Разработка экспериментальных образцов новой лекарственной формы пробиотика Субтилак на основе бактерий видов Bacillus subtilis и Lactobaccilus plantarum для наружного применения и изучение их факрмакологических свойств в эксперименте

Актуальность проблемы.

С позиций медико-биологических наук здоровье — это нормальное психосоматическое состояние человека [1]. Одной из наиболее удачных, по нашему мнению, формулировок, определяющих здоровье, является следующая: «Здоровье — это состояние полного физического, духовного и социального благополучия, а не только отсутствие болезней или физических дефектов» [1, 28,287].

В настоящее время объективно наблюдается нарастание неблагоприятных социальных, экологических и других факторов, что существенно влияет на состояние здоровья населения и ухудшает эпидемическую ситуацию по ряду инфекционных заболеваний [20, 70, 75, 217].

По данным Центрального научно-исследовательского института Эпидемиологии Минздрава Российской Федерации. Существенно увеличилась не только общая инфекционная заболеваемость, но и количество инфекций, отличающихся вялотекущим, рецидивирующим и хроническим течением, одновременно возросло и число инфекционных поражений вызываемых условно-патогенными видами возбудителей [70, 71, 98, 211].

Все большую значимость в настоящее время приобретает проблема борьбы с местными воспалительными и гнойными заболеваниями. По данным некоторых авторов неудовлетворительные результаты лечения таких поражений существенно возросли [123, 152, 179].

Наметилась отчетливая тенденция снижения терапевтической эффективности многих противомикробных средств, особенно антибиотиков, что, значительно снижает эффективность лечения поражений, в частности кожных покровов, инфекционного генеза. В настоящее время целесообразным представляется использование для лечения инфекционных заболеваний препаратов на основе живых пробиотических бактерий.

1, ¦ ¦, • 5 .- ' 8.

Пробиотики считаются наиболее распространенными и эффективными средствами для поддержания микроэкологии человека на оптимальном уровне и ее коррекции.

Пробиотики относятся к группе медицинских иммунобиологических препаратов, на основе живых бактерий, антагонистически активных в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов — возбудителей различных инфекционных заболеваний и не оказывающих отрицательного, I. влияния на представителей нормальной микрофлоры. человека [98, 185, 211].

I Пробиотики, как новый класс лечебно-профилактических препаратов,. 1 в настоящее время находят все большее применение в медицинской практи-> ке и показания к их назначению все больше расширяются [98, 173, 134, 135].

Как правило, пробиотические препараты, используются для профилактикии леченияюстрых кишечных инфекций и дисбактериозов [98]. Отметим также, что подобная терапия сопровождается, как правило, и позитивными сдвигами — в системе неспецифической защиты организма и приводит к повышению сопротивляемости организма к воздействию неблагоприятных факторов [51, 98, 99- 227]. Наиболее распространены такие препараты как ацилакт, бактисубтил, биоспорин, бифидумбактерин, бификол, колибактерин, колифлорал, лактобактерин, севакол, флонивин и др. ] В тоже время нам известна только лишь одна работа, в которой про.

К ' !, '. ' ' ' биотик и, В! частности, биоспорин использовали для лечения инфекционных поражений кожных покровов и слизистых оболочек у сельскохозяйственных.

I животных [224].

Как уже было отмечено выше, существенное место в инфекционной патологии людей занимают гнойно-воспалительные: заболевания кожных покровов и слизистых оболочек [129, 147], которые чаще всего развиваются в результате их травматических повреждений (раны, ожоги). Лечение подоб-| ных повреждений антибиотиками и другими традиционными средствами далеко не всегда бывает эффективным, поэтому задача борьбы с воспалительными заболеваниями наружных покровов в настоящее время является актуальной и требует новых решений.

Данное обстоятельство послужило основанием для проведения теоретических и экспериментальных исследований по оценке возможности разработки новых фармакологических препаратов для наружного применения на основе уже известных пробиотиков и современных трансдермальных основ. В качестве пробиотического средства нами был выбран и предложен Субти-лакт, как один из новых и сравнительно более эффективных (в частности по величине антагонистической активности) пробиотиков. Биологический компонент данного препарата представлен культурами двух видов микроорганизмов бактериальной природы: Bacillus subtilis и Lactobacillus plantarum, безвредных для человека.

Специфическое лечебное и профилактическое действие В. subtilis и L. plantarum обеспечивается различными биологически активными веществами, такими как протеины, ферменты, антибиотики, витамины и другие, являющимися продуктами метаболизма этих бактерий при их росте, развитии и размножении [186]. Следует отметить, что применяемые в настоящее время пробиотические препараты, как правило, обезвожены (сухие), и бактериальные клетки в них находятся в анабиотическом состоянии. Продуцируемые микроорганизмами биологически активные вещества в этом случае неактивны и не способны проникать в глубокие слои кожи. Жидкие формы пробиотиков, в свою очередь неудобны для наружного применения, поскольку быстро теряют свою специфическую активность. Жировые основы, в случае использования их при создании лекарственных форм для накожного применения также не обеспечивают оптимальных условий для жизнедеятельности клеток, поэтому пробиотики, в этом случае, своего максимального лечебного действия реализовать не в состоянии [32,191]. В тоже время гидрофильные основы, используемые для создания мягких лекарственных форм, обеспечивают более благоприятные условия для прорастания спор, размножения вегетативных клеток, действия ферментов и комплекса биологически активных веществ. Этим требованиям хорошо соответствуют такие современные гелевые препараты как эфтидерм, тизоль, и кремнийорганические соединения, которые обладают способностями активно проникать через кожу, ускорять в ней репаративные процессы, уменьшать явления отечности, инфильтрации, индурации и т. д. [66, 72, 77, 185].

Таким образом, задача использования гидрофильных транскутанных основ для создания новых, на основе пробиотических бактерий, лекарственных форм, применяемых для лечения инфекционных и травматических поражений кожи остается актуальной и до настоящего времени не разработанной.

Цель настоящей работы — теоретическое и экспериментальное обоснование возможности создания новых экспериментальных образцов пробиотических гелей для наружного применения на основе бактерий видов Bacillus subtilis и Lactobacillus plantarum и транскутанных проводников.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить биологические свойства штаммов Bacillus subtilis 3 и Lactobac-tirium plantarum 8P-A3 для обоснования механизмов их специфического действия в составе экспериментальных образцов гелевых пробиотических препаратов.

2. Обосновать возможность использования эфтидерма, тизоля и кремний-органического глицерогидрогеля (KIT) в качестве основ для создания экспериментальных образцов пробиотических препаратов для наружного применения.

3. Провести экспериментальные исследования по разработке оптимального компонентного состава экспериментальных образцов препаратов на основе эфтидерма, тизоля, КГГ.

4. Провести доклинические испытания разработанных образцов препаратов для наружного применения.

5. Изучить распределение биокомпонентов предлагаемых гелевых пробио-тических препаратов в организме лабораторных животных. Научная новизна. Теоретически и экспериментально доказана возможность создания медицинских пробиотических препаратов для наружного применения. Обоснован компонентный состав экспериментальных образцов пробиотических гелевых препаратов.

Впервые создано три экспериментальных образца пробиотических препаратов на основе эфтидерма, тизоля и КГТ. Экспериментально доказана эффективность предлагаемых гелевых форм пробиотика Субтилакт в отношении таких возбудителей, как стафилококки, стрептококки, синегнойная палочка, грибы рода Candida. Показано иммуномодулирующее действие предлагаемых образцов. В условиях экспериментального моделирования инфекционного, ожогового и травматического процессов на лабораторных животных подтверждена высокая терапевтическая эффективность разработанных препаратов для лечения данных состояний, в том числе, осложненных гнойным процессом. ,.

Практическая значимость работы. Разработана лабораторная технология получения новых лекарственных форм пробиотических препаратов для наружного применения на основе глубинных культур бактерий видов В. subtilis и L. plantarum и трех видов транскутанных проводников. По результатам выполненных исследований разработаны: 1. Сборник лабораторных методик по выделению, изучению биологических свойств и поддержанию в жизнеспособном и активном состоянии культур В. subtilis и L. plantarum- 2. Регламент по производству пробиотического геля-S- 3. Инструкция по применению пробиотического геля-S- 4. Фармакопейная статья предприятия (проект) — 5. Подана заявка на получение патента (регистр, номер 2 005 128 423/13). Результаты исследований внедрены в учебный процесс для студентов фармацевтического, лечебно-профилактического, педиатрического, медико-профилактического и стоматологического факультетов. Данные, полученные в ходе диссертационной работы, внедрены в научно-исследовательскую деятельность кафедры фармакологии ГОУ ВПО УГМА Росздрава и Центра ВТП БЗ РФ НИИ Микробиологии.

Разработанные новые экспериментальные образцы медицинских препаратов, содержащие пробиотик в гелевых основах транскутанного действия (эфтидерм, тизоль, КГГ) уже на доклиническом этапе экспериментальных исследований показали высокую терапевтическую эффективность при лечении инфицированных ран, в том числе гнойных, ожогов, механической травмы кожных покровов. Есть все основания полагать, что по результатам клинических испытаний, данные препараты могут быть рекомендованы для использования в практическом здравоохранении.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Гелевые формы транскутанных проводников (тизоль, эфтидерм, КГГ) в сочетании с пробиотиком Субтилакт, являются новыми эффективными лекарственными средствами для наружного применения.

2. Лечебный эффект, предлагаемых экспериментальных препаратов, обеспечивается высокой антагонистической активностью пробиотических бактерий штаммов Bacillus subtilis 3 и Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ в отношении различных видов патогенных и условно-патогенных возбудителей инфекционных заболеванийкомплексом, продуцируемых ими биологически активных веществ, иммуномодулирующими свойствами и специфическим действием выбранных чрезкожных проводников.

3. Разработанные и изученные в эксперименте гелевые пробиотические препараты могут быть рекомендованы для лечения больных при инфекционных и травматических повреждениях кожных покровов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 2 работы в реферируемых ВАКом изданиях.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Российской научно-практической конференции «Рациональное использование лекарств» (Москва, 10−12 марта 2004) — на IV-й международной научно-практической конференции «Клинические исследования лекарственных 13 ¦ средств» (Москва, 2004) — на юбилейной научно-практической конференции,-посвященной 55-летию образования Центра ВТП БЗ НИИ микробиологии МО РФ «Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Эпидемиология и эпизоотологияМикробиология. Биотехнология. Экология.» (Екатеринбург, 2004) — на 58-й, 59-й, 60-й, 61.-й межвузовских научно-практических конференциях «Актуальные: вопросы современной медицинской науки и здравоохранения» (Екатеринбург, 2003, 2004,.

2005, 2006) — Материалы диссертации опубликованы в Вестнике Уральской-медицинской академическойнауки (Екатеринбург, 2006; -Вып.1) — в Вестнике Уральской государственной медицинской академии (Екатеринбург,.

2006. -Вып. 15) — в Химико-фармацевтическом журнале (Москва, 2006. —№ 5) Объем и структура диссертации. Диссертация составлена по общепринятой структуре и состоит из введения, аналитического обзора литературы, главы о материалах и методах исследований, главы экспериментальных исследованийобсуждения, результатов, заключения, выводовпрктиче-ских рекомендаций и списка использованных источников литературы. Диссертация изложена на 221 страницах, содержит 47 таблиц и 18 рисунков^;

ВЫВОДЫ.

1. В результате выполненных исследований разработаны с использованием пробиотика Субтилакт на основе бактерий Bacillus subtilis и Lactobacillus plantarum и трех видов транскутанных проводников (тизоля, эфтидерма и кремнийорганического глицерогидрогеля) новые перспективные мягкие лекарственные формы, предназначенные для лечения инфекционных и травматических повреждений кожных покровов.

2. На различные сроки наблюдения (1,3,6 и 12 месяцев) установлено in vitro сохранение культурально-морфологических, биохимических свойств и антагонистической активности Bacillus subtilis и Lactobacillus plantarum в гелевых основах (тизоле, эфтидерме и КГГ), которые не отличаются от аналогичных показателей для исходного пробиотика.

3. Экспериментально подтвержден высокий уровень антагонистической активности изучаемых образцов экспериментальных препаратов в отношении различных представителей патогенной и условно-патогенной микрофлоры: золотистого стафилококка, пиогенного стрептококка, синегнойной палочки, протея, грибов рода Candida.

4. На моделях локальных инфекционных заболеваний кожных покровов выявлена высокая терапевтическая эффективность Субтилакта в гелевых основах при инфекциях, вызванных золотистым стафилококком, пиогенным стрептококком, синегнойной палочкой, протеем, грибами рода Candidaа на моделях травматических повреждений кожи (раны, термические ожоги I и II степени) установлено, хорошее ранозаживляющее и противоожоговое действие изучаемых препаратов с более выраженным эффектом у Субтилакта в сочетании с КГГ.

5. Показано, что лечебный эффект при местном применении разработанных препаратов сопровождается их значимым влиянием на различные факторы клеточного и гуморального иммунитета, что выражалось в стимуляции фагоцитоза, повышении концентрации ЦИК, увеличении количества иммуноглобулинов А, Е, G, М и си-интерферона, активности Ти В-клеточного звена иммунитета. 6. Установлено, что при наружном применении исследуемых препаратов пробиотические бактериальные клетки Bacillus subtilis способны диссеми-нировать в паренхиматозные органы (печень, селезенку, лимфатические узлы) экспериментальных животных и персистировать в них в течение 714 суток (после чего они полностью элиминируются из организма).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

Разработаны для наружного применения на гелевых основах (тизоле, эфтидерме и кремнийорганическом глицерогидрогеле) и изучены мягкие лекарственные формы, содержащие Субтилакт. После получения разрешения в Фармакологическом комитете планируется проведение клинических испытаний, по результатам которых гелевые пробиотические препараты могут быть рекомендованы для использования в практическом здравоохранении для лечения больных с инфекционными поражениями кожных покровов и в терапии травматических и ожоговых поражений. Результаты теоретических и экспериментальных исследований реализованы разработкой: 1. Сборника лабораторных методик по выделению, изучению биологических свойств и поддержанию в жизнеспособном и активном состоянии культур В. зиЫШэ и Ь. р1ап1агит- 2. Регламента по производству пробиотического геля-8- 3. Инструкцией по применению пробиотического геля-Б- 4. Фармакопейной статьей предприятия (проект) — 5. Подачей заявки на патентование предлагаемого изобретения.