Введение мышам ДНК плазмиды pcDNA-3S, содержащей ген нуклеокапсидного белка вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом вызывает иммунный ответ

Для Республики Башкортостан весьма актуальной является проблема геморрагической лихорадки с почечным синдромом. Возбудителем данного заболевания в Башкирии является хантавирус серотипа Puumala (PUU), который переносится преимущественно рыжей полевкой Clethrionomysglariolus.

Ежегодно в республике фиксируется до нескольких тысяч случаев заболеваний ГЛПС, нередки летальные исходы (Фазлыева Р. и др., 1995). К сожалению, на сегодняшний день не получены эффективные лекарственные препараты для профилактики и лечения ГЛПС. Поэтому, особенно важным для нашего региона является проблема разработки соответствующих профилактических и лечебных средств, адаптированных к российским штаммам возбудителям этого заболевания.

ДНК-вакцины представляют собой сравнительно новый тип вакцин, принцип применения которых состоит в том, что в организм пациента вводят ДНК, содержащую ген, кодирующий белок патогена, к которому необходимо получить иммунный ответ. Данный метод уже позволил получить полноценный (гуморальный и клеточный) иммунный ответ к огромному количеству патогенных микроорганизмов (Ivoryetal., 2004).

Целью нашей работы являлось создание на основе эукариотического вектора pcDNA₃ плазмидной конструкции, содержащей ген нуклеокапсидного (N) белка вируса ГЛПС и исследование возможного иммунного ответа, индуцированного инъекцией ДНК данной конструкции в мышечную ткань мышей.

Материалы и методы В качестве объекта исследования был избран клонированный фрагмент генома хантавируса серотипа PUU, кодирующий полноразмерный N белок, выделенный из больных, погибших от ГЛПС во время вспышки 1997;1988 г. г. в г. Уфа. В опытах по ДНК_иммунизации использовали нелинейных белых мышей весом 18−20 г в возрасте 8−10 недель.

Для создания генетической конструкции, использованной для иммунизации мышей, применяли стандартные методики (Sambrooketal., 1989). Генную иммунизацию проводили по следующей схеме. Плазмидную ДНК, выделенную и очищенную по стандартной методике, вводили мышам в физиологическом растворе по 100 мкл в концентрации 2 мкг/мл в квадратичную мышцу 3 раза с интервалом в три недели, кровь брали на 0, 3, 6, и 9 неделях опыта. На 10 неделе из мышечной ткани из места инъекции выделили геномную ДНК по методике описанной Д. Мерфи и Дж. Хэнсоном (Гловер и др., 1989). Амплификацию геномной ДНК проводили на многоканальном амплификаторе МС₂ (АО «ДНК_Технология», Москва) в течение 40 циклов при температуре отжига 42 °C. Иммуноферментный анализ (ИФА) проводили по методике, изложенной в лабораторном руководстве Гловера с соавт. (Гловер и др., 1989).

Результаты Фрагмент генома вируса PUU длиной 1302 п.н., кодирующий полноразмерный N вирусный белок, мы переклонировали из созданной нами ранее плазмиды pGEM_TEasyS в вектор для транзиентной экспрессии pcDNA₃ по сайтам для рестриктазы EcoRI. После рестриктазного картирования и секвенирования был отобран клон pcDNA_3S с правильной ориентацией вставки относительно CMV промотора. Полученная конструкция pcDNA-3S отвечает требованиям, предъявляемым для успешной ДНК-вакцинации (Smookeretal., 2004). Вектор pcDNA₃ содержит промотор цитомегаловируса, который обеспечивает высокий уровень экспрессии клонированного гена в эукариотических клетках, а также сигнал полиаденилирования. Для наработки плазмиды в E. сoli в вектор включен прокариотический origin репликации. Кроме того, клонированная последовательность S-сегмента содержит инициирующий ATG и терминирующий TGA триплеты. Плазмидная ДНК данного клона далее была использована нами для иммунизации лабораторных мышей. В качестве контроля использовали вектор pcDNA₃, который вводили по той же схеме, что и pcDNA_3S. Сыворотка всех иммунизированных животных, собранная до начала эксперимента, а также через одну неделю после каждой инъекции была тестирована с помощью непрямого ИФА на присутствие антител к белку N хантавируса.

эукариотический вектор вирус лихорадка

Таблица 1. Гуморальный ответ мышей, иммунизированных плазмидами pcDNA₃ (контроль) и pcDNA_3S, содержащей последовательность, кодирующую N белок вируса PUU

Данные ИФА показали, что внутримышечное введение экспрессирующего вектора pcDNA-3S, кодирующего ген белка N, вызывало у большинства иммунизированных животных повышение уровня иммуноглобулинов, что, видимо, связано с синтезом N-антител (табл.1). Наибольший уровень антител, по сравнению с контролем, был зафиксирован нами в сыворотке опытных животных, взятой на 3 и 6 неделях эксперимента. В дальнейшем происходило некоторое снижение уровня антител, но, у большинства мышей конечный уровень N-антител после третьей инъекции значительно превышал исходный. У контрольного животного, иммунизированного исходным плазмидным вектором pcDNA-3, подобная динамика не наблюдалась. К сожалению, причина отсутствия вышеуказанной динамики у части иммунизированных животных не ясна.

Методом ПЦР было показано присутствие плазмиды pcDNA_3S в мышечной ткани иммунизированных мышей. Амплификация геномной ДНК, выделенной из сайта инъекции с праймером, соответствующем участку с 39 по 59 н. «+» цепи кДНК S_сегмента штамма CG_1820/Уфа₈₃ (ориентация «+») и праймером, комплементарным участку с 552 по 576 н. «+» цепи кДНК S_сегмента штамма CG_1820/Уфа₈₃, (ориентация «-») выявила фрагмент, размер которого совпал с ожидаемым и составил 537 п.н. (рис.1)

Рис. 1. Электрофоретический анализ продуктов ПЦР: 1—маркерные фрагменты ДНК фага л, расщепленные рестриктазой StyI; 2—амплификация геномной ДНК мыши, иммунизированной pcDNA 3; 3, 4, 5, 6—амплификация геномной ДНК мышей, иммунизированных pcDNA 3S

Таким образом, мы предполагаем, что иммунизация мышей плазмидной конструкцией pcDNA-3S, содержащей последовательность, кодирующую белок N вируса серотипа PUU, под контролем CMV промотора, индуцирует эндогенный синтез антител против данного антигена. Различия в динамике N-антител связаны, вероятнее всего, с индивидуальными особенностями иммунной системы мышей, поскольку нами использовались нелинейные мыши. Также полученные нами результаты свидетельствуют, что плазмида pcDNA-3S присутствовала в мышечной ткани иммунизированных животных, по крайней мере, в течение месяца после последней инъекции.

Роль белка N в индукции защитного иммунитета против хантавирусов, вызывающих ГЛПС, остается плохо изученной. Ранее проведенные исследования показали, что N-антитела не обладают нейтрализующей активностью (Hooperetal., 1999). Однако в ряде работ сообщалось, что иммунизация мышей рекомбинантным хантавирусным N белком, а также ДНК-вакцинация животных экспрессирующими векторами, несущими ген белка N патогенных хантавирусов защищало мышей в некоторых случаях от дальнейшего заражения ГЛПС (Ulrich etal., 1998; Buchtetal., 2001; Bharadwajetal., 2002). Поэтому, возможно, что белок N играет важную роль в индукции клеточного иммунитета против инфекции, вызываемой хантавирусами.

Таким образом, в дальнейшем необходимо провести новые долгосрочные эксперименты с целью определить, способна ли полученная нами конструкция вызвать долговременный иммунный ответ в животных, а также защитить их от инфицирования хантавирусом серотипа PUU.

Список литературы

1.Ivory C., Chadee K. DNA vaccines: designing strategies against parasitic infections // Gen. vaccines and therapy. — 2004. — V. 2 — P.17−45.

2.Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning? A laboratory manual, 2nd edn. — 1989. — Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, Gold Spring Harbor.

3.Гловер. Д. Новое в клонировании ДНК. Методы. М.: Мир, 1989. С. 346.

4.Фазлыева Р. М., Хунафина Д. Х., Камилов Ф. Х. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом в республике Башкортостан. У. 1995. С. 243.

5.Smooker P., Rainczuk A., Kennedy N., Spithill T. DNA vaccines and their application against parasites-promise, limitations and potential solutions. 2004. — V.10. — P.189−236.

6.Ulrich R., Lundkvist A., Meisel H., Koletzki D., Brus-Sjolander K., Gelderblom H., Borisova G., Schnitzler P., Darai G., Kruger D. Chimaeric HBC core particles carrying a defined segment of Puumala hantavirus nucleocapsid protein evoke protective immunity in an animal model // Vaccine. — 1998. -V. 16. — P. 272−280.

7.Bucht G., Sjolander K., Eriksson S., Lindgren L., Eigh F. Modifying the cellular transport of DNA-based vaccines alters the immune response to hantavirus nucleocapsid protein // Vaccine. -2001. -V.19. — P. 3820−3829.

8.Bharadwaj M., Mirowsky K., Ye C., Botten J., Masten B., Yee J., Lyons C., Hjelle B. Genetic vaccines protect against Sin Nombre hantavirus challenge in the deer mouse (Peromyscus maniculatus) // J. of Gen. Virol. — 2002. — V. 83. — P. 1745−1751.