Методы идентификации фитопатогенных организмов

Идентификацию фитопатогенных микроорганизмов можно проводить различными методами, применение которых зависит от конечной цели исследования. Как правило, исследования проводятся либо с целью определения возбудителя заболевания при поражении растения, либо для выявления определенного фитопатогенного объекта в растительном материале, воздухе, воде или почве.

Поиск возбудителя заболевания, вызывающего поражение растений, — трудоемкая задача, требующая высокой квалификации специалистов. Решение подобной задачи можно разбить на несколько этапов:

• — визуальный осмотр; микроскопирование; закладка пораженных частей растения во «влажные камеры» ;
• — выделение микробиологически чистых культур и их определение по культурально-морфологическим признакам;

секвенирование некоторых участков генома определяемых организмов.

Для поиска известных фитопатогенных объектов в пораженном материале или в других пробах широко используют разнообразные тест-системы, созданные, в основном, на основе ПЦР или иммуноферментного анализа. Далее рассмотрим более подробно наиболее распространенные методы идентификации фитопатогенов.

Визуальная диагностика и микроскопирование

Визуальный осмотр растений сначала проводится в местах их выращивания. Если это поле, то для начала надо сравнить внешний вид пораженного растения с другими растениями. Следует обратить внимание на размер растения, цвет, форму листьев, облиственность стебля, наличие неестественных образований на различных органах. Если видны очаги заболевания (например, пятна или некрозы на листьях или стеблях), то надо попытаться (желательно с помощью лупы) найти мицелий, спорангиеносцы или склероции — это указывает на присутствие гриба. Морфология спороношеиия позволяет определить возбудителя до какой-либо таксономической группы, иногда даже до вида. Пятнистости листьев, их скрученность, неестественная морщинистость, отставание в росте, меньшая, чем у других растений, облиственность стебля свидетельствуют о вирусном или вироидном поражении растения. Пурпурная верхушка или «ведьмины метлы» часто свидетельствуют о поражении фитоплазмами. В то же время многие из этих симптомов могут наблюдаться и при отравлении растений избыточными дозами гербицидов, при недостатке или избытке элементов почвенного питания, либо при негативном влиянии факторов окружающей среды.

При осмотре следует обратить внимание на общее состояние растения. Если оно увядшее и поникшее, в то время как другие растения стоят вертикально с нормальным тургором, то это может свидетельствовать о проблемах с сосудами. Они могут быть закупорены в результате развития фитопатогенных грибов (трахеомикозы, например, вертициллез, фузариоз) или бактерий (трахеобактериозы, например, бурая гниль картофеля). Если такой стебель срезать около почвы и поместить его конец в стакан с дистиллированной или дождевой водой, то в случае развития бактерий из конца будет выделяться в воду похожая на молоко мутная слизь. В случае развития грибной инфекции выделения слизи не будет. Часто симптомы бактериального поражения проявляются в виде «черной ножки» — ослизнення и поражения прикорневой части стебля. В этом случае стебель легко рвется в месте поражения. При грибном поражении стебель хотя и чернеет, но остается достаточно прочным и не ослизняется. Пораженность семян или семенных клубней патогенными бактериями или грибами часто вызывает изреженность посевов, когда всходят далеко не все семена.

Если растение отличаются по внешнему виду от других растений на ноле, то полезно выкопать его и осмотреть корневую зону. Внимание следует обратить на почернение и отмирание корней, наличие нетипичных образований (опухоли, галлы), поражение подземной части стебля.

Особо следует отметить необходимость анализа корнеплодов и клубней во время хранения. Необходимо оценить тургор корнеплода — он не должен быть мягким или «резиновым» на ощупь. На поверхности не должно быть пятен, язв, мест истечения слизи. Подозрительные корнеплоды и клубни следует разрезать и посмотреть на срезе — у картофеля особое внимание следует обратить на сосудистое кольцо. Если на нем имеются полости, заполненные слизистым, часто плохо пахнущим содержимым, то это является признаком бактериального поражения. Если же участок гнили достаточно сухой, без запаха, и заметно развитие мицелия, то это свидетельствует о грибном поражении. На практике часто встречаются смешанные грибо-бактериальные гнили. Высокая доля пораженных грибными и бактериальными гнилями корнеплодов при хранении — опасный признак. Такую продукцию лучше как можно быстрее перебрать и приступить к ее реализации. Если продукцию планируется хранить и после переборки, то ее следует обработать фунгицидными и бактерицидными препаратами с помощью дымовой шашки или генератора тумана.

Наличие на срезе клубня темных полос, не ослизненных, плотных, без запаха, часто более плотных по сравнению с окружающей тканью, либо не отличающихся от нее по плотности свидетельствует о вирусном поражении растения. Поражение вирусной инфекцией практически не влияет на пригодность корнеплодов к хранению.

Микроскопирование. После визуального осмотра пораженные части растений полезно взять в лабораторию для дальнейшего анализа с помощью микроскопа. Микроскопирование пораженных частей растения поможет увидеть грибные гифы, микросклероции, отдельные конидиеносцы и скопления бактериальных клеток. Возможно, эти морфологические признаки позволят идентифицировать патогенный организм до вида или рода. Однако в неблагоприятных погодных условиях (например, при засухе) гриб не образует спороношения, на поверхности может даже не быть мицелия. В таких условиях для выявления и определения возбудителя визуального осмотра и микроскопирования недостаточно. В этом случае применяют закладку растений во «влажные камеры» .

Метод «влажных камер» . Пораженную часть растения закладывают в камеру с повышенной влажностью и инкубируют (обычно при комнатной температуре) в течение нескольких суток. За это время патогенный объект, находящийся в оптимальных для себя условиях (тепло и сыро), может как-то проявить себя: грибы выявляются по росту мицелия и конидиальному спороношению, а бактерии выделяют мутную, специфически пахнущую жидкость.

Делается влажная камера следующим образом. Берется чашка Петри или плотно закрывающаяся стеклом кювета. На дно кладется смоченная водой фильтровальная бумага, на нес — чистый, желательно протертый спиртом кусочек стекла (например, предметное стекло) или пластиковая сетка. На стекло или сетку помещается образец пораженного материала (срез клубня или стебля, лист, цветок и т. д.) таким образом, чтобы он не касался мокрой бумаги. Сверху влажная камера закрывается куском стекла или крышкой (рис. В.2).

Визуальный осмотр, даже с применением микроскопирования и влажных камер, не всегда может выявить все заболевания изучаемого растения. Многие фитопатогены до определенного момента никак себя не проявляют, находятся в латентной форме. Например, возбудитель пыльной головни ячменя (Ustilago nuda) проникает во время цветения в формирующуюся зерновку. Мицелий зимует в зерновке. Весной одновременно с прорастанием семян происходит и рост мицелия, который по мере роста растения распространяется по различным его органам. Проявляется заболевание только в период колошения и приводит к разрушению всех частей колоса, превращая их в черную споровую пылящую массу. Такой патоген невозможно обнаружить при осмотре растения до колошения, хотя может быть замечено некоторое отставание в росте от здоровых соседей.

С другой стороны, многие патогенные организмы дают сходные симптомы. Так, даже специалисту трудно в сухую погоду отличить симптомы альтернариоза и фитофтороза на картофеле, или патогенов, вызывающих листовые пятнистости пшеницы. В то же время это крайне важно, так как возбудители фитофтороза и альтернариоза различаются по чувствительности к фунгицидам. Еще одной трудностью является то, что некоторые патогенные грибы не дают конидиального спороношения даже во влажных камерах. Так, в очагах альтернариоза на картофеле и томате часто присутствуют разные виды рода Altemaria. Но при визуальном осмотре и даже после инкубации во влажной камере крупноспоровый Altemaria solani часто не дает конидий, в то время как многочисленные конидии мелкоснорового Altemaria altemata хорошо заметны. Поскольку мицелий этих видов внешне никак не отличается, выявить Altemaria solani можно только с помощью молекулярных методов (например, ГІЦР).