно-теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в работе результаты вносят вклад в понимание способов регуляции экспрессии клонируемого гена в гетерологичной клетке и возможностей достижения сверхсинтеза его продукта. Полученные данные можно использовать для дальнейших исследований в области промышленной микробиологии для оптимизации синтеза эндонуклеаз NucSma и Nue Л рекомбинантными штаммами. Встраивание под сильный промотор гена клонируемого белка в одну плазмиду с геном исходного варианта эндонуклеазы NucSma в результате их совместной транскрипции в рекомбинантном штамме E. coli TGE900 даст возможность получать данный белок в промышленных масштабах.

Сконструированная в данной работе референс-плазмида может использо.

• 1 ваться для косвенного определения количества генов Ыа в клетках микроорганизмов, а, следовательно, и количества копий плазмид, содержащих эти гены. Результаты исследования и примененные в работе методические приемы можно использовать при проведении практических и лекционных занятий по микробиологии и генетике микроорганизмов для студентов-биологов.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007) — II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008) — First Inteuniversity Conference on Modern Biology «Building the Future in Biology „Bio-News“» (Kazan, 2008) — II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 2009) — V съезде вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009) — научно-практической конференции «Становление и достижения биохимической школы Казанского университета» (Казань, 2009) — 2-ой Московской международной конференции «Молекулярная филогенетика MolPhy-2» (Москва, 2010) — конференции «Наука в информационном пространстве» (Днепропетровск, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе 4 статьи, из которых 2 — в журналах, рекомендованных ВАК.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Нуклеазы.

Нуклеазы представляют собой обширную группу ферментов, расщепляющих фосфодиэфирные связи в молекулах нуклеиновых кислот и обладающих определенной специфичностью к химической природе оснований, углеводному компоненту и вторичной структуре субстрата. Нуклеиновые кислоты являются крайне устойчивыми к гидролизу биополимерами и при оптимальных для большинства клеток температурах (30°-40°С) гидролизуются крайне медленно, тогда как нуклеазы позволяют ускорить эту реакцию на величину порядка 1016 [Кнорре и др., 2000].

Нуклеазы принимают участие в различных процессах, происходящих в клетке, например, репликации, рекомбинации, репарации и деградации нитей ДНК. Различают несколько типов нуклеаз в зависимости от их специфичности: экзонуклеазы и эндонуклеазы, рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы, рестриктазы и так далее. Нуклеазы, гидролизующие нуклеотиды на концах молекулы ДНК называются экзонуклеазами, тогда как эндонуклеазы разрезают ДНК внутри цепи [Березов и др., 1998]. Нуклеазы, одинаково хорошо гидролизующие как ДНК, так и РНК-субстраты, называют сахаронеспеци-фичными [Rangarajan et al., 2001]. Основными биологическими функциями, которые выполняют нуклеазы в живой клетке, являются [Bickle et al., 1993]:

1. гидролиз нуклеиновых кислот (трофическая функция);

2. удаление чужеродных нуклеиновых кислот (защитная функция);

3. регуляция синтеза и распада нуклеиновых кислот в клетках.

Часто ферменты представляют собой димеры, состоящие из одинаковых субъединиц, каждая из которых содержит один активный сайт [Franke et al., 1999]. Так и сахаронеспецифичная эндонуклеаза S. marcescens (NucSma) имеет два каталитических центра, которые за один каталитический цикл разрезают две нити ДНК [Filimonova et al., 1981; Friedhoff et al., 1994bMiller et al., 1996; Chen С. et al., 2009], в то время как эндонуклеаза Anabaena sp. (NucA) является мономерным ферментом и единовременно может разрезать только одну нить ДНК [Meiss et al., 1998].

Эндонуклеазы NucSma и NucA относятся к одной группе родственных сахаронеспецифических нуклеаз, представители которой были обнаружены во многих прокариотических и эукариотических организмах, таких как Streptococcus pneumoniae, цианобактериях, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccha-romyces pombe, Syncephalostrum racemosum, Bos taurus, Trypanosoma brucei, Caenorhabditis elegans, Borrelia burgdorferi, Mus musculus и Homo sapiens [Franke et al., 1999; Ghosh et al., 2007; Chen C. et al., 2009]. Поскольку эндонуклеазы NucSma и NucA являются наиболее типичными представителями данного семейства, то именно они и стали объектами данного исследования по изучению влияния гетерологичных эндонуклеаз на свойства рекомби-нантных штаммов.

ВЫВОДЫ:

1. Рекомбинантные штаммы Е. coli LK111X и Е. coli TGE900 обладают способностью к экспрессии генов исходных и мутантных вариантов эндонук-леаз NucSma и NucA на базальном уровне.

2. Получена референс-плазмида рЕТсосоАтрСт со строгим контролем количества копий, которая может использоваться для определения количества копий плазмид, содержащих ген Ыа.

3. Установлена зависимость между количеством плазмид pHisNucSma и pHisNucA в рекомбинантных штаммах Е. coli LK111X и Е. coli TGE900, количеством синтезируемой ß—лактамазы, уровнем устойчивости к ампициллину и активностью исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов.

4. Показано, что базальный уровень экспрессии генов эндонуклеаз NucSma и NucA (за исключением токсичной эндонуклеазы NucA дикого типа) оказывает положительное воздействие на выживаемость рекомбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900.

5. Установлена обратная зависимость между активностью исходного и мутантных вариантов эндонуклеазы NucSma при базальном уровне экспрессии их генов и стабильностью наследования плазмид pHisNucSma. Среди плазмид pHisNucA наиболее стабильно наследуются плазмиды, содержащие гены мутантных вариантов эндонуклеазы NucA с 1% и 10% нуклеаз-ными активностями.

6. Установлена зависимость между уровнем устойчивости рекомбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 к налидиксовой кислоте и активностью исходных и мутантных вариантов эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов. Статистически значимых отличий в уровне устойчивости рекомбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 к новобиоцину в зависимости от активности эндонуклеаз NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов не было выявлено.

4.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Основным результатом данной работы является установление влияния базального уровня экспрессии генов исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA на свойства рекомбинантных штаммов Escherichia coli.

Посредством температурной индукции рекомбинантных штаммов Е. coli TGE900, содержащих температурочувствительный белок-репрессор С1 $ 57? было установлено, что гетерологичные клетки E. coli подходят для экспрессии на базальном уровне находящихся в плазмидах генов исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA.

Как известно, большинство используемых в настоящее время генетических систем контролируемой транскрипции допускают слабую (базальную) экспрессию клонированного гена даже в присутствии белка-репрессора [Herman-Antosiewicz et al., 2001; Bahar et al., 2011]. Предположив существование экспрессии находящихся в плазмидах генов исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA даже в присутствии белка-репрессора, выполнение экспериментов было начато с определения базального уровня экспрессии генов данных нуклеаз в рекомбинантных штаммах Е. coli LK111X и Е. coli TGE900. Для этого сначала определяли нуклеазную активность не подвергшихся температурной индукции рекомбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 с использованием метода индикаторных сред [Meiss et al., 2001]. Выбор этого метода основывался на его высокой чувствительности и относительной простоте выполнения. Проведенные эксперименты показали наличие нуклеазной активности в исследуемых штаммах, то есть результаты этих экспериментов указывают на экспрессию генов исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA в рекомбинантных штаммах Е. coli LK111X и Е. coli TGE900 даже в присутствии белка-репрессора из-за неполного ингибиро-вания белком-репрессором промоторов этих генов. Полученные результаты по определению нуклеазной активности рекомбинантных штаммов вполне согласуются с литературными данными [Franke et al., 1999; Friedhoff et al., 1994bFriedhoff et al., 1996; Meiss et al., 1998].

Известно, что векторная ДНК сообщает клетке-хозяину новые свойства, дающие ей селективные преимущества, но сверхсинтез продукта чужеродного гена, а также сам продукт, могут оказывать негативное влияние на скорость роста и деление клеток [Goldwin et al., 1979]. Поэтому необходимо было изучить влияние плазмид pHisNucSma и pHisNucA, содержащих гены исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA, на выживаемость рекомби-нантных штаммов E. coli LK11IX и E. coli TGE900. В результате проведенных экспериментов было установлено, что экспрессия клетками рекомбинантных штаммов E. coli LK11IX и E. coli TGE900 ферментативно активных вариантов NucSma и NucA (за исключением чрезвычайно токсичной NucA дикого типа) обладает положительным эффектом на выживаемость рекомбинантных штаммов. Таким образом, было сделано предположение, что данные нуклеа-зы стимулируют деление клеток рекомбинантных штаммов, что, скорее всего, связано с возможным участием эндонуклеаз NucSma и NucA в репликации ДНК в бактериальной клетке.

Цикл экспериментов по выяснению характера взаимодействия плазмид, содержащих гены исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA, и клеток штаммов-хозяев был начат с определения уровня устойчивости к ампициллину — агенту, селектирующему используемые в данной работе плазмиды. Для этого применяли метод градиентного агара, содержащего различные концентрации ампициллина [Barth et al., 1978]. Результаты экспериментов показали, что существуют различия в устойчивости к ампициллину в зависимости от активности исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA, гены которых экспрессируются в данных штаммах на базальном уровне. Учитывая имеющиеся в литературе данные о существовании прямой зависимости между дозой (количеством копий) гена Ыа, обуславливающего устойчивость к ампициллину, и количеством синтезируемого фермента ß—лактамазы [Uhlin et al., 1977; Бергквист с соав., 1989], было выдвинуто предположение, что выявленные различия в уровнях устойчивости к ампициллину у рекомбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 могут служить косвенным доказательством изменения количества кодирующих эту устойчивость генов bla.

Для проверки этого предположения, используя метод йодометрического титрования [Perret, 1954], провели измерение количества синтезируемой ре-комбинантными штаммами Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 ß—лактамазы, по количеству которой косвенно судили о количестве содержащихся в клетках плазмид. В качестве референс-плазмиды с известным числом копий использовали сконструированную в данной работе плазмиду рЕТсосоАтрСт. Анализируя результаты данных исследований в сравнении с имеющимися данными о существовании прямой зависимости между количеством копий плазмид, содержащих ген bla, и уровнем устойчивости к ампициллину [Ely et al., 1981], можно заключить, что увеличение количества генов bla в клетках ре-комбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 происходит из-за увеличения количества плазмид, в которых находятся эти гены, и зависит от активности исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов. Обсуждая возможные причины существования подобной зависимости между активностью нуклеаз и количеством плазмид-ных копий, мы склонны считать, что такое изменение количества копий гена bla, возможно, связано с участием NucSma и NucA в увеличении количества копий плазмид в ходе репликации в бактериальных клетках, то есть, находясь в гетерологичных клетках Е. coli, NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов сменили свою биологическую функцию, и вместо трофической функции [Franke et al., 1999] стали принимать участие в репликации. Возможность изменения биологической функции нуклеазы в гетерологичной системе клетки уже была отмечена в некоторых работах [Куприянова-Ашина, 1991; Xiao et al., 2007; Balasundaram et al., 2009].

Как уже было сказано выше, введение клонированного гена в составе вектора в бактериальную клетку оказывает негативное влияние на ее физиологические и метаболические процессы и генетический материал, не нужный для ее размножения, в ходе деления клетки неминуемо утрачивается. По этой причине было необходимо провести исследования стабильности наследования плазмид pHisNucSma и pHisNucA в ряду клеточных поколений. Проведенное для выполнения этой задачи изучение спонтанной элиминации вышеперечисленных плазмид показало увеличение стабильности их наследования в клетках Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 с повышением активности исходных и мутантных вариантов NucSma и Nue А, гены которых находятся в этих плазмидах. Обнаруженная в ходе выполнения работы зависимость между активностью экспрессирующихся на базальном уровне исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA также хорошо согласуется с ранее выдвинутым предположением о возможном влиянии данных нуклеаз на репликацию плазмидной ДНК. Следует повториться, что высокий негативный эффект, оказываемый токсичным белком на жизненно важные функции клетки-хозяина, приводит к удалению нежелательного генетического материала из клетки [Goldwin et al., 1979]. Исходя из этого факта, обнаруженная нами низкая стабильность наследования плазмиды с геном NucA дикого типа, вероятнее всего, связана с высоким токсическим эффектом, который данная нуклеа-за оказывает на клетку-хозяина [Meiss et al., 1998].

Исходя из ранее выдвинутого предположения о возможном влиянии.

NucSma и NucA на репликацию ДНК в гетерологичной клетке Е. coli, в заt ключительных экспериментах было изучено действие ингибиторов репликации ДНК на рекомбинантные штаммы Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900. Для решения данной задачи использовали налидиксовую кислоту и новобиоцин, которые действуют на разные субъединицы ДНК-гиразы — фермента, изменяющего топологию ДНК в процессе ее репликации [Льюин, 1987]. Действительно, если NucSma и NucA каким-то образом участвуют в репликации ДНК, то с увеличением активности синтезируемых клетками рекомбинантных штаммов эндонуклеаз будет наблюдаться увеличение устойчивости к агенту, ингибирующему репликацию ДНК. Использование метода градиентного агара с различными концентрациями антибиотиков [Barth et al., 1978], как мы и предполагали, позволило выявить зависимость между активностью исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA и устойчивостью клеток рекомби-нантных штаммов Е. coli LK111X и Е. coli TGE900 к налидиксовой кислоте. Известно, что налидиксовая кислота связывает А-субъединицу ДНК-гиразы, которая ответственна за образование разрывов и связывание фермента с ДНК с образованием тройного комплекса «налидиксовая кислота-ДНК-гираза-ДНК», блокирующего продвижение репликационной вилки [Fong et al, 2008]. Образование тройного комплекса происходит до появления разрыва в ДНК, создаваемого ДНК-гиразой, и последний для комплексообразования не требуется [Hooper, 1999]. Известно, что при прикреплении фермента, в частности топоизомеразы, к ДНК ее локальная конформация соответствует А-форме ДНК [Lipps et al, 1983], которую предпочтительнее распознают эндо-нуклеазы NucSma и NucA [Meiss et al, 1995]. Вероятно, при ингибировании топоизомеразной активности ДНК-гиразы эндонуклеазы NucSma и NucA инициируют в области ori образование «ников» неподалеку от тройного комплекса, что ведет к его удалению и восстановлению репликации.

В отличие от этого, выявленное в ходе выполнение работы отсутствие статистически значимых различий в устойчивости рекомбинантных штаммов Е. coli LK11IX и Е. coli TGE900 к новобиоцину свидетельствует о невозможности NucSma и NucA компенсировать функцию 5-субъедимицы ДНК-гиразы по восстановлению нативной структуры фермента после одного раунда репликации.

Заключая обсуждение полученных результатов, следует еще раз отметить, что увеличение количества генов Ыа в клетках рекомбинантных штаммов, по-видимому, происходит за счет увеличения количества рекомбинантных плазмид, в которых содержатся данные гены, и зависит от активности исходных и мутантных вариантов NucSma и NucA при базальном уровне экспрессии их генов. Таким образом, полученные в данной работе данные демонстрируют возможность участия NucSma и NucA в репликации ДНК в рекомбинантных штаммах.

Показать весь текст

Список литературы

  1. , Ю.С. Развитие технологий получения и перспективы использования эндонуклеазы Serratia marcescens текст. / Ю. С. Аликин, Л. П. Серженко, В. П. Клименко //11 Всероссийской конференции «Ферменты микроорганизмов»: Сб. Докл. Казань, 1998.-е. 152−163.
  2. , Дж. Основы биохимической инженерии Текст. / Дж. Бейли, Д. Оллис // М.: Мир, 1989. 586 с.
  3. , И.С. Мутационный анализ бактерий. Методические указания для лабораторных работ по генетике микроорганизмов Текст. // Казань, изд-во Казанского государственного университета, 1985. 26 с.
  4. , Ю.Б. Клиническая фармакология и фармакотерапия Текст. / Ю. Б. Белоусов, B.C. Моисеев, В. К. Лепахин // Изд.: Универсум Пабли-шинг, 1997.-531 с.
  5. , М.И. Нуклеиновые кислоты, используемые в качестве основного источника питания бактерий Текст. / М. И. Беляева, М. Н. Капранова, М. И. Витол, И. А. Голубенко, И. Б. Лещинская // Микробиология. -1976.-№ 45.-с. 420−424.
  6. , П. Плазмиды. Методы Текст. / П. Бергквист, К. Харди, Б. Оудега, Н. Панайотатос, Э. Пагсли, К. Томас, Ф. Янгмен // М.: Мир, 1989.-267 с.
  7. , Т.Т. Биологическая химия Текст. / Т. Т. Березов, Б.Ф. Коров-кин // М.: Медицина, 1998. 704 с.
  8. , O.A. Синтез внеклеточной эндонуклеазы Serratia marcescens рекомбинантными штаммами Escherichia coli Текст. / O.A. Гимадутдинов, Л. М. Анцилевич // Биотехнология. 1993. — № 5. — с. 15−18.
  9. , Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. Текст. / Б. Глик, Дж. Пастернак // М.: Мир, 2002. 589 с.
  10. , Д. (ред.) Клонирование ДНК. Методы Текст. М.: Мир, 1988. -538 с.
  11. , Б.В. Цианобактерии в биосфере Текст. // Соровский образовательный журнал. 1996. — № 9. — с. 33−39.
  12. , М.В. Микробиология: Учебник для студ. биол. специальностей вузов Текст. / М. В. Гусев, JI.A. Минеева // М.:Издательский центр «Академия», 2003. 464 с.
  13. , Д.Г. Биологическая химия Текст. / Д. Г. Кнорре, С. Д. Мызина // М.: Высш. шк., 2000. 479 с.
  14. Куприянова-Ашина, Ф. Г. Влияние экзогенных дезоксирибонуклеаз на синтез ДНК, рост и деление клеток микроорганизмов: автореф. дис. на соиск. уч. степ, доктора биол. наук: 03.00.07 Текст. / Куприянова-Ашина Флера Гарифовна. Москва, 1991. — 46 с.
  15. , И.Б. Нуклеазы Serratia marcescens Текст. / И.Б. Лещин-ская, З. Ф. Богаутдинов // Микробиология. — 1963. — Т. 32, вып. 34. — с. 413−415.
  16. , И.Б. Сравнительное изучение бактериальных фосфомоно-и фосфодиэстераз, гидролизующих нуклеиновые кислоты и нуклеотиды Текст. / И. Б. Лещинская, М. И. Беляева, К. З. Гильфанова // Микробиология. 1968. — Т. 37. — с. 979−983.
  17. , И.Б. Методы определения нуклеаз и родственных ферментов Текст. / И. Б. Лещинская, Н. П. Балабан, М. Н. Капранова, И.А. Голу-бенко // в кн. «Современные методы изучения нуклеиновых кислот и нуклеаз микроорганизмов». Казань, 1980. — с. 53−60.
  18. , И.Б. Нуклеазы бактерий Текст. / И. Б. Лещинская, В. П. Варламов, Б. М. Куриненко // Издательство Казанского университета. -1991.-232 с.
  19. , Б. Гены. Пер. с англ. Текст. -М.: Мир, 1987. 544 е., ил.
  20. , Дж. Эксперименты в молекулярной генетике Текст. М.: Мир. — 1976.-440 с.
  21. , В.Н. Основы генетической инженерии Текст., 2-е изд., пере-раб. доп.: Учебник для вузов СПб: Изд-во СПб ГТУ, 2002. — 522 с.
  22. , Ю.О. Антибиотики и оболочка бактериальной клетки Текст. / Ю. О. Сазыкин, П. С. Навашин // Итоги науки и техники. М: ВИНИТИ. -1991.-№ 31.-с. 111−127.
  23. , C.B. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии Текст. Изд-во НИНАХ СГМА, 2002. — 294 с.
  24. , М. Гены и геномы. Т. 1. Текст. / М. Сингер и П. Берг // Дрофа, 1998.-373с.
  25. , И.В. Регуляция биосинтеза белка. Учебно-методическое пособие Текст. / И. В. Стручкова, A.A. Брилкина, А. П. Веселов // Нижний Новгород, 2010.- 100 с.
  26. , М.Н. Получение нуклеазы Serratia marcescens в гомогенном состоянии и изучение физико-химических свойств фермента Текст. / М. Н. Филимонова, Н. П. Балабан, Ф. Р. Шарипова и И. Б. Лещинская // Биохимия. 1980. — Т. 45, вып. 11.-е. 2096−2104.
  27. , М.Н. Выделение и характеристика изоформ внеклеточной нуклеазы Serratia marcescens Текст. / М. Н. Филимонова, A.A. Дементьева, И. Б. Лещинская, Г. Л. Бакулина, C.B. Шляпников // Биохимия. -1991. Т. 56, вып. 3. — с. 508−520.
  28. , М.Н. Изоформы нуклеазы Serratia marcescens. Сравнительный анализ субстратной специфичности Текст. / М. Н. Филимонова, A.B. Гарусов, Т. А. Сметанина и др. / Биохимия. 1996. — Т. 61, выл. 10. -с. 1800−1806.
  29. , М.Н. Эндонуклеазы Serratia marcescens. Определение димеров Текст. / М. Н. Филимонова, Н. Г. Уразов // XI Всероссийская конференция «Ферменты микроорганизмов». — Казань, 1998. — с. 89−93.
  30. , М.Н. Полидисперность нуклеазы Serratia marcescens при оптимальном значении pH Текст. / М. Н. Филимонова, М.Дж. Бенедик, Н. Г. Уразов и И. Б. Лещинская // Приклад, биохим. микробиол. 1999. -Т. 35, № 1.-е. 20−24.
  31. , С.Н. Генетическая инженерия Текст., 2-е изд., испр. идоп.: Учебно-справочное пособие Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004.-496 с.
  32. , Д.В. Индукция синтеза внеклеточной эндонуклеазы Serratia marcescens агентами, подавляющими репликацию ДНК Текст. / Д. В. Юсупова, Р. Б. Соколова, О. В. Порфирьева и А. З. Пономарева // Микробиология. 1991. — Т. 60, вып. 2. — с. 279−284.
  33. , Д.В. Влияние налидиксовой кислоты и митомицина С на рост и биосинтез внеклеточных белков Serratia marcescens Текст. / Д. В. Юсупова, Р. Б. Соколова, Е. В. Петухова // Антибиотики и химиотер. — 1993. Т. 3 8, № 8−9. — с. 16−21.
  34. Adams, D.E. Cre-lox recombination in Escherichia coli cells. Mechanistic differences from the in vitro reaction Текст. / D.E. Adams, J.B. Bliska and N.R. Cozzarelli //J. Mol. Biol. 1992a. — Vol. 226. — p. 661−673.
  35. Ali, J.A. The 43 kDa N-terminal fragment of the gyrase В protein hydrolyses ATP and binds coumarin drugs Текст. / J.A. Ali, A.P. Jackson, A.J. Howells and A. Maxwell // Biochemistry. 1993. — Vol. 32. — p. 2717−2724.
  36. Aucken, H.M. Identification of capsular antigens in Serratia marcescens Текст. / H.M. Aucken, S.G. Wilkinson, T.L. Pitt // J. Clin. Microbiol. -1997.-Vol. 35.-p. 59−63.
  37. Bahar, B. Bovaine lactoferrin (LTF) gene promoter haplotypes have different basal transcriptional activities Текст. / В. Bahar, F. O’Halloran, M.J. Calla-nan, S. McParland, L. Giblin, T. Sweeney // Anim. Genet. 2011. — Vol. 42. -p. 270−279.
  38. Balasundaram, B. Step change in the efficiency of centrifugation through cell engineering: co-expression of Staphylococcal nuclease to reduce the viscosity of the bioprocess feedstock Текст. / В. Balasundaram, D. Nesbeth,
  39. J.M. Ward, E. Keshavara-Moore, D.G. Bracewell // Biotechnol. Bioeng. -2009.-Vol. 104.-p. 134−142.
  40. Ball, Т.К. The extracellular nuclease gene of Serratia marcescens and its secretion from Escherichia coli Текст. / Т.К. Ball, P.N. Saurugger, M. Benedik // Gene. 1987. — Vol. 57. — p. 183−192.
  41. Ball, Т.К. Expression of Serratia marcescens extracellular proteins requires RecA Текст. / Т.К. Ball, C.R. Wasmuth, S.C. Braunagel and M.J. Benedik // J. Bacterid. 1990. — Vol. 172. — p. 342−349.
  42. Ball, Т.К. Disulfide bonds are required for Serratia marcescens nuclease activity Текст. / Т.К. Ball, Y. Suh and M.J. Benedik // Nucleic. Acids Res. -1992. Vol. 20. — p. 4971−4974.
  43. Barth, P.T. Copy number of coexisting plasmids in Escherichia coli K-12 Текст. / P.T. Barth, H. Richards, N. Datta // J. Bacteriol. 1978. — Vol. 135. -p. 760−765.
  44. Bentley, R. Biosynthesis of vitamin К (menaquinone) in bacteria Текст. / R. Bentley, R. Meganathan // Microbiol. Rev. 1982. — Vol. 46. — p. 241−280.
  45. Bickle, T. Biology of DNA restriction Текст. / T. Bickle, D. Kruger // Microbiol. Rev. 1993. — Vol. 57. — p. 434−450.
  46. Bradford, P.A. Extended-spectrum ?-lactamases in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat Текст. // Clin. Microbiol. Rev. 2001. — Vol. 14. — p. 933−951.
  47. Bustos, S.A. Functional domains of the AraC protein Текст. / S.A. Bustos, R.F. Schleif// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. — Vol. 90. — p. 5638−5642.
  48. Caballero, I. Evaluation of the Serratia marcescens nuclease (NucA) as a transgenic cell ablation system in porcine Текст. /1. Caballero, J.A. Piedrahi-ta // Animal Biotechnology. 2009. — Vol. 20. — p. 177−185.
  49. Caron, P. Alignment of primary sequences of DNA topoisomerases Текст. / P. Caron and J.C. Wang // Adv. Pharmacol. 1994. — Vol. 29A. — p. 271−297.
  50. Chen, C. Solvent participation in Serratia marcescens endonuclease complexes Текст. // С. Chen, B.W. Beck, K. Krause, B.M. Pettitt // Proteins: Structure, Function and Bioinformatics. 2006. — Vol. 62. — p. 982−995.
  51. Chen, C. Advantage of being a dimer for Serratia marcescens endonuclease? Текст. / С. Chen, К. Krause, B.M. Pettitt // J. Phys. Chem B. 2009. — Vol. 113.-p. 511−521.
  52. Chen, X. Novel expression vector for secretion of cecropin AD in Bacillus subtilis with enhanced antimicrobial activity Текст. / X. Chen, F. Zhu, Y. Cao, S. Qiao // Antimicrob. Agents Chemother. 2009. — Vol. 53. — p. 36 833 689.
  53. Conner, B.N. The molecular structure of d (ICpCpGpG), a fragment-of right-handed double helical A-DNA Текст. / B.N. Conner, T. Takano, S. Tanaka, K. Itakura, and R.E. Dickerson // Nature. 1982. — Vol. 295. — p. 294−299.
  54. Conte, M.R. Conformational properties and thermodynamics of the RNA duplex r (CGCAAAUUUGCG)2: comparison with the DNA analogue d (CGCAAATTTGCG)2 Текст. / M.R. Conte, G.L. Conn, T. Brown, A.N. Lane // Nucl. Acids Res. 1997. — Vol. 25. — p. 2627−2643.
  55. Corbett, K.D. The structural basis for substrate specificity in DNA topoiso-merase IV Текст. / K.D. Corbett, A.J. Schoeffler, N.D. Thomsen and J.M. Berger // J. Mol. Biol. 2005. — Vol. 351. — p. 545−561.
  56. Crisona, N.J. Alteration of Escherichia coli topoisomerase TV conformation upon enzyme binding to positively supercoiled DNA Текст. / N.J. Crisona and N.R. Cozzarelli // J. Biol. Chem. 2006. — Vol. 281. — p. 18 927−18 932.
  57. Dake, E. Purification and properties of the major nuclease from mitohondria of Saccharomyces cerevisiae Текст. / E. Dake, T. Hoffman // Biol. Chem. -1988. Vol. 263.-p. 7691−7702.
  58. DeBoy II, J.M. Hemolytic activity in enterotoxigenic and nonenterotoxigenic strains of Escherichia coli Текст. / J.M. DeBoy II, I.K. Wachsmuth and B.R. Davis // J. Clin. Microbiol.- 1980.-Vol. 12.-p. 193−198.
  59. DiGate, R.J. Identification of a potent decatenating enzyme from Escherichia coli Текст. / R.J. DiGate and K.J. Marians // J. Biol. Chem. 1988. — Vol. 263.-p. 13 366−13 373.
  60. Drlica, K. Quinolone-mediated bacterial death Текст. / К. Drlica, M. Malik, R.J. Kerns and X. Zhao // Antimicrob. Agents Chemother. 2008. — Vol. 52. -p. 385−392.
  61. Du, L. Engineering multigene expression in vitro and in vivo with small terminators for T7 RNA polymerase Текст. / L. Du, R. Gao, A.C. Foster // Bio-technol. Bioeng. 2009. — Vol. 104. — p. 1189−1196.
  62. Ely, S. Regulation of plasmid DNA synthesis: isolation and characterization of copy number mutant of mini RG-5 and mini F plasmids Текст. / S. Ely, W.L. Staudenbaner//Mol. Gen. Genet. 1981. — Vol. 181. — p. 29−35.
  63. Ferrero, L. Analysis of gyrA and grlA mutations in stepwise-selected ciprof-loxacin-resistant mutant of Staphylococcus aureus Текст. / L. Ferrero, B. Cameron and J. Crouzet // Antimicrob. Agents Chemother. 1995. — Vol. 39. -p. 1554−1558.
  64. Filimonova, M.N. Serratia marcescens endonuclease. Properties of the enzyme Текст. / M.N. Filimonova, L.A. Baratova, N.D. Vospel’nikova, A.O. Zheltova and I.B. Leshchinskaia // Biokhimiia. 1981. — Vol. 46. — p. 16 601 666.
  65. Filimonova, M. Action of hexaaminecobalt on the activity of Serratia mar-cescens nuclease Текст. / M. Filimonova, V. Gubskaya, I. Nuretdinov, I. Leshchinskaya // BioMetals. 2003. — Vol. 16. — p. 447−453.
  66. Fong, W. Antimicrobial Resistance and Implications for the Twenty-First Century. Chapter 4: Resistance of Gram-Negative Bacilli to Antimicrobials Текст. / W. Fong and K. Drlica (eds.) // Springer. 2008. — p. 97−159.
  67. Foster, T.J. Plasmid-determined resistance to antimicrobial drugs and toxic metal ions in bacteria Текст. // Microbiol. Rev. 1983. — Vol. 47. — p. 361 409.
  68. Fotadar, U. Growth of Escherichia coli at elevated temperatures Текст. / U. Fotadar, P. Zaveloff, L. Terracio // J. Basic Microbiol. 2005. — Vol. 45. — p. 403−404.
  69. Franke, I. On the Advantage of Being a Dimer, a Case Study Using the Di-meric Serratia Nuclease and the Monomeric Nuclease from Anabaena sp. Strain PCC 7120 Текст. / I. Franke, G. Meiss and A. Pingoud // J. Biol. Chem. 1999. — Vol. 274. — p. 825−832.
  70. Friedhoff, P. Analysis of the mechanism of the Serratia nuclease using site-directed mutagenesis Текст. / P. Friedhoff, B. Kolmes, O. Gimadutdinow, W. Wende, K.L. Krause and A. Pingoud // Nucleic. Acids Res. 1996. — Vol. 24. — p. 2632−2639.
  71. Friehs, K. Plasmid copy number and plasmid stability Текст. // Adv. Bio-chem. Engin. Biotechnol. 2004. — Vol. 86. — p. 47−82.
  72. Fuller, W. A molecular model for the interaction of ethidium bromide with deoxyribonuclein acid Текст. / W. Fuller, M. Waring // Phys. Chem. 1964. -Vol. 68.-p. 805−809.
  73. Gellert, M. Novobiocin and coumermycin inhibit DNA supercoiling catalyzed by DNA gyrase Текст. / M. Gellert, M.H. O’Dea, T. Itoh and J.-I. To-mizawa // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. — Vol. 73. — p. 4474−4478.
  74. Gellert, M. Nalidixic acid resistance. A second genetic character involved in DNA gyrase activity Текст. / M. Gellert, K. Mizuuchi, M.H. O’Dea, T. Itoh and J.-I. Tomizawa // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. — Vol. 74. — p. 4772−4776.
  75. Ghosh, M. Structural insights into the mechanism of nuclease A, a 3|3a metal nuclease from Anabaena [Текст. / M. Ghosh, G. Meiss, A. Pingoud, R.E. London, L.C. Pedersen // J. Biol. Chem. 2005. — Vol. 280. — p. 2 799 027 997.
  76. Ghosh, M. The nuclease A inhibitor complex is characterized by a novel metal ion bridge Текст. / M. Ghosh, G. Meiss, A. Pingoud, R.E. London, L.C. Pedersen // J. Biol. Chem. — 2007. — Vol. 282. — p. 5682−5690.
  77. Ghuysen, J.M. Serine P-lactamases and penicillin-binding proteins, Текст. / L.N. Ornston, А. В allows and E.P. Greenberg (eds.) // Ann. Rev. Microb. -1991.-Vol. 45.-p. 37−67.
  78. Gibert, I. Distribution of insertion sequence IS200 in Salmonella and Shigella Текст. / I. Gibert, J. Barbe, J. Casadesus // J. Gen. Microbiol. 1990. — Vol. 136.-p. 2555−2560.
  79. Gilbert, E.J. The 24 kDa N-terminal sub-domain of the DNA gyrase В protein binds coumarin drugs Текст. / E.J. Gilbert and A. Maxwell // Mol. Microbiol. 1994. — Vol. 12. — p. 365−373.
  80. Goldwin, D. The influence of the grouth on the syability of a drug resistance plasmid in Escherichia coli K-12 Текст. / D. Goldwin, J.N. Stater // J. Gen. Microbiol. 1979. — Vol. 111. — p. 201−209.
  81. Gootz, T.D. Chemistry and mechanism of action of the quinolone antibacte-rials Текст. / T.D. Gootz, K.E. Brightg // The Quinolones. Academic Press. San Diego, London, Boston, New York, Sydney, Tokyo, Toronto. 1998. -Ed. 2.-p. 29−80.
  82. Gore, J. Mechanochemical analysis of DNA gyrase using rotor bead tracking Текст. // J. Gore, Z. Bryant, M.D. Stone, M. Nollmann, N.R. Cozzarelli and C. Bustamante / Nature. 2006. — Vol. 439. — p. 100−104.
  83. Hacker, J. Pathogenicty islands and the evolution of Microbes Текст. / J. Hacker, J.B. Kaper // Annu. Rev. Microbiol. 2000. — Vol. 54. — p. 641−679.
  84. Hane, M.W. Escherichia coli K-12 mutants resistant to nalidixic acid: genetic mapping and dominance studies Текст. / M.W. Hane and Т.Н. Wood // J. Bacteriol. 1969. — Vol. 99. — p. 23 8−241.
  85. Hejazi, A. Serratia marcescens Текст. / A. Hejazi, F.R. Falkiner // J. Med. Microbiol. 1997. — Vol. 46. — p. 903−912.
  86. Herman-Antosiewicz, A. A plasmid cloning vector with precisely regulatable copy number in Escherichia coli Текст. / A. Herman-Antosiewicz, M. Obu-chowski and G. Wegrzyn // Mol. Biotechnol. 2001. — Vol. 17. — p. 193−199.
  87. Hiasa, H. DNA strand cleavage is required for replication fork arrest by a frozen topoisomerase-quinolone-DNA ternary complex Текст. / H. Hiasa, D.O. Yousef, and K.J. Marians // J. Biol. Chem. 1996. — Vol. 271. — p. 2 642 426 429.
  88. Hooper, D.C. Mode of action of fluoroquinolones Текст. // Drugs. 1999. -Vol. 58.-p. 6−10.
  89. Jones, K.L. Construction and characterization of F plasmid-based expression vectors Текст. / K.L. Jones, J.D. Keasling // Biotechnol. Bioeng. 1998. -Vol. 59.-p. 659−665.
  90. Kirby, T.W. The nuclease A inhibitor represents a new variation of the rare PR-1 fold Текст. / T.W. Kirby, G.A. Mueller, E.F. DeRose, M.S. Lebetkin, G. Meiss, A. Pingoud, R.E. London // J. Mol. Biol. 2002. — Vol. 320. — p. 771−782.
  91. Konieczny, I. Role of TrfA and DnaA proteins in origin opening during initiation of DNA replication of the broad host range plasmid RK2 Текст. / Т. Konieczny, K.S. Doran, D.R. Helinski, A. Blasina // J. Biol. Chem. 1997. -Vol. 272. — p. 20 173−201 787.
  92. Kubitschek, H.E. Cell volume increase in Escherichia coli after shifts to richer media Текст. // J. Bacteriol. 1990. — Vol. 172. — p. 94−101.
  93. LaemmIy, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Текст. // Nature. 1970. — Vol. 227. — p. 680−685.
  94. Liu, L.F. DNA-DNA gyrase complex: the wrapping of the DNA duplex outside the enzyme Текст. / L.F. Liu and J.C. Wang // Cell. 1978. — Vol. 15. -p. 979−984.
  95. Livermore, D.M. Mechanisms of resistance to (3-lactam antibiotics Текст. // Scand. J. Infect. Dis. 1991. — Vol. 78. — p. 7−16.
  96. , D.L. (ed.) Antimicrobial drug resistance. Chapter 16. Fluoroquinolone resistance in bacteria Текст. // Humana Press, a part of Springer Science+Business Media, LLC. 2009. — p. 195−205.
  97. McEvoy, J.L. Molecular cloning and characterization of an Erwinia caroto-vora subsp. carotovora pectin lyase gene that responds to DNA-damaging agents Текст. / J.L. McEvoy, H. Murata, A.K. Chatterjee // J. Bacteriol. -1990. Vol. 172. — p. 3284−3289.
  98. Meiss, G. Sequence preferences in cleavage of ssDNA by the extracellular Serratia marcescens endonuclease Текст. / G. Meiss, P. Friedhoff, O. Gima-dutdinow et al. // Biochemistry. 1995. — Vol. 34. — p. 11 979−11 998.
  99. Meiss, G. Biochemical characterization of Anabaena sp. strain PCC 7120 non-specific nuclease NucA and its inhibitor NuiA Текст. / G. Meiss, I. Franke, O. Gimadutdinow, C. Urbanke and A. Pingoud // Eur. J. Biochem. -1998. Vol. 251. — p. 924−934.
  100. Meiss, G. The DNA/RNA non-specific Serratia nuclease prefers double-stranded A-form nucleic Acids as Substrates Текст. / G. Meiss, F.U. Gast, A. Pingoud // J. Mol. Biol. 1999. — Vol. 288. — p. 377−390.
  101. Meiss, G. Mechanism of DNA cleavage by the DNA-RNA-non-specific Ana-baena sp. PCC 7120 endonuclease NucA and its inhibition by NuiA Текст. / G. Meiss, O. Gimadutdiniw, B. Haberland, A. Pingoud // J. Mol. Biol. 2000. -Vol. 297.-p. 521−534.
  102. Meiss, G. Microtiter-plate assay and related assays for nonspecific endonuc-leases. Review. No abstract available Текст. / G. Meiss, O. Gimadutdinow, P. Friedhoff, A. Pingoud // Methods Mol. Biol. 2001. — Vol. 160. — p. 37−48.
  103. Mikesell, P. Evidence for plasmid-mediated toxin production in Bacillus anthracis Текст. / P. Mikesell, B.E. Ivins, J.D. Ristroph, T.M. Dreier // Infect. Immun. 1983. — Vol. 39. — p. 371−376.
  104. Miller, M.D. Identification of the Serratia endonuclease dimer: structural basis and implications for catalysis Текст. / M.D. Miller and K.L. Krause // Protein Sci. 1996. — Vol. 5. — p. 24−33.
  105. Muro-Pastor, A.M. The mi i A gene from Anabaena sp. encoding an inhibitor of the NucA sugar-non-specific nuclease Текст. / A.M. Muro-Pastor, A. Herrero and E. Flores // J. Mol. Biol. 1997. — Vol. 268. — p. 589−598.
  106. Nikaido, H. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited Текст. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. — Vol. 67. — p. 593−656.
  107. N611mann, M. Thirty years of Escherichia coli DNA gyrase: from in vivo function to single-molecule mechanism Текст. / M. Nollmann, N.J. Crisona and P.B. Arimondo // Biochimie. 2007. — Vol. 89. — p. 490−499.
  108. Nordstrom, K. Plasmids in bacteria Текст. / Nordstrom K., Helinski, D. R.,
  109. S. N., Clewell D. В., Jackson D. A., Hollaender A., et al. // Pleum Press, New York. 1985. — p. 119.
  110. Nordstrom, K. Copy-number control of the Escherichia coli chromosome: a plasmidologist’s view Текст. / К. Nordstrom, S. Dasgupta // EMBO reports. 2006. — Vol. 7. — p. 484−489.
  111. Novy, R. Coexpression of multiple target proteins in E. coli Текст. / R. Novy, K. Yaeger, D. Held, R. Mierendorf // inNovations. 2002. — Vol. 15. -p. 2−6.
  112. Palomares, L.A. Production of recombinant proteins: challenges and solutions Текст. / L.A. Palomares, S. Estrada-Mondaca, O.T. Ramirez // Methods Mol. Biol. 2004. — Vol. 267. — p. 15−52.
  113. Perret, C.J. Iodometric assay of penicillinase Текст. // Nature (London). -1954.-Vol. 174.-p. 1012−1013.
  114. Rangarajan, E.S. Sugar non-specific endonucleases Текст. / E.S. Rangara-jan, V. Shankar // FEMS Microbiol. Rev. 2001. — Vol. 25. — p. 583−613.
  115. Remaut, E. Plasmid vectors for high-efficiently expression controlled by the PL promoter of coliphage lambda Текст. / E. Remaut, P. Stanssens, W. Fiers //Gene. -1981. -Vol. 15.-p. 81.
  116. Rich, A. Right-handed and left-handed DNA: Conformational information in genetic material Текст. // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1983. -Vol. 47.-p. 1−12.
  117. Roca, J. DNA transport by a type II DNA topoisomerase: evidence in favor of a two-gate mechanism Текст. / J. Roca and J.C. Wang //Cell. 1994.-Vol. 77.-p. 609−616.
  118. Ruiz-Carillo, A. Primers for mitochondrial DNA replication generated by en-donuclease G Текст. / A. Ruiz-Carillo, J. Cote // Science. 1993. — Vol. 261. -p. 765−769.
  119. Saida, F. Expression of highly toxic genes in E. colv. special strategies and genetic tools Текст. // F. Saida, M. Uzan, В. Odaert, F. Bontems // Current Protein and Peptide Science. 2006. — Vol. 7. — p. 47−56.
  120. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual / J. Sambrook, E.F. Fitsch, T. Maniatis Текст. // Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989.-560 p.
  121. Schatz, P.J. Genetic analysis of protein export in Escherichia coli i P.J. Schatz and J. Backwith Текст. // Annu. Rev. Genet. 1990. — Vol. 24. — p. 215−248.
  122. Schoeffler, A.J. DNA topoisomerases: harnessing and constraining energy to govern chromosome topology Текст. / A.J. Schoeffler and J.M. Berger // Quart. Rev. Biophys. 2008. — Vol. 41. — p. 41−101.
  123. Seabold, R.R. Apo-AraC actively seens to loop Текст. / R.R. Seabold, R.F. Schleif // J. Mol. Biol. 1998. — Vol. 278. — p. 529−538.
  124. Sektas, M. Novel single-copy pETcoco™ vector with dual controls for amplification and expression Текст. / M. Sektas, W. Szybalski // inNovations. -2002.-Vol. 14.-p. 6−8.
  125. Seising, E. Two contiguous conformations in a nucleic acid duplex Текст. / E. Seising, R.D. Wells, T.A. Early and D.R. Kearns // Nature. 1978. — Vol. 21.-p. 249−250.
  126. Shea, M.E. Interactions between DNA helicases and frozen topoisomerase IV-quinolone-DNA ternary complexes Текст. / M.E. Shea and H. Hiasa // J. Biol. Chem. 1999. — Vol. 274. — p. 22 747−22 754.
  127. Sleigh, J.D. Antibiotic resistance in Serratia marcescens Текст. // Br. Med. J. 1983.-Vol/287.-p. 1651−1653.
  128. , J. Плазмиды и клетки-хозяева Текст. // Acta virol. 1982. — Vol. 26. — p. 193−206.
  129. Smith, D.H. Mode of action of novobiocin in Escherichia coli Текст. / D.H. Smith and B.D. Davis // J. Bacteriol. 1967. — Vol. 93. — p. 71−79.
  130. Spratt, B.G. Penicillin-binding proteins of gram-negative bacteria Текст. / B.G. Spratt and K.D. Cromie // Rev. Infect. Dis. 1988. — Vol. 10. — p. 699 711.
  131. Su, T.Z. A novel phosphate-regulated expression vector in Escherichia coli Текст. / T.Z. Su, H. Schweizer, D.L. Oxender // Gene. 1990. — Vol. 90. -p. 29−33.
  132. Sugino, A. Energy coupling in DNA gyrase and the mechanism of action of novobiocin Текст. / A. Sugino, N.P. Higgins, P.O. Brown, C.L. Peebles and N.R. Cozzarelli // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. — Vol. 75. — p. 48 384 842.
  133. Suh, Y. Two-Step secretion of the Serratia marcescens extracellular nuclease Текст. // Y. Suh, S. Jin, Т.К. Ball and M.J. Benedik // J. Bacteriol. 1996. -Vol. 178.-No. 3.-p. 3771−3778.
  134. Thayer, H.H. Contraindication for use of Serratia marcescens as tracer organisms in research Текст. // J. dent. Res. 1966. — Vol. 45. — p. 853−855.
  135. Tomas, M. A simple and rapid method for the elimination of R plasmids from enteric bacteria Текст. / M. Tomas, W. Kay // Current Microb. 1984. -Vol. 11.-p. 155−158.
  136. Uhlin, B. R-plasmid gene dosage effects in Escherichia coli K-12, copy mutants of the R-plasmid RI drd-19 Текст. / В. Uhlin, К. Nordstrom // Plasmid. 1977.-Vol. l.-p. 1−7.
  137. Vieira, J. The pUC and M13 mp7 derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers Текст. / J. Vieira and J. Messing // Gene. 1982. — Vol. 19. — p. 259−268.
  138. Vogt, R.L. Escherichia coli 0157: H7 outbreak associated with consumption of ground beef, June-July 2002 Текст. / R.L. Vogt, L. Dippold // Public Health Rep.-2005.-Vol. 120.-p. 174−178.
  139. Von Hippel, P.H. From «simple» DNA-protein interactions to the macromo-lecular machines of gene expression Текст. // Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct.-2007.-Vol. 36.-p. 79−105.
  140. Walsh, C. Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance Текст. // Nature. 2000. — Vol. 406. — p. 775−781.
  141. Wandersman, C. Secretion across the bacterial outer membrane Текст. // Trends Genet. 1992. — Vol. 8. — p. 317−322.
  142. Wang, J.C. DNA topoisomerases Текст. // Annu. Rev. Biochem. 1985. -Vol. 54. p. 665−697.
  143. Wanga, Z. Classification of plasmid vectors using replication origin, selection marker and promoter as criteria Текст. / Z. Wanga, L. Jin, Z. Yuan, G. We’grzyn, A. We’grzyn // Plasmid. 2009. — Vol. 61. — p. 47−51.
  144. Watson, J.D. Molecular biology of the gene Текст. / J.D. Watson, T.A. Baker, S.P. Bell, A.G. Michael, L.R. Losick // Pearson. 2004. — 5ed. — 7121. P
  145. Watt, P.M. Structure and function of type II DNA topoisomerases Текст. / P.M. Watt and I.D. Hickson // Biochem. J. 1994. — Vol. 303. — p. 681−695.
  146. Wigley, D.B. Crystal structure of the N-terminal domain of the DNA gyrase В protein Текст. / D.B. Wigley, G.J. Davies, E.J. Dodson, A. Maxwell and G. Dodson // Nature. 1991. — Vol. 351. — p. 624−629.
  147. Wild, J. Copy-control tightly regulated expression vectors based on pBAC/oriV Текст. / J. Wild, W. Szybalski // Methods Mol. Biol. 2004. -Vol. 267.-p. 155−167.
  148. Williamson, N.R. The biosynthesis and regulation of bacterial prodiginines Текст. / N.R. Williamson, P.C. Fineran, F.J. Leeper and G.P. Salmond // Nat. Rev. Microbiol. 2006. — Vol. 4. — p. 887−899.
  149. Willmott, C.J. The complex of DNA gyrase and quinolone drugs with DNAforms a barrier to transcription by RNA polymerase Текст. / С J. Willmott, S.E. Critchlow, I.C. Eperon and A. Maxwell // J. Mol. Biol. 1994. — Vol. 242.-p. 351−363.
  150. Xiao, F. Engineered apoptotic nucleases for chromatin research / F. Xiao, P. Widlak, W.T. Garrard // Nucleic Acids Res. 2007. — Vol. 35. — p. 93−99.
  151. Yanagida, N. Specific excretion of Serratia marcescens protease through the membrane of Escherichia coli Текст. / N. Yanagida, T. Uozumi, T. Berru // J. Bacteriol. 1986. — Vol. 166. — p. 937−944.
  152. Zechiedrich, E.L. Eukaryotic topoisomerases recognize nucleic acid topology by preferentially interacting with DNA crossovers Текст. / E.L. Zechie-drich and N. Osheroff// EMBO J. 1990. — Vol. 9. — p. 4555−4562.
  153. Zzaman, S. Oligomeric initiator protein-mediated DNA looping negatively regulates plasmid replication in vitro by preventing origin melting Текст. / S. Zzaman, D. Bastia // Molecular Cell. 2005. — Vol. 20. — p. 833−843.
Заполнить форму текущей работой

Сессия? Спокойно!