Восьмигемовые нитритредуктазы из галоалкалофильных бактерий рода Thioalkalivibrio: каталитические свойства, структура, механизм адаптации

Мультигемовые цитохромы с широко распространены в прокариотических организмах и выполняют в них разнообразные функции, связанные с переносом электронов в окислительно-восстановительных реакциях. Эти белки обеспечивают превращение различных субстратов в энергетическом и пластическом обмене клетки, участвуют в создании трансмембранного протонного градиента, сопряженного с синтезом АТФ, выполняют защитную функцию, превращая токсичные продукты деятельности организма в безопасные и легко удаляемые из клетки вещества.

Пятигемовые цитохром с нитритредуктазы (ЪМА), осуществляющие респираторную аммонификацию нитрита, были выделены из многих групп бактерий, где они являются конечным звеном в процессе создания трансмембранного протонного градиента. Также эти белки участвуют в детоксикации клетки при накоплении в ней нитрита, гидроксиламина, оксида азота и пероксида водорода. Все выделенные и охарактеризованные аммонифицирующие нитритредуктазы являются высокогомологичными и обладают набором специфических признаков, позволяющих объединить их в отдельное семейство. К этим признакам относятся наличие пяти гемов с на мономер белка, присутствие в аминокислотной последовательности мотива СххСК, связывающего каталитический гем, высокая консервативность остатков, образующих активный центр и каналы транспорта субстрата и продукта реакции, образование димерной формы с возможностью прямого переноса электронов между темами субъединиц.

Объектом настоящего исследования являются два гомологичных восьмигемовых цитохрома с, выделенные из близкородственных хемотрофных галоалкалофильных гаммапротеобактерий рода ТЫоаШсйтЪпо. Многие черты этих белков, такие как строение каталитического домена, наличие гем-связывающего мотива СххСК, устройство активного центра, способность аммонифицировать нитрит с высокой эффективностью без высвобождения промежуточных продуктов, указывают на их родство с ранее описанными респираторными пятигемовыми цитохром с нитритредуктазами. Однако другие детали: содержание восьми гемов с на субъединицу белка, образование стабильного гексамера и связанная с ним уникальная схема транспорта продукта реакции, образование дополнительной связи Туг — Сув в активном центре, наличие уникального по структуре концевого домена позволяют выделить эти белки в отдельное семейство восьмигемовых нитритредуктаз. Помимо значительного сходства с №£А, оба белка имеют некоторые общие черты с другими восьмигемовыми оксидоредуктазами, осуществляющими, например, окисление гидроксиламина или восстановление тетратионата. Согласно современным представлениям, эти группы эволюционно связаны друг с другом и происходят от пятигемовых нитритредуктаз. Восьмигемовые нитритредуктазы, по-видимому, представляют переходное звено между данными семействами ферментов, соединяя в себе признаки, присущие разным группам.

В настоящее время, функции восьмигемовых нитритредуктаз в клетках ТЫоа1ка1тЬгю не установлены. Предположение об их участии в респираторном восстановлении нитрита опровергается тем фактом, что обе бактерии не способны использовать нитрит в качестве акцептора электронов в бескислородном дыхании. Так же представляется маловероятным участие белков в образовании аммония для клеточного синтеза, поскольку одна из двух бактерий не способна к росту на нитрите в качестве источника азота. Использование представителями рода ТЫоа1ка1тЬгю разнообразных соединений серы в качестве доноров электронов с промежуточным накоплением значительных количеств элементарной серы в периплазме^позволяет предположить участие данных белков в катаболизме серы. Также возможно их участие в детоксикации экзогенного нитрита, образующегося в бактериальных сообществах соленых щелочных озер.

Изучение восьмигемовых нитритредуктаз позволит установить связь пространственной организации ферментов, их природной функции, эволюцию семейств цитохром с оксидоредуктаз, выявить связи циклов серы и азота в пределах одного организма. Отдельный интерес представляет исследование механизмов адаптации белков к экстремальным природным условиям обитания организмов в соленых щелочных озерах, поскольку для галоалкалофилов этот вопрос практически не изучен. Структурно-функциональное исследование ферментов и белков из экстремофильных организмов, анализ механизмов адаптации на уровне первичной и пространственной структуры позволит создать теоретическую базу для конструирования генноинженерных белков, обладающих высокой активностью и стабильностью в экстремальных условиях (рН, соленость, температура). Кроме того, бактерии рода ТЫоа1ка1тЬгю являются доминирующим компонентом в промышленых биореакторах ТЫорая, являющихся исключительно успешной альтернативой «грязных» химических технологий обессеривания промышленных и природных газов. Поэтому глубокое понимание их метаболизма на уровне ферментов помогает лучше понять функционирование этих природных биокатализаторов в биотехнологии.

Ранее в лаборатории инженерной энзимологии Института биохимии РАН была охарактеризована восьмигемовая цитохром с нитритредуктаза Ту№Я из бактерии.

Thioalkalivibrio nitratireducens. В настоящей работе мы впервые представляем данные о гомологичном белке (TvPaR) из бактерии Thioalkalivibrio paradoxus.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ВЫВОДЫ.

1. Выделена и охарактеризована восьмигемовая нитритредуктаза TvPaR из галоалкалофильной облигатно хемоавтотрофной у-протеобактерии Thioalkalivibrio paradoxus. Показано, что фермент проявляет нитрит-, гидроксиламини еульфитредуктазные активности. Охарактеризовано влияние факторов, связанных с условиями обитания бактерий, на активность TvPaR.

2. Установлена пространственная структура свободной формы TvPaR и комплекса с сульфитом методом рентгеноструктурного анализа. Сравнительный анализ структур TvPaR и TvNiR показал, что все основные структурные особенности TvNiR, отличающие ее от ранее описанных пятигемовых нитритредуктаз, оказались присущими и TvPaR, в том числе: образование связи Tyr-Cys в активном центре ферментовгексамерная структура, приводящая к образованию полости внутри гексамераканал транспорта продукта, выходящий во внутреннюю полость гексамера.

3. Олигомеризация TvNiR (TvPaR) с образованием гексамера не влияет на активность, но повышает стабильность фермента. Максимальная стабилизация достигается в условиях высокой концентрации солей, что может иметь функциональное значение для ферментов, локализованных в периплазме галоалкалофильных бактерий Tv. nitratireducens и Tv. paradoxus, и может рассматриваться как один из факторов адаптации.

4. TvPaR и TvNiR являются конститутивными белками в клетках Tv. nitratireducens и Tv. paradoxus. Синтез TvNiR не связан с нитратным дыханием в анаэробных условиях культивирования Tv. nitratireducens.

5. Анализ аминокислотных последовательностей гомологичных восьмигемовых нитритредуктаз из галоалкалофильных и нейтрофильных негалофильных бактерий показал, что основным фактором адаптации к функционированию в условиях высоких рН и солености является снижение содержания лизина и повышение содержания кислых аминокислот.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В нашей работе охарактеризованы два гомологичных белка из галоалкалофильных гамма-протеобактерий рода Thioalkalivibrio — TvPaR и TvNiR. Многие черты этих белков, такие как строение каталитического домена, наличие гем-связывающего мотива СххСК, устройство активного центра, указывают на их родство с ранее описанными респираторными пятигемовыми цитохром с нитритредуктазами NrfA. Однако другие детали: содержание восьми гемов с на субъединицу белка, образование стабильного гексамера и связанная с ним уникальная схема транспорта продукта реакции, образование дополнительной связи Туг — Cys в активном центре, наличие уникального по структуре N-концевого домена позволяют выделить эти белки в отдельное семейство восьмигемовых нитритредуктаз.

Проведенный в работе кинетический анализ показал, что TvPaR и TvNiR являются высокоэффективными нитритредуктазами, адаптированными к экстремальным условиям содовых озер — естественного места обитания бактерий рода Thioalkalivibrio. Помимо нитрита TvPaR и TvNiR способны восстанавливать сульфит до сульфида (на уровне специализированных сирогем-содержащих сульфитредуктаз) и гидроксиламин до аммония. Оба белка являются конститутивными и присутствуют в клетках Tv. nitratireducens и Tv. paradoxus, начиная с ранних стадий роста колонии в аэробных условиях, в Tv. nitratireducens TvNiR также образуется при анаэробном росте клеток, оба белка являются мажорными, составляя 5−7% всей растворимой белковой массы.

Роль этих ферментов в клетке остается неясной. Сходство с респираторными нитритредуктазами NrfA позволяет предположить, что, подобно NrfA, TvPaR и TvNiR могут участвовать в анаэробном формировании трансмембранного протонного градиента в клетке, осуществляя финальную стадию процесса переноса электронов на нитрит. Однако, обе бактерии Thioalkalivibrio не способны расти на нитрите в качестве акцептора электронов — при анаэробном росте Tv. nitratireducens использует нитрат, a Tv. paradoxus вообще не использует соединения азота (NO3″, NO2″, N20) в качестве конечного акцептора электронов при создании трансмембранного градиента протонов в процессе клеточного дыхания. Этот факт опровергает участие обоих белков в респираторном восстановлении нитрита в клетках. Можно предположить, что оба белка, также подобно NrfA, могут участвовать в детоксикации клетки от нитрита. В Tv. nitratireducens присутствует нитратредуктаза и в процессе восстановления нитрата образуется нитрит, однако в Tv. paradoxus нитратредуктаза отсутствует, что предполагает также отсутствие эндогенного нитрита. Кроме того, большинство диссимиляторных нитритредуктаз не являются конститутивными и образуются в ответ на увеличение концентрации нитрита.

В принципе, в периплазму клеток Tv. paradoxus и Tv. nitratireducens может попадать экзогенный нитрит из внешней среды, как продукт жизнедеятельности нитрат-восстанавливающих бактерий с неполным циклом превращения соединений азота. Для соленых содовых озер характерно развитие смешанных культур бактерий, зависящих друг от друга, примером такой смешанной культуры являются бактерия Tv. nitratireducens и зависящая от ее роста бактерия Tv. denitrificans. Зависимость развития одного вида бактерий от другого определяется тем, что в каждом организме функционирует неполная цепь окисления соединений азота, при которой один организм потребляет промежуточный продукт, выделяющийся из другого организма, не будучи в состоянии образовывать его самостоятельно. Выведение накапливающегося нитрита в окружающую среду, способствует развитию в сообществе бактерий, специализированных на использовании нитрита, таких как Tv. denitrificans, не имеющей респираторной нитратредуктазы [164]. Таким образом, в смешанной культуре выполняется полная денитрификация, реакции которой разнесены в два разных вида [172.

Дополнительным преимуществом осуществления полной денитрификации в условиях щелочных озер является токсичность продукта аммонификации — аммония, который в щелочных средах переходит в аммиак [151]. В связи с этим, многие бактерии, в том числе представители рода Thioalkalivibrio отказываются от респираторной аммонификации в щелочных условиях при недостатке кислорода [164].

Другая предполагаемая функция TvNiR (TvPaR) связана с участием в цикле серы, жизненно важном для бактерий рода Thioalkalivibrio. Сравнение имеющихся у нас данных по составу последовательностей белков циклов серы в предварительно аннотированном геноме Tv. nitratireducens и опубликованных геномов других серуокисляющих бактерий рода Thioalkalivibrio, не позволили установить место TvNiR в предполагаемой окислительной цепи серы. Для каждой реакции в схеме окисления соединений серы, в геноме уже имеются последовательности белков, осуществляющих эту реакцию во множестве других организмов. К ним относятся комплексы Sox, Dsr, FCC.

В геномах других бактерий рода Thioalkalivibrio, а также неродственных таксонов были обнаружены гены еще 16 белков, имеющих гомологию более 40% с TvNiR и TvPaR. На основании многих общих признаков все эти белки можно объединить в общую группу, происходящую, вероятно, от пятигемовых димерных нитритредуктаз NrfA и представляющую эволюционныое переходное звено между NrfA и разнообразными восьмигемовыми мультисубъединичными белками — восстановителями и окислителями соединений азота и серы [6, 213].

Приведенные данные опровергают казалось бы очевидные гипотезы о функции Ту№Я и ТуРаЯ в живых клетках. Аммонификация нитрита, к которой согласно полученным структурным и кинетическим данным так хорошо приспособлены эти белки, не только не подтверждается данными о физиологии микроорганизмов, но и противоречит основным тенденциям развития цикла азота в бактериальных сообществах гиперсоленых содовых озер. Между тем, широкое распространение в геномах хемотрофных организмов, высокий уровень биосинтеза, высокая специфическая каталитическая активность и приспособленность к экстремальным условиям предполагают важную роль ТуМЯподобных белков в клетке.