Влияние герпесвирусных инфекций на эмбриональное развитие при экстракорпоральном оплодотворении и на течение и исход естественно наступившей беременности

Вирус простого герпеса (ВПГ) и цитомегаловирус (ЦМВ) чрезвычайно широко распространены в популяции и вызывают широкий спектр заболеваний человека [162, 195]. В последние годы возрастает число исследований, свидетельствующих о том, что инфекции органов мочеполовой системы, в том числе вирусные, занимают важное место в структуре причин мужского бесплодия [32, 61]. Мнения исследователей относительно роли герпесвирусов (ГВ) в этиологии нарушений фертильности у мужчин расходятся от полного отрицания влияния ВПГ и ЦМВ на процесс созревания мужских половых клеток [96,191] до установления прямой корреляции между вирусным инфицированием эякулята и мужским бесплодием [67, 173]. V.

Многие вопросы в этой области оставались невыясненными. Так, не была доказана внутригаметная локализация вирусных частиц в зрелых мужских половых клетках, не установлена способность инфицированных ВПГ сперматозоидов участвовать в оплодотворении ооцитов и в передаче вируса эмбрионам через вируссодержащие сперматозоиды. Недостаточно изучены роль и механизмы противовирусной защиты в репродукции человека, которые могли бы эффективно сдерживать развитие герпесвирусной инфекции (ГВИ). Это, прежде всего, относится к реакциям врожденного иммунитета.

В настоящее время бесплодием страдают более 70 млн. пар во всем мире, однако результаты лечения методами вспомогательных репродуктивных технологий остаются относительно невысокими. Так, средняя частота наступления беременности в цикле экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) составляет 30−40%. В связи с этим активно ведутся поиски средств и методов повышения эффективности лечения бесплодия, а также выявления маркеров, которые позволили бы прогнозировать результаты проведения ЭКО. Особый интерес представляет выяснение роли цитокинов, иммунорегуляторная функция которых в репродукции человека мало изучена. В связи с этим перспективным представляется выяснение экспрессии цитокинов в фолликулярной жидкости и в сыворотке крови у пациенток с бесплодием, проходящих лечение методом ЭКО.

Урогенитальные инфекции (УТИ) могут оказывать влияние как на ранние стадии беременности, так и на течение беременности, создают серьезный риск внутриутробного инфицирования плода и неблагоприятного исхода беременности [16]. Особое место среди возбудителей УГИ занимают возбудители вирусных инфекций: ВПГ, ЦМВ. Рост заболеваемости ГВИ у людей репродуктивного возраста, многообразие клинических проявлений с преобладанием бессимптомных форм, определенные трудности в диагностике и терапии позволили Европейскому региональному бюро ВОЗ включить указанные инфекции в группу заболеваний, которые определяют будущее инфекционной патологии человека [13]. Кроме того, эти инфекции представляют перинатальную угрозу, увеличивая риск внутриутробного инфицирования плода и неблагоприятного исхода беременности [19].

Цель и задачи исследования

.

Цель настоящего исследования заключалась в оценке влияния бессимтомных форм ВПГи ЦМВ-инфекций на мужскую фертильность, на ранние стадии эмбриогенеза человека и на течение беременности.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить частоту выявления ВПГ в эякуляте пациентов с нарушением фертильности по сравнению со здоровыми мужчинами.

2. Изучить влияние ВПГ на основные показатели качества спермы (концентрацию сперматозоидов, количество подвижных и морфологически нормальных форм сперматозоидов).

3. Установить, влияют ли герпесвирусы, обнаруженные в сперматозоидах и в фолликулярной жидкости, на исход лечения бесплодия методом ЭКО.

4. Провести анализ уровней цитокинов в фолликулярной жидкости (ФЖ) и в сыворотке крови (СК) у женщин, проходящих лечение бесплодия методом ЭКО, и определить, существует ли зависимость между уровнями цитокинов, показателями эмбриогенеза и эффективностью лечения.

5. Выявить частоту встречаемости прямых маркеров ВПГ и ЦМВ и серологические показатели ВПГ-инфекции у беременных женщин с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом (ОАГА) в течение беременности, начиная со 2-го триместра.

6. Провести анализ влияния иммунотерапии рекомбинантным интерфероном альфа на течение герпесвирусных инфекций у беременных женщин.

7. Оценить влияние ВПГ и ЦМВ на состояние детей, родившихся у инфицированных герпесвирусами матерей.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Установлена частота выявления ДНК ВПГ и инфекционной активности вируса в эякуляте, во фракции подвижных сперматозоидов и в ФЖ у пациентов с бесплодием в браке.

2. Проведен анализ влияния ВПГ на качество спермы, показатели эмбриогенеза и исход лечения бесплодия методом ЭКО.

3. Исследован цитокиновый профиль у пациенток, проходящих лечение бесплодия методом ЭКО. Оценено влияние уровней цитокинов на основные показатели раннего эмбриогенеза и исход лечения по программе ЭКО.

4. Определена распространенность ГВИ в группе беременных женщин с ОАГА. На основании комплексного обследования беременных в динамике установлена частота первичного инфицирования и реактивации ВПГ в данной группе риска.

5. Изучено влияние иммунотерапии с использованием рекомбинантного интерферона а2Ъ (Виферон®-) на элиминацию маркеров ВПГ и ЦМВ.

6. Проведена оценка влияния ВПГ и ЦМВ, обнаруженных у матерей с ОАГА, на состояния новорожденных детей.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Установлена прямая корреляция между инфицированностью эякулята ВПГ и показателями качества спермы. ДНК и инфекционная активность ВПГ выявлены не только в цельном эякуляте, но и во фракции подвижных сперматозоидов.

2. Частота формирования бластоцист после проведения ЭКО статистически значимо ниже при обнаружении ВПГ у партнера во фракции подвижных сперматозоидов по сравнению с пациентами, у которых ВПГ в сперматозоидах выявлен не был. Показано, что у пациенток, у которых в ФЖ присутствовали маркеры ВПГ, достоверно снижена частота имплантации эмбрионов после применения ЭКО.

3. Показано, что при высоких концентрациях ИЛ2 и ИФНу в ФЖ и в СК у женщин, проходивших лечение бесплодия методом ЭКО, частота наступления беременности снижена в 7 раз и 33 раза, соответственно. Предиктором негативного результата лечения могут служить концентрации ИФНу и ИЛ2 в СК выше 9 пг/мл и 5 пг/мл, соответственно.

4. У беременных женщин с ОАГА отмечается высокая инфицированность ВПГ и ЦМВ. В связи с этим показана целесообразность комплексного подхода к диагностике ГВИ у беременных женщин, включающего применение вирусологических, молекулярно-биологических и серологических методов диагностики, с целью своевременного установления активности инфекционного процесса.

5. Показана эффективность включения препарата рекомбинантного интерферона а2Ь (Виферон®-) в состав базовой терапии при лечении ГВИ, начиная со второго триместра беременности.

6. Выявлена повышенная частота рождения детей в тяжелом состоянии и в состоянии средней степени тяжести у беременных с ОАГА, у которых перед родами были обнаружены маркеры ГВИ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ВЫВОДЫ:

1. В эякуляте и во фракции подвижных сперматозоидов у мужчин с бесплодием в браке обнаружена инфекционная активность ВПГ в 28,6% и 11,4% случаев, соответственно. Частота определения ДНК ВПГ во фракции подвижных сперматозоидов была выше и составила 21,4%. Выявлена зависимость между присутствием ВПГ и ухудшением показателей качества спермы: снижена подвижность и количество морфологически нормальных форм сперматозоидов.

2. Показано, что при лечении бесплодия методом ЭКО присутствие ВПГ в сперме не влияет на частоту оплодотворения яйцеклеток и дробления зиготы, но статистически значимо снижает частоту формирования бластоцист, частоту имплантации эмбрионов и частоту наступления беременности.

3. Обнаружение ИЛ2 и ИФНу в высоких концентрациях в фолликулярной жидкости и в сыворотке крови у женщин, проходящих лечение бесплодия методом ЭКО, ассоциируется со статистически значимым снижением частоты наступления беременности. Предиктором негативного результата лечения могут служить концентрации ИФНу и ИЛ2 в сыворотке крови выше 9 пг/мл и 5 пг/мл, соответственно.

4. У 43 из 115 обследованных беременных женщин (37,4%) с ОАГА, но без клинических проявлений ГВИ, в материалах обнаружены маркеры ВПГ и ЦМВ. Реактивация и первичная ЦМВ инфекция были выявлены 30,6% и 2,4%, соответственно. Реактивация и первичная ВПГ инфекция была установлена в 22,4% и 3,5% случаев, соответственно.

5. Включение Виферона®в состав базовой терапии беременных женщин приводило к элиминации маркеров герпесвирусов статистически значимо чаще, чем при базовой терапии без Виферона®-.

6. Установлено, что у женщин с ОАГА при обнаружении ЦМВ в Ш-м триместре беременности риск рождения детей в тяжелом состоянии в 3,9 раза выше, чем у неинфицированных беременных женщин.

Заключение

.

Анализ данных научной литературы, приведенных в настоящем обзоре, показал, что вопросы, связанные с воздействием герпесвирусной инфекции на процессы репродукции, в настоящее время являются актуальными и интенсивно изучаются. В то же время следует отметить, что как в результатах экспериментов, так и в их интерпретации, наблюдаются существенные расхождения. Многие вопросы, связанные с иммунной регуляцией процессов репродукции и с влиянием герпесвирусной инфекции на эти процессы остаются до конца невыясненными. Некоторые из них перечислены ниже.

Во-первых, не определена роль бессимптомной ВПГ-инфекции в процессах репродукции человека. Ассоциация бесплодия с ГВИ.

Во-вторых, не установлены стадии репродукции человека, чувствительные к воздействию вируса.

В-третьих, не выяснено влияние иммунных реакций, развивающихся при вирусной инфекции, на ранние стадии эмбриогенеза.

В-четвертых, отсутствуют необходимые сведения о связи между инфицированием герпесвирусами и исходом лечения бесплодия методом ЭКО.

В-пятых, не получены достаточно полные и достоверные данные о влиянии бессимптомных герпесвирусных инфекций на течение беременности и ее исход.

Цель и задачи диссертационной работы направлены на поиск ответов на поставленные вопросы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Глава 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

5.1. Список основных реактивов и препаратов, использованных в работе.

Антимышиные иммуноглобулины, меченные ФИТЦ (Dako, Дания).

Бальзам для заключения препаратов (Shandon, США) Гематоксилин (БиоВитрум, Россия) Диаминобензидин (ДАБ) (Bioscience, США) Конъюгат Streptavidin/HRP (Dako, Дания).

Моноклональные антитела к белкам ВПГ (ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского"Минздравсоцразвития России).

Перевиваемые клетки почки зеленой мартышки линии Vero (ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского"Минздравсоцразвития России).

Праймеры, меченные биотином (Синтол, ДНК-синтез, Россия).

Протеиназа К (Dako, Дания).

Среда Игла MEM (ПанЭко, Россия).

Тест-системы для выделения ДНК: «ДНК-сорб-А-М», «ДНК-сорб-В (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия).

Тест-системы для детекции ДНК: «АмплиСенс®HSV I, II-EPh" — «АмплиСенс®CMVEPh» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия).

Тест-системы для выявления антител: «ВектоВПГ-IgM» (ООО «Ветор-бест Россия), «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-М», «ДС-ИФА-Анти-ВПГ-1,2−0» и «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G» («Диагностические системы», Россия) Тест-система для определения индекса авидности IgG-AT «ДС-ИФА-Анти-Bnr-1,2-GАвидность», «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-О-АВИДНОСТЬ» Тест-системы для определения уровня цитокинов и ростовых факторов: Human G-CSF (Invitrogen, USA), Human GM-CSF (Biosourse, USA), Human Bcl-2.

Bender MedSystems USA), CD95 Human ELISA Kit (Abcam, USA) и Fas Ligand Human ELISA Kit (Abcam, USA). А также тест-системы ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск, Россия): гамма-Интерферон-ИФА-БЕСТ, Интерлейкин-4 — ИФА.

— БЕСТ, альфа-ФНО — ИФА — БЕСТ, альфа-Интерферон — ИФА — БЕСТ, Интерлейкин-1 бета — ИФА — БЕСТ, Интерлейкин-6 — ИФА — БЕСТ, Интерлейкин-18 — ИФА — БЕСТ, Интерлейкин-2 — ИФА — БЕСТ, Интерлекин-10.

— ИФА — БЕСТ.

Трис (гидроксиметил) аминометан (Serva, Германия) ТритонХ-100 (Serva, Германия) Фосфатно-солевой буфер (ФСБ) Эванс голубой (Sigma, США).

Эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС) (ПанЭко, Россия) СупраСперм (Medi-Cult, Дания).

5.2. Клеточные культуры.

В работе использовали перевиваемую культуру клеток почек зеленой мартышки Vero, полученную из лаборатории культур тканей ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского» Минздравсоцразвития России. Для культивирования Vero использовали среду Игла-MEM (ПанЭко, Москва), содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (HyClone, США), 2 мМ L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина.

5.3. Вирусы.

В работе использовали референс-штамм вируса простого герпеса 1 типа.

— F, любезно предоставленный доктором L. Pereira (США). ВПГ-1 поддерживали путем пассирования на чувствительных клетках линии Vero. Адсорбцию вируса с инфекционной множественностью (ИМ) = 0,1−0,01 БОЕ/кл проводили в течение 1 часа при 37 °C. Затем вносили поддерживающую среду с 2% ЭТС. Инфицированные клетки инкубировали при 37 °C. Сбор вируссодержащей жидкости производили при выявлении 90%-ого цитопатического действия (ЦПД) в монослое (в среднем, 2 дня для ВПГ-1). Для освобождения от фрагментов клеточного детрита вируссодержащую жидкость центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10−15 мин. на центрифуге Jouan MR1812 (Франция) и отбирали пробу для контроля инфекционного титра.

5.4. Определение инфекционной активности ВПГ-1.

Инфекционный титр ВПГ-1, характеризующий активность вируса, определяли в клеточной культуре модифицированным методом бляшек. Для титрования готовили возрастающие десятикратные разведения вируса, которые вносили по 0,05 мл в 96-ти луночные планшеты с монослоем клеток Vero. Панели с материалом инкубировали при 37 °C в течение 7 дней. Очаги инфицированных клеток (бляшки) выявляли иммуноцитохимическим методом с использованием смеси моноклональных антител (МКА) к сверхраннему и позднему белкам ВПГ. Титр вируса выражали в количестве БОЕ, содержащихся в 1 мл (БОЕ/мл), используя формулу А=(а х b)/v, где, А — число бляшкообразующих единиц в 1 мла — среднее число бляшек на одну лункуbразведение вирусаv — объём вносимого вируссодержащего материала.

5.5. Быстрый культуральный метод (БКМ).

БКМ выполняли в соответствии с Методическими рекомендациями, утвержденными Роспотребнадзором [20].

Для выявления ВПГ в культуру клеток Vero вносили 0,2 мл образцов и инкубировали в течение 1 ч при температуре 37 °C в атмосфере 5% СОг. Через 24 ч клетки фиксировали холодным ацетоном в течение 30 мин. при +4°С и проводили детекцию белков ВПГ в реакции непрямой иммунофлюоресценции (нИФ) с помощью вирусспецифических МКА.

5.6. Пациенты.

Обследование беременных женщин и их новорожденных детей проводилось на базе ГБУЗ МО «МОНИИАГ» (г. Москва) в период с 2010 г. по 02 июня 2011 г. Были исследованы клинические материалы (кровь, моча, соскоб из цервикального канала, вагинальный смыв) от 115 беременных женщин с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом (ОАГА), проходящих обследование и лечение в акушерском обсервационном отделении (зав. отд. — д.м.н. Зароченцева Н.В.) и в клинико-диагностическом отделении (зав.отд. — д.м.н. Новикова C.B.) ГБУЗ МО «МОНИИАГ» (г. Москва).

Обследование 404 супружеских пар, обратившихся для лечения бесплодия методом ЭКО, проводилось в лечебно-диагностическом центре «Евро-Клиник» (г. Москва), в отделение репродукции ГБУЗ МО «МОНИИАГ» (г. Москва) и в Медицинском Центре вспомогательных репродуктивных технологий «Новая жизнь» (г. Москва).

Эякулят было получен и исследован от 315 мужчин, обратившихся в медицинские учреждения г. Москвы: в Медико-генетический научный центр РАМНв ФГБУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития Россиив клинику «Альтра-Вита», в клинико-диагностический центр «Пастер» и в медицинский центр «Евро-Клиник».

5.7. Клинический материал.

В качестве клинических образцов исследовали кровь, мочу, урогенитальные соскобы, цельный эякулят, фракцию подвижных сперматозоидов (ПС), а также фолликулярную жидкость (ФЖ).

Цельную кровь центрифугировали в течение 10 мин при 1000 об./мин. Затем стерильно отбирали фракцию лейкоцитов, расположенную над эритроцитами. Для проведения БКМ по 0,2 мл лейкоцитарной фракции вносили в культуру клеток. Сыворотку и/или плазму крови использовали для серологического анализа и определения цитокинового статуса. Мочу центрифугировали в тех же условиях. Для проведения анализа БКМ использовали осадок мочи. Фракцию ПС получали с использованием набора СупраСперм (Medi-Cult). Во всех случаях объем анализируемой пробы ФЖ и ПС для метода БКМ составлял 0,2 мл.

5.8. Твердофазный нммуноферментный анализ (тИФА).

Определение антител к ВПГ и ЦМВ классов M и G в сыворотке крови проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА).

Выявление вирусоспецифических антител проводили с помощью сертифицированных наборов фирм НПО «Диагностические системы» (Россия), а также ЗАО «Вектор-Бест» (Россия). Для определения антител IgM использовали набор «ВектоВПГ-IgM» и «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-М». Для выявления и определения титра IgG антител использовали наборы «ДС-ИФА-Анти-ВПГ-1,2−0» и «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G». Анализ и интерпретацию результатов осуществляли в соответствии с инструкциями фирмы-производителя.

5.9. Определение авидности антител.

Индекс авидности (ИА) специфических IgG определяли с помощью набора «ДС-ИФА-Анти-ВПГ-1,2-С-Авидность» и «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G-АВИДНОСТЬ» фирмы «Диагностические системы» (Россия). Оценку результатов осуществляли согласно рекомендациям фирмы производителя.

5.10. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Выделение ДНК проводили с помощью двух сертифицированных коммерческих наборов ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора («ДНК-сорб-А-М», «ДНК-сорб-В»), в зависимости от природы анализируемой биологической пробы.

В работе были использованы наборы реагентов для выявления нуклеотидных последовательностей методом полимеразной цепной реакции ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора «АмплиСенс®HSV I, II-EPh" — «АмплиСенс®CMVEPh» согласно инструкции фирмы производителя. Амплификация проводилась с использованием термоциклера «Терцик» («ДНК-Технология», Россия) при определенной температурной программе, согласно рекомендации производителя тест-систем.

5.11. Полимеразная цепная реакция in situ.

Препараты для ПЦР in situ готовились на стеклах с адгезивным покрытием (Histobond). Препараты культур клеток для положительных контролей были получены путем культивирования клеток Vero и ФЛЭЧ на адгезивных стеклах.

Фиксировали препараты в 10% нейтральном формалине в течение 4 часов, затем промывали в 0,05 М ТРИС-НС1 рН 8,0 буфере. Затем на стёкла наносили 200 мкл 0,01%) раствора ТритонХ-100 на 90 секунд и стекла промывали в 0,05 М ТРИС-НС1 буфере в течение 2 минут.

Препараты обрабатывали протеиназой К в разведении 1:50 (разведение проводилось в ТРИС-НС1 буфере 0,05М). Время инкубации с протеиназой К было определено в результате проведения серии предварительных опытов. Для препаратов культур клеток оптимальное время инкубации составило 5 мин. Инкубацию проводили в термостате при 37 °C, затем препараты промывали в ТРИС-НС1 буфере 0,05 М. Промытые стекла высушивали на воздухе.

На высушенные стекла наносили по 20 мкл амлификационной смеси, состоящей из смеси праймеров, ПЦР-буфера, дНТФ, ДНК-полимеразы и деионизованной воды. Препараты накрывали покровными стёклами и обрабатывали края клеем для предотвращения испарения амлификационной смеси.

В работе были использованы праймеры, направленные к гену ДНК-полимеразы ВПГ. Амплификация проводилась в амплификаторе Вютейа ТЬегтосус1ег Т1 при оптимизированной температурной программе: 95 °C 2 мин, 30 циклов- 95 °C — 30 сек, 60 °C — 35 сек, 72 °C — 50 сек- 72 °C — 4 мин.

Препараты вынимали из амплификатора, погружали в ёмкость с буфером (0,05 М ТРИС-НС1) и, не вынимая из раствора, с препаратов снимали покровные стёкла. Затем препараты высушивали на воздухе.

Детекцию проводили с использованием комплекса биотин-стрептавидин-пероксидаза хрена и красителя ДАБ. Конъюгат разводили в соотношении 1:100 в ТРИС-НС1 буфере. Инкубацию с коньюгатом проводили в течение 1 часа при 37 °C. После инкубации стекла промывали в ТРИС-НС1 0,05 М буфере и высушивали на воздухе.

На препараты наносили смесь, которую готовили непосредственно перед употреблением: 36% перекись водорода смешивали с раствором ДАБ+ТРИС (в.

1 мл ТРИС-НС1 буфера растворяли 0,0005 г ДАБ) из расчета Імкл Н2О2 на 1 мл ДАБ+ТРИС, наносили 500 мкл раствора на стекло.

Реакцию останавливали через 15 минут дистиллированной водой. После этого препараты 10 секунд докрашивали гематоксилином, высушивали и заключали в бальзам.

Визуализацию проводили с помощью светового микроскопа. В препаратах, инфицированных ВПГ, наблюдались метки в виде темно-коричневых зерен. Далее подсчитывали количество клеток, содержащих метку, и общее количество клеток на препарате.

5.12. Анализ интерферонового статуса и уровней цитокинов.

Уровни цитокинов и факторов роста у женщин, проходящих программу ЭКО, проводили в сыворотке крови и фолликулярной жидкости с использованием тест-систем: Human G-CSF (Invitrogen, USA), Human GM-CSF (Biosourse, USA), Human Bcl-2 (Bender MedSystems USA), CD95 Human ELISA Kit (Abeam, USA) и Fas Ligand Human ELISA Kit (Abeam, USA). А также тест-системы ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск, Россия): гамма-Интерферон-ИФА-БЕСТ, Интерлейкин-4 — ИФА — БЕСТ, альфа-ФНО — ИФА — БЕСТ, альфа-Интерферон — ИФА — БЕСТ, Интерлейкин-1 бета — ИФА — БЕСТ, Интерлейкин-6 — ИФА — БЕСТ, Интерлейкин-18 — ИФА — БЕСТ, Интерлейкин-2 — ИФАБЕСТ, Интерлекин-10 — ИФА — БЕСТ.

5.13 Характеристика используемого иммунопрепарата.

Для лечения беременных женщин использовали иммуномодулирующий препарат Виферон®- (ООО «Ферон», Россия). В состав препарата входит человеческий рекомбинантный интерферон-а2Ь, антиоксиданты (а-токоферола ацетат и аскорбиновая кислота) и основа (масло какао).

5.14. Статистическая обработка данных.

Для статистической обработки результатов использовали пакет прикладных компьютерных программ STATISTICA 6,0. При анализе полученных данных были использованы приемы альтернативного анализа и описательной статистики (среднее арифметическое М, медианы, среднее квадратическое отклонение, а и средняя ошибка ш). Оценка статистической значимости различий в группах с нормальным распределением проводилась с помощью 1>критерия Стьюдента и двухстороннего точного критерия Фишера.

Применение критерия Шапиро-Уилка использовалось для оценки присутствия нормального распределения признаков. Для сравнения непараметрических данных использовали критерий Манна-Уитни, для парных сравнений — критерий Вилкоксона. Различия показателей считали статистически значимыми при р<0,05.

Глава 6. Влияние бессимптомной герпесвируснон инфекции на результаты экстракорпорального оплодотворения.

6.1. Детекция ВПГ в эякуляте.

6.1.1. Частота обнаружения ВПГ в цельном эякуляте и во фракции подвижных сперматозоидов.

Было изучено влияние ВПГ на показатели спермы. Работа проведена совместно с сотрудниками лаборатории генетики нарушений репродукции ГУ МГНЦ РАМН (зав. лаб. доктор биол. наук, профессор Л.Ф. Курило), а также были обследованы мужчины, обратившиеся для лечения бесплодия методом ЭКО в отделение репродуктологии ГБУЗ МО «МОНИИАГ» (руководитель, д.м.н. Краснопольская К.В.).

Инфекционно активный вирус методом БКМ определяли в эякуляте от 245 мужчин, из которых 164 обследовались по поводу бесплодия в браке, 81 фертильный мужчина, проходивших обследование для включения в группу доноров спермы. Данные по частоте обнаружения вируса у пациентов с бесплодием и у здоровых фертильных мужчин представлены в таблице 1.