Влияние оксида азота и гипоксического прекондиционирования на устойчивость крыс линии КМ к звуковому стрессу

Актуальность проблемы. Интерес к оксиду азота (N0) в большой степени обусловлен разнообразием и неоднозначностью его функций в организме. Этот свободный радикал играет важную роль в регуляции мозгового кровотока и в метаболизме клеток головного мозга (Реутов В.П., 1995; Горрен А.К.Ф. et. al., 1998; Iadecola С., 1997; Манухина Е. Б. и др., 2000, Khaldi A.A. et. al., 2001). Однако до сих пор не совсем понятно влияние оксида азота на развитие, течение и исход острых нарушений церебральной гемодинамики. В последних обзорных статьях (Guix F.X. et al., 2005; Мого М. А. et al, 2005) отмечается, что многие авторы рассматривают активацию системы оксида азота как один из патогенетических факторов при развитии инсульта, другие исследователи, наоборот, отмечают его протекторную роль.

Под влиянием работ отечественных ученых — Н. Н. Сиротинина, Ф. З. Меерсона, Н. А. Агаджаняна, Р. Б. Стрелкова, А. Я. Чижова, Л. Д. Лукьяновой сложилось представление о том, что адаптация к умеренной гипоксии неспецифически повышает резистентность организма к широкому спектру неблагоприятных воздействий. Нами впервые установлено, что адаптация в условиях реального высокогорья, длительная адаптация к барокамерной или интервальной нормобарической гипоксии повышают устойчивость к стрессу крыс линии Крушинского-Молодкиной (КМ), генетически предрасположенных к аудиогенной эпилепсии (Кошелев и др., 1998, 2001, 2004). Оказывает ли подобный защитный эффект кратковременное гипоксическое прекондиционирование — ответ на этот вопрос, важный как с теоретической, так и с практической точки зрения, будет получен в настоящей работе.

Известно, что при адаптации организма к дефициту кислорода происходит увеличение продукции оксида азота (Манухина и др., 2004, 2005). Является ли активация системы оксида азота одним из ключевых звеньев протекторного влияния гипоксической тренировки на крыс линии КМ, -ответа на этот вопрос пока не было. В работах ряда авторов (Millar Т.М. et. al.,.

1997; Zweier J.L. et. al., 1999; Godber B.LJ. et. al., 2000; Li H. et. al., 2003) отмечено увеличение активности нитратредуктаз и нитритредуктаз при нарушениях мозгового кровообращения, сопровождаемых явлениями ишемии/гипоксии. Эти ферменты могут восстанавливать ионы NO3″ в оксид азота по цепи трансформаций N03″ -> N02″ -> NO (Lundberg J.О. et. al., 2004; Martin H.M. et. al., 2004; van Dalen C.J. et. al., 2004; Gladwin M. T, 2005; Klebanoff S.J. et. al., 2005). В этой связи изучение эффектов NO-генерирующих соединений на оригинальной модели нарушений мозгового кровообращения геморрагического типа представляется актуальным.

В соответствие с вышеизложенным, были поставлены следующие цели и задачи исследования.

Цель исследования:

Исследовать влияние оксида азота и гипоксического прекондиционирования на формирование устойчивости крыс линии КМ к звуковому стрессу.

Задачи исследования:

1. Определить изменение уровня NO в крови крыс линии КМ после внутрибрюшинного введения NO-генерирующего соединения нитрита натрия и неселективного блокатора NO-синтаз L-NNA.

2. Изучить влияние ингибитора NO-синтаз L-NNA, L-аргинина и NO-генерирующих соединений нитрита натрия (NaN02) и нитрата натрия (NaNOs) на устойчивость крыс линии КМ к звуковому стрессу.

3. Исследовать изменение уровня NO в крови у крыс линии КМ после гипоксического прекондиционирования.

4. Проанализировать роль NO-эргических механизмов в реализации защитного эффекта гипоксического прекондиционирования.

Научная новизна: впервые на модели геморрагического инсульта, показано, что гипоксическое прекондиционирование животных приводит к повышению уровня оксида азота в крови и устойчивости крыс линии КМ к звуковому стрессу. В ходе эксперимента на модели аудиогенного эпилептиморфного припадка впервые было установлено дозозависимое влияние NaN02 на развитие неврологического дефицита у крыс линии КМ в условиях акустического стресса. Было выявлено, что в низких концентрациях NaN02 оказывает защитное действие, а в высоких дозах, наоборот, увеличивает повреждающий эффект звукового стресса. Наряду с нитритом натрия было исследовано влияние NaNCb. Было показано, что нитрат натрия, как и нитрит натрия, оказывает значительное протекторное влияние на устойчивость крыс линии КМ к сильному звуковому раздражению. Также было определено, что неселективный блокатор NO-синтаз L-NNA проявляет дозозависимое увеличение стрессорных повреждений у крыс линии КМ (смертность, двигательные нарушения, внутричерепные кровоизлияния), возникающих в результате аудиогенного воздействия. Было исследовано изменение уровня N0 в крови у крыс линии КМ после гипоксического прекондиционирования и проанализирована роль N0 в протекторном эффекте гипобарической адаптации. Данные исследования показали, что помимо NO-синтазного пути существует не NO-синтазный механизм образования N0, а именно: нитритредуктазный и нитратредуктазный, осуществляемые различными ферментами, как самого организма, так и энзимами симбиотических микроорганизмов млекопитающих (в основном желудочно-кишечного тракта).

Полученные данные свидетельствуют о том, что оксид азота может выполнять функцию антистрессорного физиологически активного вещества в организме крыс линии КМ в условиях звукового стресса.

Теоретическое значение. Проведенное исследование вносит вклад в чрезвычайно важную проблему повышения резистивности организма к неблагоприятным воздействиям, путем мобилизации его резервных возможностей, а именно: адаптацией к гипоксии. Полученные данные в ходе экспериментов по адаптации животных к гипоксии свидетельствуют об участии N0 в механизмах, которые лежат в основе защитного эффекта кратковременной гипоксической тренировки у животных, подвергнутых акустическому стрессу. Результаты, полученные в опытах с нитритами и нитратами, показывают, что нитритредуктазный и нитратредуктазный пути являются альтернативными источниками синтеза N0. Эти не NO-синтазные реакции могут оказывать значительное влияние на уровень неврологического дефицита и исход геморрагического инсульта у крыс линии КМ в условиях звукового стресса.

Практическое значение. Результаты исследования позволяют предположить возможность коррекции нарушений мозгового кровообращения геморрагического типа путем использования сеансов гипоксического прекондиционирования различных режимов. Снижение смертности и тяжести нарушений движений при применении малых доз нитрита натрия и нитрата натрия на модели геморрагического инсульта открывает возможности для поиска и разработки новых средств коррекции подобных расстройств. Данные о влиянии L-аргинина на развитие неврологического дефицита у крыс линии КМ, подвергнутых звуковому стрессу, могут служить основанием для проведения экспериментальных исследований эффективности подобных препаратов для лечения нарушений мозгового кровообращения геморрагического типа.

Таким образом, актуальность и перспективность исследования влияния экзогенных и эндогенных источников N0 на исход геморрагического инсульта, а также использование различных режимов кратковременной адаптации к гипоксии, повышающих устойчивость тканей головного мозга к неблагоприятным факторам за счет индукции эндогенных источников N0 не вызывает сомнений и представляет интерес как для фундаментальной физиологии, так и для практической медицины.

выводы.

NO-генерирующее соединение нитрит натрия повышает, а неселективный блокатор NO-синтаз L-NNA снижает уровень N0 в крови.

NO-генерирующие соединения нитрит натрия (NaN02) в дозе 5мг/кг и нитрат натрия (№Ж)з) в дозе 50мг/кг увеличивают устойчивость крыс линии КМ к звуковому стрессу. Нитрит натрия в дозе 50мг/кг снижает устойчивость крыс линии КМ к звуковому стрессу.

Ингибирование NO-синтаз неселективным блокатором L-NNA приводит к увеличению смертности и выраженности внутричерепных кровоизлияний у крыс линии КМ, подвергнутых звуковому стрессу.

Введение

L-аргинина, напротив, повышает устойчивость крыс линии КМ к акустическому стрессу.

Гипоксическое прекондиционирование приводит к увеличению концентрации N0 в плазме крови и повышает устойчивость крыс линии КМ к акустическому стрессу.

Защитный эффект гипоксического прекондиционирования нивелируется неселективным блокатором NO-синтаз — L-NNA.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Известно, что оксид азота является одним из наиболее важных биологических медиаторов, играющих значительную роль в регуляции мозгового кровотока в норме и патологии. Ишемические и гипоксические процессы, вызванные стрессом и сосудистыми нарушениями мозга, тесно связаны с NO-эргической системой. Так, при инсульте, одном из самых распространенных и тяжелых заболеваний, оксид азота может оказывать как протекторное влияние, так и усиливать повреждения тканей мозга. В настоящее время хорошо изучен биосинтез N0 с помощью NO-синтаз. Но в последнее время большое количество публикаций свидетельствует о том, что в условиях ишемии и гипоксии, когда образование N0 с помощью NO-синтаз нарушено, оксид азота может образовываться не NO-синтазным способом нитритредуктазами и нитратредуктазами из нитритов и нитратов (Реутов В.П., 1995; van Dalen C.J., 2000; Martin Н.М., 2004).

При этом известно, что жесткая гипоксия приводит к чрезмерному повышению NO, что, в свою очередь, усиливает ишемические повреждения тканей мозга (Klatt P. et. al., 1999; Liu Р.К. et. al., 2002). В то же время длительная адаптация к гипоксии (умеренная гипоксия) повышает устойчивость организма к неблагоприятным факторам и увеличивает синтез оксида азота (Крушинский А.Л., 1989; Кошелев В. Б., 2000; Чижов, А .Я., 2002; Лукьянова Л. Д., 2004 Malyshev I. Yu., 1998; Manukhina Е.В., 2000). Обнаружено, что увеличение синтеза оксида азота происходит и при кратковременном гипоксическом прекондиционировании (Самойлов О.М., 2004; Сазонтова Т. Г., 2004), однако, приводит ли это к повышению устойчивости организма к острым нарушениям гемодинамики, было неясно. Поэтому в данной работе исследовалось влияние как самого оксида азота, так и гипоксического прекондиционирования на формирование устойчивости крыс линии КМ к звуковому стрессу.

В первой серии экспериментов на модели аудиогенного эпилептиформного припадка — крысах линии КМ мы исследовали влияние NO-генерирующих соединений NaN02 и NaNC^. Известно, что в низких дозах NaN02 проявляет ангиопротекторные свойства, а в высоких — приводит к гемической гипоксии (Титов В.Ю. и др., 1996; Реутов В. П., 1995; Coleman M.D. et. al., 1996; Gow A J. et. al., 1998). Проведенные нами исследования показали, что NO-генерирующее соединение нитрит натрия в концентрации 5мг/кг оказал защитное действие, а в дозе 50мг/кг отрицательное влияние на устойчивость крыс линии КМ, подвергнутых звуковому стрессу. В отличие от нитрита натрия (NaN02) нитрат натрия (NaNCb) в дозе 50мг/кг увеличивал устойчивость животных к аудиогенному стрессу, в дозе 5мг/кг не оказал влияния на исследуемые параметры.

Исследование влияния NO-генерирующего соединения нитрита натрия (NaN02 5мг/кг) на концентрацию оксида азота в крови у крыс линии КМ в условиях акустического стресса показало, что у животных, которые получали нитрит натрия, произошло повышение интенсивности сигнала ЭПР Hb-NO комплексов с 15,2 + 3,1 отн. ед. (контроль) до 192,7 + 8,3 отн. ед. (относительных единиц ЭПР-сигнала), р<0,001. Таким образом, полученные нами данные показывают, что не NO-синтазный путь генерации N0 может приводить к изменению уровня оксида азота в крови и повышению устойчивости крыс линии КМ к звуковому стрессу.

Большинство ангиопротекторных свойств L-аргинин осуществляет через ферментативную активность эндотелиальной изоформы NO-синтазы (eNOS), которая синтезирует оксид азота и тем самым оказывает влияние на гемодинамику в организме (Реутов В.П., 1995; Каменский А. А. и др., 2002; Moncada S. et. al., 1993). Исследование влияния субстрата NO-синтазы L-аргинина в дозе 200мг/кг на устойчивость крыс линии КМ к звуковому стрессу, показало, что L-аргинин оказал защитный эффект на устойчивость животных к звуковому стрессу. Данный эксперимент показал, что N0-синтазная генерация N0 приводит к снижению стрессорных повреждений.

Из приведенных экспериментов видно, что как NO-синтазный, так и не NO-синтазный пути могут снижать стрессорные повреждения у крыс линии КМ. При этом возникает вопрос. Может ли не NO-синтазный путь генерации N0 компенсировать дефицит N0 в условиях, когда NO-синтазное звено по каким-либо причинам не работает? Например, во время нарушения мозгового кровотока или жесткой гипоксии. Поэтому в следующем эксперименте мы исследовали взаимосвязь между этими двумя звеньями.

Поскольку результаты предыдущих опытов показали, что дефицит N0 приводит к снижению устойчивости крыс к звуковому стрессу, а устранение дефицита N0, наоборот, повышает его, то мы предположили, что блокирование NO-синтаз ингибитором L-NNA должно привести к повышению стрессорных повреждений у крыс, а введение NO-генерирующего соединения NaN02 должно снизить их. То есть в условиях блокады NO-синтаз нитритредуктазы должны устранить дефицит N0.

Действительно, результаты ЭПР-анализа показали, что блокатор NO-синтазы L-NNA в дозе 25 мг/кг снизил уровень оксида азота в крови крыс линии КМ в 2,5 раза: с 15,2±3,1 отн. ед. (контроль) до 6,0 ± 2,5 отн. ед., р<0,05. При этом анализ устойчивости крыс линии КМ к звуковому стрессу показал, что блокатор NO-синтаз L-NNA во всех изученных дозах (2,5мг/кг, 25мг/кг и 25мг/кг) увеличивал стрессорные повреждения у крыс линии КМ, а ведение NO-генерирующего соединения нитрит натрия (NaN02) в дозе 5мг/кг снижало отрицательный эффект L-NNA.

Таким образом, наше предположение о том, что блокатор NO-синтаз L-NNA приводит к снижению устойчивости крыс линии КМ к звуковому стрессу, а нитрит натрия уменьшает отрицательное влияние L-NNA, подтвердилось. Полученные данные позволяют предполагать, что не N0синтазный путь образования N0 может компенсировать дефицит N0, вызванный ингибированием NO-синтаз.

Во второй части нашей работы на модели гипоксического прекондиционирования мы также исследовали взаимосвязь между этими двумя звеньями NO-эргической системы. Исследование влияния гипоксического прекондиционирования и блокатора NO-синтазы L-NNA (25мг/кг) на уровень оксида азота в крови у крыс линии КМ в условиях акустического стресса показало, что они действуют противоположно. Блокатор NO-синтазы L-NNA (25мг/кг) снижал уровень N0 в крови крыс линии КМ в 2,5 раза, а гипоксическое прекондиционирование, наоборот, увеличивало его в 2,1 раза.

Анализ устойчивости крыс линии КМ к звуковому стрессу показал, что блокатор NO-синтаз L-NNA в дозе 25мг/кг увеличивал стрессорные повреждения у крыс линии КМ, а гипоксическое прекондиционирование снижало отрицательный эффект L-NNA. Причем протекторное влияние гипоксического прекондиционирования было выявлено как в нормобарическом, так и в гипобарическом режимах. Таким образом, полученные результаты показывают, что оксид азота принимает участие в защитных механизмах кратковременной гипоксической тренировки.

В целом, проведенные эксперименты, в совокупности с немногочисленными данными литературы, позволяют предполагать, что помимо NO-синтазного пути существует не NO-синтазный механизм образования N0, а именно: нитритредуктазный и нитратредуктазный, осуществляемые различными ферментами, как самого организма, так и энзимами симбиотических микроорганизмов млекопитающих, в основном желудочно-кишечного тракта (Roediger W.E., 1998; Miyoshi М., 2003; Lundberg J.O., 2004). Как показано в настоящее время, особое значение синтез N0 из нитратов и нитритов имеет во время ишемии и гипоксии, то есть в условиях дефицита кислорода. Полагают, что в этих условиях ферментативный синтез N0 значительно ограничен из-за уменьшения поступления кислорода, который, как и L-аргинин является субстратом этих ферментов (McKnight G.M., 1997; Millar Т.М., 1998; Li Н., 2004; Gladwin М.Т., 2005).