Криоконсервация и экстракорпоральное оплодотворение

Введение

Что такое криоконсервация Эффективность и объекты криоконсервации Температурный режим Криоповреждения и криопротекторы Криоконсервация эмбрионов Преимущества криоконсервации эмбрионов Процедура замораживания и размораживания эмбрионов Криоконсервация спермы Процедура криоконсервации спермы Криоконсервация ооцитов Преимущества криоконсервации ооцитов Экстракорпоральное оплодотворение как метод в биоинженерии Оплодотворение in vitro в биоинженерии Заключение Список использованных источников

В настоящее время многие люди страдают бесплодием. Возможности лечения бесплодия существенно расширились благодаря разработанной технологии криоконсервации половых клеток и эмбрионов. Хотя замораживание с последующим оттаиванием несколько снижает фертильную способность спермы и жизнеспособность эмбрионов, вероятность наступления беременности после их применения остается достаточно высокой, а на родившихся детей отрицательного влияния эти процессы не оказывают. Замороженные эмбрионы могут быть использованы в циклах, последующих за неудачной попыткой ЭКО, если яйцеклеток и эмбрионов было получено больше, чем это необходимо для переноса в текущем цикле. Это дает возможность не проводить женщине повторную стимуляцию яичников гормональными препаратами и осуществить перенос оттаявших эмбрионов в матку в любом из последующих за ЭКО циклов. Однако, необходимо отметить, что не все неиспользованные эмбрионы являются подходящими для замораживания. Криконсервации подвергаются только эмбрионы с хорошей морфологией, у которых жизненный потенциал достаточно высок и которые по прогнозу эмбриолога смогут перенести процессы заморозки и оттаивания.

Что такое криоконсервация?

Криоконсервамция (от греч. ксэпт — холод и лат. conservo — сохраняю) — низкотемпературное хранение живых биологических объектов с возможностью восстановления их биологических функций после размораживания.

Криоконсервация — метод заморозки биологического материала, при помощи жидкого азота, который обеспечивает сохранение и жизнеспособность клеток после этапа разморозки. Температура при такой заморозке достигает -196°С. Процедура выглядит следующим образом: капсулы с биоматериалом помещаются в жидкий азот, где подвергаются быстрой заморозке. Именно такая низкая температура дает возможность приостановить в клетках все биохимические процессы, и позволяет хранить их долгое время.

В настоящий момент данная процедура очень широко применяется в клиниках, где лечат бесплодие при помощи вспомогательных репродуктивных технологий. КРИО дает огромные возможности семейным парам в данной области, затрагивая большое количество биоматериала, который подлежит криоконсервации.

Для благополучной заморозки следует соблюдать порядок многоэтапного криоконсервирования. Существует один негативный момент, который может затронуть подвергаемый материал при несоблюдении некоторых моментов. Клетки на 90% состоят из воды, тем самым при криоконсервации существует риск кристаллизации воды, то есть образование льда. Данный аспект, бесспорно, является губительным для биоматериала. Для того, чтобы избежать этих неприятных последствий в замораживаемый материал подвергается специальной обработке при помощи криопротекторов. Криопротекторы — вещества, которые имеют способность изменить состав внутриклеточной жидкости, что в свою очередь предотвращает процесс кристаллизации.

Стоит учитывать так же то, что не весь биоматериал переносит заморозку, и потеря замораживаемых клеток при разморозке в среднем составляет около 20%.

Эффективность и объекты криоконсервации

В настоящее время разработаны и успешно применяются в медицине, сельском хозяйстве и научном эксперименте методы криоконсервации клеточных культур, тканей (кровь, сперма), ранних (преимплантационных) эмбрионов. Изолированные органы плохо переносят криоконсервацию, методы криоконсервации целых органов не разработаны, эффективность их низкая. Случаи успешной трансплантации криоконсервированных органов редки, как правило, в таких случаях речь может идти не о восстановлении после размораживания целого органа, а о присутствии в размороженном органе отдельных областей живой ткани. Другими словами, выживает после криоконсервации не орган как единое целое, а участки ткани, которые могут после трансплантации успешно прижиться (например, при трансплантации размороженной яичниковой ткани). Случаи успешной криоконсервации теплокровных животных (в том числе человека) до сих пор не зафиксированы. В настоящее время не существует методов, обеспечивающих выживание криоконсервированных людей, иных млекопитающих животных, а также птиц.

Температурный режим

Как правило, криоконсервацию осуществляют при температуре ?196°C, помещая капсулы с биологическими объектами вжидкий азот. Реже пользуются более высокими температурами (от ?180°C до ?130°C), которые создают электрифицированные морозильные камеры, но данный температурный режим менее надежен и подходит не для всех объектов. Использование температур выше ?130°C малоэффективно и используется редко (например, хранение на сухом льду при ?79°C). Сохранение живых объектов при температурах около нуля градусов традиционно не относят к криоконсервации. Использование низких температур обеспечивает остановку биохимических процессов в клетках, в том числе останавливается обмен веществ и энергией с внешней средой, благодаря этому живые объекты могут сохраняться сколь угодно долго.

Криоповреждения и криопротекторы

Использование низких температур опасно для живых объектов. Живые клетки погибнут при замораживании, если не осуществить специальные защитные мероприятия. Основными повреждающими факторами при замораживании являются образование внутриклеточного льда и обезвоживание клетки. Образование внутриклеточного льда характерно для большой скорости охлаждения (более 10K/мин). Кристаллизация внутриклеточной воды приводит к увеличению внутреннего объема мембранных структур (ядро, аппарат Гольджи, митохондрии, эндоплазматическая сеть, лизосомы, цитоплазматическая мембрана и пр.) Эти структуры разрушаются. Обезвоживание клетки характерно для небольшой скорости охлаждения (менее 10K/мин). Потеря клеткой воды происходит вследствие вымораживания воды во внешней среде и повышения концентрации растворенных веществ во внешней среде.

При охлаждении клетка может потерять до 80−90% воды, при этом разрушаются гидратированные комплексы с макромолекулами, что приводит к так называемой «криоденатурации» — потере биологическими полимерами (прежде всего белками и белковыми комплексами) третичной и четвертичной структуры, что приводит к необратимой утрате функций этих полимеров. В криобиологии повреждения, получаемые клеткой при замораживании, называют «криоповреждения». Лишь некоторые клеточные культуры, а также бактерии могут быть эффективно криоконсервированы без предварительной подготовки. Для эффективной криоконсервации клетки замораживаемых объектов должны быть насыщены криопротекторами — веществами, уменьшающими криоповреждения. После размораживания необходимо удалить криопротекторы из клеток.

Криоконсервация эмбрионов

Криоконсервация эмбрионов широко и с успехом применяется в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) практически во всех клиниках репродуктивной медицины. Это позволило врачам сократить количество свежих протоколов для пар проходящих лечение от бесплодия при помощи ВРТ. В стимулированном протоколе ЭКО у женщины зачастую созревает более 10 яйцеклеток, при благополучном оплодотворении получается несколько эмбрионов. Как правило, производят подсадку 1−2 эмбрионов в полость матки. При помощи криоконсервации у женщины появился шанс на последующие подсадки уже без стимуляций и негативного воздействия гормонов на организм. Перенос эмбрионов после криоконсервации происходит по желанию женщины иметь второго, третьего ребенка, либо после неудачного свежего протокола ЭКО. Так же такая практика осуществляется, если женщина перенесла синдром гиперстимуляции яичников (СГЯ) в свежем протоколе и перенос эмбрионов пришлось отложить. В отличие от заморозки ооцитов, эмбрионы достаточно хорошо переносят криоконсервацию. Перед помещением в жидкий азот эмбрионы размещают в специальных емкостях: соломинках, криофлаконах, риопетлях. Как правило, при криоконсервации в одну емкость размещают 2−3 эмбриона. Во избежание кристаллизации клеток, перед заморозкой эмбрионы так же подлежат обработке специальными веществами — криопротекторами.

Как правило, криоконсервируют эмбрионы на стадии: 4-х, 8-клеточного деления и бластоцист. Заморозке подвергают лишь эмбрионы хорошего качества, после оплодотворения в свежем протоколе ЭКО.

Преимущества криоконсервации эмбрионов

1. Криоконсервация эмбрионов позволяет максимизировать потенциальное зачатие при ЭКО (экстракорпоральном оплодотворении) и предотвратить потери жизнеспособных нормальных запасных эмбрионов. Пожалуй, это самое важное преимущество криоконсервации. Около 50% женщин могут иметь запасные эмбрионы для замораживания. В некоторых клиниках наступление беременности и рождаемость здоровых детей с помощью замороженных эмбрионов столь же высока, как и в случаях с переносом свежих эмбрионов.

2. Замораживание эмбрионов для последующей передачи можно посоветовать женщинам, которые находятся в группе риска по развитию тяжелого синдрома гиперстимуляции яичников после проведенной стимуляции яичников для экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).

3. При имплантации эмбриона процесс может быть нарушен в таких случаях, как наличие полипов эндометрия, недостаточно развитый эндометрий, кровотечения или болезни приблизительно в одно время с переносом эмбрионов.

4. Трудности, возникающие при переносе свежих эмбрионов, возникают при переносе эмбрионов при стенозе шейки матки (неспособность пройти через канал шейки матки, так как шейка матки сужена или имеются рубцы и т. п.).

5. Криоконсервация эмбрионов является очень важной для включения в программы донорства яйцеклеток. Не всегда возможно синхронизировать цикл реципиента с циклом донора яйцеклетки. В некоторых странах является обязательным замораживание всех эмбрионов, созданных из донорских яйцеклеток, с последующим карантин сроком на шесть месяцев, пока доноры проходят повторные скрининг-тесты.

6. В результате успешной программы криоконсервации, замороженные эмбрионы также стали доступны для пожертвования бесплодным парам.

Перед химиотерапией или лучевой терапией.

Процедура замораживания и размораживания эмбрионов

Эмбрионы могут быть заморожены на любом этапе — одна клетка, в начале деления и бластоциста, если они хорошего качества. Эмбрионы хранятся в пакетах по одному или несколько экземпляров в зависимости от количества эмбрионов, которые могут быть пересажены в матку на более позднем сроке. Эмбрионы смешивают с криопротекторной жидкостью (для защиты эмбриона от повреждений во время замораживания). Затем смесь помещается либо в пластиковый контейнер, либо в стеклянную ампулу и хранится в жидком азоте при очень низкой температуре -196°C с использованием специализированных программируемых машин.

Обычное замораживание включает в себя медленное охлаждение эмбриона пока, наконец, он не замирает. Одной из основных проблем, связанных с обычными замораживаниями, является формирование кристаллов льда, которые могут повредить зародыш. Новый метод витрификации постепенно вытесняет традиционный метод. Он включает в себя сверхбыстрое замораживание, так что кристаллизация льда не происходит.

Оттаивание эмбрионов включает в себя удаление эмбрионов из жидкого азота, размораживание их при комнатной температуре, удаление криопротекторной жидкости и помещение эмбрионов в специальную питательную среду. Смесь выдерживают в инкубаторе и готовят к пересадке.

Если эмбрионы были заморожены на стадии раннего деления или бластоцистов, они могут быть разморожены и пересажены в тот же день. Однако если они были заморожены на двухклеточном этапе деления, то они размораживаются на день раньше и культивируются в течение ночи, чтобы их можно было разделить и пересадить, когда они образовывают 2−4 эмбриона. В разных странах созданы разные правила, касающиеся времени, в течение которого эмбрионы могут оставаться замороженными. В Соединенном Королевстве, эмбрионы могут храниться в течение максимум 10 лет. Не все эмбрионы переживают процесс замораживания и оттаивания. При хорошей программе замораживания следует ожидать 75−80% выживания. Таким образом, может быть необходимым оттаивать несколько эмбрионов одновременно, чтобы получить два или три полноценных эмбриона для пересадки. Повреждение эмбрионов имеет место в результате замораживания и во время процесса охлаждения и размораживания, а не во время хранения.

Криоконсервация спермы

С большим успехом криоконсервация используется для заморозки и хранения спермы. Перед сдачей спермы для криоконсервации мужчине необходимо соблюдать режим воздержания в течение 5−7 дней. После обработки собранного материала, сперму помещают в специальные контейнеры — пластмассовые трубочки небольшого диаметра. Затем трубочки подвергают заморозке при помощи жидкого азота. После криоконсервации сохраняется жизнеспособность и подвижность сперматозоидов, что позволяет с успехом использовать их для дальнейшего оплодотворения. Криоконсервация спермы осуществляется по разным причинам. Самая распространенная — сбор донорского материала, для дальнейшей внутриматочной инсеминации или протокола ЭКО, женщинам по программе донорской спермы. Практически в каждой клинике имеется своя база донорской криоконсервированного материала. Перед началом заморозки сперму тщательно исследуют на предмет подвижности, концентрации и нормальных форм сперматозоидов, и подвергают криоконсервации в том случае, если эти показатели укладываются в нормы. Так же, может осуществляться заморозка спермы мужа. Данная процедура показана при предстоящей операции или мероприятий, после которых может пострадать выработка и подвижность сперматозоидов в эякуляте мужчины. Особое внимание в данном случае уделяется предстоящей химиотерапии при онкологических заболеваниях. В связи с губительным воздействием такого рода лечения, в данной ситуации единственным методом сохранения детородной функции мужчины является криоконсервация спермы до начала лечения рака. Срок хранения криоконсервированной спермы ограничен, и считается наиболее оптимальным криоконсервация в течение трех лет.

Процедура криоконсервации спермы

После получения спермы эмбриолог проводит спермограмму. При хороших показателях эякулят сразу же замораживается. При наличии единичных сперматозоидов или замораживании половых клеток, полученных в результате ТЕЗЕ, биоматериал предварительно концентрируется.

В генетический материал добавляют криопротекторы, спустя 10 минут этим содержимым заполняются специальные полипропиленовые пробирки, в которых будет осуществляться хранение спермы. После этого контейнеры помещаются в емкости с жидким азотом в криохранилище. Каждый из контейнеров тщательно маркирован: на нем указаны ФИО, номер карты и дата заморозки. На протяжении всего периода пребывания генетического материала в клинике ЭКО эмбриологи пристально следят за поддержанием оптимальных условий хранения, регулярно внося отметки в специальные журналы.

Криоконсервация ооцитов

Криоконсервация ооцитов отличается довольно сложным процессом. Чтобы добиться благополучной заморозки для ученых потребовались долгие годы работы над этой проблемой. Такой момент объясняется тем, что строение ооцита достаточно специфично. За счет свойств плазматических мембран и меньшего соотношения площади поверхности к объему процесс заморозки без осложнений очень затруднителен. Это усугубляет и тот факт, что зрелая яйцеклетка становится очень чувствительно к низким температурам, что может сказаться на дальнейшем делении уже размороженных клеток. Процесс оплодотворения размороженной яйцеклетки так же становится затруднительным за счет того, что данный метод приводит к уплотнению оболочки ооцита. Именно по этим причинам в процессе долго исследования заморозки ооцитов учеными была разработана новая методика — витрификация. Благодаря данному методу происходит сверхбыстрая заморозка, за счет чего уменьшается риск кристаллизации воды в лед, что сводит к минимуму повреждение ооцитов.

Благодаря современным методам криоконсервации ооцитов, данная процедура с успехом осуществляется во многих клиниках репродукции всего мира. Показаниями для заморозки женских половых клеток может стать программа донорских ооцитов в протоколах ЭКО. Так же данная практика приходится на женщин, планирующих лечение с помощью химиотерапии, для возможности иметь ребенка после лечения онкологического заболевания. Криоконсервация ооцитов применяется и в других случаях: при невозможности оплодотворения яйцеклеток сперматозоидами на момент пункции, при желании молодых женщин сохранить яйцеклетки на неопределенное будущее, при запрете некоторых стран заморозки эмбрионов по религиозным соображениям. На современном этапе развития ЭКО, выполнение программы стимуляции суперовуляции в большинстве случаев сопровождается получением большого числа яйцеклеток и эмбрионов. Разумеется, в полость матки переносятся не все эмбрионы (не более 2-х). Оставшиеся «неперенесенными» эмбрионы, по согласованию с будущими родителями не уничтожаются, ведь неизвестно, наступит ли беременность в этой попытке ЭКО. Кроме того, нельзя забывать, что беременности после ЭКО отличаются повышенным риском невынашивания. Помимо этого, невозможно сказать заранее, не захочет ли через некоторое время после родов эта семейная пара еще одного ребенка. Наряду с этим, иногда возможен отказ от переноса эмбрионов в цикле ЭКО, например, из-за явной угрозы развития синдрома гиперстимуляции яичников средней или тяжелой степени или из-за очень низкого качества эндометрия. Процесс криоконсервации эмбрионов на много уменьшает расходы на попытки, которые могут последовать в дальнейшем, кроме того, он помогает избежать дополнительную лекарственную нагрузку на женский организм во время индукции суперовуляции. Учитывая все вышесказанное, эмбрионы хорошего качества подвергают криоконсервации, то есть глубокой заморозке в жидком азоте, имеющем температуру около — 196 °C. Для этого эмбрионы помещают в специальную среду для заморозки, которая не позволяет образовываться кристалликам льда внутри клеток, которые могли бы разорвать клетку, а переводят цитоплазму клеток в благоприятное для замораживания и хранения в холоде гелеподобное состояние. Плавность снижения температуры обеспечивается специальной высокоточной аппаратурой с компьютерной программой, а сама «заморозка» занимает 1,5−2 часа. Хранятся эмбрионы в специальном, произведенном промышленным образом, криобанке — дюаре в микроконтейнерах — трубочках, напоминающих тоненькие соломинки для коктейлей. В каждую такую «соломинку» набирают до 4−5 эмбрионов и они лежат там в ряд, как горошины в стручке. Каждый микроконтейнер имеет четкие индивидуальные маркеры. Если у пациента несколько таких «соломинок», то все его контейнеры имеют идентичные маркеры, которые не позволяют перепутать его эмбрионы с чужими. В таком состоянии эмбрионы могут храниться долгое время — недели, месяцы, даже годы. Сейчас в медицинской специализированной литературе появляются сообщения о наступлении беременности при переносе эмбрионов, которые пролежали в холоде более 10 лет. Конечно, процесс заморозки-разморозки является стрессом для эмбрионов, часть их при этом может быть потеряна. Вероятность наступления беременности после переноса эмбрионов, перенесших криоконсервацию, ниже, чем при переносе свежих эмбрионов, и составляет порядка 20−25%. Это не так мало, если вспомнить, что вероятность беременности у здоровой семейной пары в одном менструальном цикле составляет примерно те же самые 20−25%. Очень важно отметить, что течение беременности, наступившей после переноса эмбрионов, которые были законсервированы, ничем не отличается от обычной «экошной» беременности. Такая беременность отличается от спонтанной только гормональной поддержкой на ранних сроках. Поздние сроки беременности и родоразрешение никак не отличаются от обычной беременности и определяются акушерской ситуацией, а не способом зачатия. Подтверждается это огромным числом детей, старшим из которых уже около 10 лет, родившихся после «криобеременностей».

Такая же ситуация и со здоровьем детей, рожденных после этой процедуры. Они ничем не отличаются от сверстников, рожденных после обычной половой жизни родителей — ни по физическому, ни по ментальному развитию, ни по частоте пороков развития. Единственное, такие дети чаще попадают на прием к врачам, но не потому, что чаще болеют, а потому, что родители, которым дети достались очень нелегко, при первом же «чихе» ребенка немедленно обращаются к врачам и это, наверное правильно.

Преимущества криоконсервации ооцитов

Криоконсервация яйцеклеток имеет ряд преимуществ как этического так физиологического характера:

1. Женщина может заморозить свои молодые яйцеклетки, а родить ребенка уже в более зрелом возрасте. Можно сказать, что яйцеклетки с годами теряют свое качество. И в 20 лет у женщины гораздо больше шансов родить здорового малыша, нежели чем в 35−40.

2. Есть смысл криоконсервировать ооциты по медицинским показаниям. Например, онкобольным перед проведением химиотерапии, женщинам, страдающим от эндометриоза (заболевание вызывающее дисфункцию яичников).

3. Рационально использовать такую заморозку в цикле ЭКО. После стимуляции овуляции у женщины может созреть до 15 яйцеклеток, в то время как внедрить в матку можно только два эмбриона. Остальные же можно оставить на случай невынашивания беременности или же если возникнет желание родить еще одного ребенка. Криоконсервация яйцеклетки обойдется дешевле и безопасней для женщины, чем заново проводить процедуру стимуляции, пункции и так далее.

4. По этическим причинам заморозка яйцеклеток лучше криоконсервация готовых эмбрионов. В силу того, что по истечению времени в жизни людей многое меняется. Супруги могут расстаться или же еще возникает масса причин, по которым эмбрионы остаются невостребованными своими генетическими родителями. Это влечет за собой много проблем для медицинского центра, где хранятся замороженные эмбрионы, так как современное законодательство пока не предусматривает такие ситуации.

Согласно всему выше сказанному можно сделать выводы, что криоконсервация яйцеклеток достаточно прогрессивная методика в репродуктивной отрасли. Витрификация клеток дает возможность онкобольным женщинам ощутить радость материнства. Это отличный шанс для бездетных пар стать родителями даже не одного малыша. Также одиноким женщинам дарит надежду в будущем стать матерью здорового ребеночка. биоинженерия криоконсервация экстракорпоральный клетка Согласно статистике, дети, рожденные с помощью криотехнологии, ничем не отличаются от зачатых обычным, естественным путем. Заморозка не увеличивает риск развития врожденных патологий. Наоборот, можно отметить тенденцию естественного отбора, так как после процесса охлаждения-оттаивания выживают только качественные ооциты.

Экстракорпоральное оплодотворение как метод биоинженерии

Экстракорпоральное оплодотворение (от лат. extra — снаружи, вне и лат. corpus — тело, то есть оплодотворение вне тела, сокр. ЭКОм) — вспомогательная репродуктивная технология, используемая в случае бесплодия. Синонимы: «оплодотворение в пробирке», «оплодотворение in vitro», «искусственное оплодотворение».

Во время ЭКО яйцеклетку извлекают из организма женщины и оплодотворяют искусственно в условиях «in vitro» («в пробирке»), полученный эмбрион содержат в условиях инкубатора, где он развивается в течение 2—5 дней, после чего эмбрион переносят в полость матки для дальнейшего развития. Показанием к проведению процедуры ЭКО являются различные формы мужского и женского бесплодия. Согласно приказу № 67 Минздрава РФ показанием к ЭКО является — «бесплодие, не поддающееся терапии, или вероятность преодоления которого с помощью ЭКО выше, чем другими методами». При отсутствии противопоказаний ЭКО может проводиться по желанию супружеской пары (женщины, не состоящей в браке) при любой форме бесплодия".

Противопоказаниями для проведения ЭКО являются состояния женщины, при которых беременность и роды угрожают здоровью матери или ребёнка, а именно:

— соматические и психические заболевания, являющиеся противопоказаниями для вынашивания беременности и родов;

— врожденные пороки развития или приобретенные деформации полости матки, при которых невозможна имплантация эмбрионов или вынашивание беременности;

— опухоли яичников;

— доброкачественные опухоли матки, требующие оперативного лечения;

— острые воспалительные заболевания любой локализации;

— злокачественные новообразования любой локализации, в том числе в анамнезе.

Противопоказания для проведения ЭКО со стороны мужчины отсутствуют. Технологию ЭКО осуществляют в специализированных медицинских учреждениях в условиях амбулаторного лечения. Для проведения процедуры экстракорпорального оплодотворения необходимо получить яйцеклетки, получить сперматозоиды, провести оплодотворение in vitro, вырастить эмбрион, ввести эмбрион в полость матки женщины. Как правило, для экстракорпорального оплодотворения стараются получить несколько яйцеклеток, так как это повышает эффективность лечения бесплодия этим методом. Поскольку в норме у женщины в течение одного менструального цикла созревает одна яйцеклетка, то для получения нескольких яйцеклеток проводят так называемую процедуру «стимуляции суперовуляции». Для этого пациентке назначают инъекции гормональных препаратов.

Для стимуляции используют инъекции препаратов фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), лютеинизирующего гормона (ЛГ), хорионического гонадотропина (ХГ), в сочетании с агонистами или антагонистами гонадотропин-рилизинг гормона (ГнРГ). Режим введения определенных препаратов-индукторов суперовуляции называют «схемой стимуляции» или «протоколом». Существует несколько схем стимуляции суперовуляции, но окончательное количество, виды и длительность введения препаратов подбирают индивидуально для каждой женщины, в зависимости от ее возраста, причины бесплодия и фолликулярного (яичникового) резерва. Стимуляция суперовуляции может занимать от 7 до 20 дней и представляет собой инъекции или прием таблетированных препаратов.

Созревание яйцеклеток непосредственно не может быть определено неинвазивными методами. Поэтому о созревании яйцеклеток судят косвенно по ростуфолликулов яичника. Рост фолликулов наблюдают с помощью аппаратов ультразвукового исследования. При достижении доминантным фолликулом определенного размера (16−20 мм) назначают процедуру извлечения яйцеклеток — пункцию фолликулов яичника. Пункцию фолликулов проводят под общей (чаще) или местной (реже) анестезией, иглу проводят трансвагинально, ход иглы контролируют аппаратом УЗИ. Целью пункции является аспирация (отсасывание) содержимого фолликула (фолликулярной жидкости). Полученную жидкость исследуют с помощью микроскопа для обнаружения ооцитов (яйцеклеток).

Полученные ооциты отмывают от фолликулярной жидкости и переносят в чашки Петри, содержащие культуральную среду, которые помещают в инкубаторы до момента добавления подготовленных сперматозоидов.

Обычно использование гормональных препаратов и проведение пункции фолликулов не вызывает негативных реакций у пациентки, но иногда могут возникнуть осложнения. Осложнением стимуляции суперовуляции является синдром гиперстимуляции яичников (СГЯ), который может развиться вот время и спустя несколько дней после окончания стимуляции в результате созревания большого количества фолликулов. Пункция фолликулов может осложниться наружным или внутренним кровотечением.

При невозможности получить яйцеклетки у пациентки (отсутствие яичников, менопауза и пр.) возможно использование донорских яйцеклеток (то есть яйцеклеток другой женщины). В качестве донора яйцеклеток может выступать бескорыстный донор (родственница, знакомая) или платный донор. Условия работы с донором яйцеклеток регламентирует приказ N107Н Минздрава РФ.

Оплодотворение in vitro в биоинженерии

Непосредственно ЭКО проводится врачами-эмбриологами в условиях эмбриологической лаборатории. Собственно оплодотворение проводят одним из двух способов:

1) инсеминация in vitro;

2) интрацитоплазматическая инъекция сперматозоидов (ICSI, ИКСИ).

При первом, более простом способе к яйцеклеткам, которые находятся в питательной среде, добавляют суспензиюсперматозоидов. Сперматозоиды добавляют из расчета 100—200 тыс. на одну яйцеклетку. В течение 2—3 часов один из сперматозоидов проникает в яйцеклетку и тем самым оплодотворяет её. При втором способе (ИКСИ) сперматозоид вводят в яйцеклетку «вручную» с помощью микрохирургических инструментов. ИКСИ используют при очень плохом качестве спермы, когда оплодотворение не может быть получено даже в чашке.

После проникновения сперматозоида яйцеклетка считается эмбрионом. Вероятность успешного оплодотворения 60—70%. Эмбрионы содержат в искусственных условиях от 2 до 6 дней. Для этого используют так называемые СО₂-инкубаторы — шкафы, в которых поддерживается температура 37 °C и содержание СО₂ в атмосфере 5—6%. Эмбрионы (а до этого яйцеклетки) в инкубаторах непосредственно содержат в пластиковых чашках (чашки Петри, чашки Нунка, планшеты и пр.) с культуральной средой. В культуральную среду для эмбрионов входят основные физиологические ионы (Na⁺, K⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, C^l-, CO^3- и т. д.), энергетические субстраты (глюкоза, пируват, лактат), аминокислоты, часто витамины и белки сыворотки крови. За время инкубации эмбрион человека практически не увеличивается в размере (первые 4 дня его размер 0,1 мм, на 5 день 0,15—0,2 мм), но количество клеток, его составляющих, возрастает многократно (1 день — 1 клетка; 2 день — 4 клетки; 3 день — 8 клеток; 4 день — от 10 до 20 клеток, 5 день — от 40 до 200 клеток). Перенос эмбриона в матку осуществляют через 2—5 дней после оплодотворения яйцеклетки. Процедура не требует анестезии (обезболивания) и выполняется на гинекологическом кресле в течение нескольких минут. Эмбрион переносят в матку, проводя через шейку матки специальный эластичный катетер. Согласно приказу № 67 Минздрава РФ в полость матки не рекомендуется переносить более 4 эмбрионов, чтобы избежать многоплодной беременности. Современная практика ЭКО в России такова, что обычно осуществляют перенос 2 эмбрионов. При невозможности вынашивания плода пациентка может прибегнуть к использованию суррогатной матери.

Заключение

На сегодняшний день в клиниках замораживают (криоконсервируют) половые клетки человека (сперматозоиды, ооциты), и эмбрионы на различных стадиях развития, полученных в результате программ ЭКО. Замораживают оставшиеся после переноса в «свежем» (то есть, стимулированном) цикле эмбрионы только хорошего качества, т.к. впоследствии они благополучно перенесут разморозку.

Замораживание спермы применяют в случаях: раковых заболеваний у мужчин с целью обеспечения запасов спермы до начала химиотерапии и последующего использования замороженного образца для получения здорового потомства, неуверенности наличия партнера во время сбора спермы для ЭКО — ситуация, характерная для иногородних пациентов, донорства, в случаях планированного отложенного отцовства. Возможно, в связи с заметным снижением мужской фертильности, запасание впрок спермы молодых мужчин будет популяризироваться.

Замораживание яйцеклеток применяют в случаях, когда стимуляция не рекомендуется или противопоказана (например, онкологические и др. заболевания) или же невозможно провести оплодотворение клеток в данный период. Зрелый ооцит (женская клетка) крайне хрупкий из-за большого размера, жидкого содержимого и расположения хромосом и во время процедур замораживания/размораживания легко повреждается. Частота родов после оплодотворения и инсеминации замороженных-размороженных ооцитов составляет 3−4%. С помощью криоконсервации решается проблема зачатия и бесплодия. Кроме лечения многих форм мужского и женского бесплодия, ВРТ используются и для решения проблем фундаментальной биологии и медицины. Используя не затребованные для имплантации эмбрионы, изучают механизмы оплодотворения и развития эмбриона, генетическую регуляцию эмбриогенеза, возможности преимплантационной диагностики наследственных заболеваний и другие проблемы. Сперму пациент получает самостоятельно с помощью мастурбации. Возможно использование прерванного коитуса, либо медицинского презерватива без смазки. В случае невозможности получения спермы путем эякуляции, используют хирургические методы: аспирация содержимого эпидидимиса, биопсия яичка и прочее. Сперму получают в день пункции фолликулов супруги. Если получение спермы в день пункции невозможно, то используют предварительное получение спермы с последующим замораживанием и хранением в жидком азоте. Перед оплодотворением яйцеклетки сперматозоиды отмывают от семенной жидкости и с помощью специальных методов выделяют наиболее качественные из них.

При невозможности использования спермы мужа или при отсутствии у пациентки полового партнёра, возможно использование спермы донора. Использование спермы донора производится при обязательном письменном согласии супруга и регламентируется приказом N107Н Минздрава РФ. Согласно этому приказу сперма донора используется после 6-тимесячного карантина, т. е. через 6 месяцев хранения в замороженном состоянии и повторного обследования донора, подтверждающего отсутствие инфекционных заболеваний.

Список использованных источников:

1. Б. Альбертс и др. Молекулярная биология клетки. 1994.

2. Н. С. Пушкарь, А. М. Белоус.

Введение

в криобиологию. 1975.

3. Луи Рэ. Консервация жизни холодом. М.: Медгиз, 1962. — 176 с