Исследование изменений метаболизма эритроцитов донорской крови после взятия ее из организма

• ВВЕДЕНИЕ
• ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
• § 1.1 Система крови
• § 1.2 Основные функции крови
• § 1.3 Форма и строение эритроцитов
• § 1.4 Строение и функции гемоглобина
• § 1.5 Разрушение эритроцитов
• § 1.6 Процессы энергетического метаболизма и основные энергетические параметры эритроцитов
• ГЛАВА 2. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
• § 2.1 Выбор физической модели кинетики энергетического метаболизма
• § 2.2 Факторы, способствующие переходу метаболизма эритроцитов из состояния с высокой концентрацией АТФ в устойчивое состояние с низкой концентрацией АТФ
• § 2.3 Постановка экспериментальных задач
• § 2.4 Неравновесные процессы, протекающие в плазме пробы крови после ее взятия у донора, приводящие к изменению метаболизма эритроцитов
• ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
• § 3.1 Цели экспериментальных работ
• § 3.2 Используемые приборы и установки
• § 3.3 Используемые материалы
• § 3.4 Методики проведения экспериментальных работ
• § 3.5 Результаты экспериментов и их обсуждение
• § 3.6 Выводы
• § 3.7 Некоторые практически важные замечания
• Заключение
• СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
• ВВЕДЕНИЕ
• Данная работа посвящена исследованию, имеющему непосредственное отношение к медицинской практике. В этой работе представлен теоретический анализ биохимических и физических процессов, протекающих в пробе крови, взятой из организма, а также представлены результаты соответствующих экспериментов. Значимость таких исследований определяется в настоящее время проблемами, связанными с постепенной утратой функциональных свойств крови по мере ее хранения. Поэтому удлинение сроков хранения донорской крови — актуальнейшая задача.
• Основным содержанием данной работы является исследование изменений кинетики метаболизма эритроцитов. Эритроцит, как физическая система, является простой моделью, на которой можно исследовать нюансы таких изменений и других клеток. В этом заключается фундаментальная ценность данной работы. Часто не удается количественно связать изменения в метаболизме клеток с их физиологией, со способностью их к поддержанию гомеостаза, функционированием и жизнеспособностью. К тому же определение количественных зависимостей между скоростями изменения параметров и самими параметрами метаболических систем клетки представляет собой непростую задачу. Однако ее решение может иметь большую значимость для ряда прикладных вопросов. Для эритроцитов, как для наиболее просто устроенных клеток, часто эти трудности преодолимы.

Цель работы. На основе анализа кинетики гомеостатирования основных параметров метаболизма эритроцитов исследовать возможность реализации второго устойчивого состояния эритроцитов, характеризующегося низкой концентрацией АТФ, по сравнению с высокой концентрацией АТФ, реализующейся в эритроцитах in vivo. Переход из одного состояния метаболизма эритроцита в другое может сопровождаться нарушением кислородно-транспортной функции эритроцитов. Причинами такого нарушения могут быть накопление гемоглобина в метформе и изменение неспецифической проницаемости мембран, а также и изменение других параметров, которое обусловлено переходом эритроцитов на новый уровень гомеостатирования параметров.

Основные задачи исследования

1. Выбор физической модели для теоретического исследования кинетики гомеостатирования основных параметров энергетического метаболизма эритроцитов in vivo с целью выяснения условий существования устойчивых состояний и их числа.

2. Выяснение условий, при которых может происходить переход метаболизма эритроцитов из одной устойчивой точки в другую.

3. Выявление процессов, протекающих при взятии крови из организма, способствующих указанным переходам.

4. Экспериментальная проверка возможности перехода метаболизма эритроцитов из состояния in vivo в другое состояние после взятия крови из организма.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

§ 1.1 Система крови

К обобщенной «системе крови» по Л. Ф. Лангу относят:

1. кровь и лимфу;

2. органы кроветворения и кроверазрушения — красный костный мозг, тимус, селезенку, лимфатические узлы, а также,

3. нейрогуморальный аппарат регуляции их деятельности.

Кровь и лимфа вместе с интерстициальной (межклеточной), спинномозговой (ликвором) и синовиальной (межорганной) жидкостью образуют внутреннюю среду организма. Кровь — это жидкая соединительная ткань, находящаяся в постоянном движении, между клетками которой нет механической связи. Кровь состоит из плазмы (жидкого межклеточного вещества) и взвешенных в ней форменных элементов. Плазма составляет 55−60% объема крови, форменные элементы — 40−45%. Отношение объема форменных элементов ко всему объему крови называется показателем гематокрита.

Плазма крови — это электролит, ионный и белковый состав которого подробно описан в работе по реологии крови. В этой работе также освещены механические свойства, оптические характеристики, методы исследования и реологические свойства крови. Приведены данные по ее электрои теплопроводности. Особенно подробно описаны такие свойства эритроцитов, как их деформируемость и агрегация.

Плазма крови содержит 90% воды, около 6,6−8,5% белков и другие органические и минеральные соединения — промежуточные или конечные продукты обмена веществ, переносимые из одних органов в другие. К белкам плазмы крови относятся [2]:

1) альбумины, которые связывают и переносят различные вещества крови и обуславливают около 80% общего осмотического давления ее коллоидов;

2) глобулины, разделяющиеся на б-, в-, г-фракции, важнейшая роль которых состоит в транспорте липидов и других веществ, нерастворимых в свободном состоянии. г-глобулины составляют антитела, вырабатываемые иммунной системой;

3) фибриноген — растворимая форма фибрина, — фибриллярный белок плазмы крови, образующий волокна при повышении свертываемости крови (например, при образовании тромба). Главная роль фибриногена — обеспечение свертываемости крови.

Плазма также содержит варьирующееся число липидов, не только связанных белками (липопротеиды), но и свободных, многие из которых поверхностно-активны. Одним из классов липопротеидов являются хиломикроны — микросферы, диаметром 100 нм, обнаруживаемые, главным образом, после приема жирной пищи.

Известно, что постоянство количества клеток (подавляющего большинства их видов) в тканях и органах поддерживается за счет проточного равновесия. При этом скорость деления клеток равна скорости их гибели по одному из двух путей — апоптозу или некрозу. В результате гибели клеток по пути некроза в кровь постоянно поступают белки, входящие ранее в состав цитомембран этих клеток. Кроме того, в плазму крови поступают различные секреты, выделяемые специализированными клетками (например, гормоны и ферменты) и другие вещества, попадающие в организм с пищей.

§ 1.2 Основные функции крови [1]

· транспортная функция — перенос и доставка клеткам-мишеням различных веществ, растворенных в крови:

1) перенос кислорода из легких во все органы и углекислоты из органов в легкие — дыхательная функция;

2) доставка органам питательных веществ — трофическая функция;

3) удаление и транспортировка в почки продуктов обмена веществ — выделительная, или экскреторная функция;

4) транспорт биологически активных веществ (гормонов, регуляторных субстанций и анаболиков);

5) терморегуляторная функция — поддержание температуры тела, особенно в условиях повышенной или пониженной температуры окружающей среды. Вследствие большой теплоёмкости кровь переносит тепло от более нагретых участков к менее нагретым участкам тела и органам, регулируя, таким образом, физическую теплоотдачу.

· защитная функция (обеспечение гуморального и клеточного иммунитета, свертывание крови при травмах);

· гомеостатическая функция (поддержание постоянства внутренней среды организма, в том числе теплового и иммунного гомеостаза).

Все эти функции определяют важнейшую роль крови в организме. Клинический анализ крови в медицинской практике является одним из основных в постановке диагноза.

Данная работа будет касаться дыхательной функции крови. Следовательно, главным объектом исследования будет эритроцит, его гомеостаз (постоянство состава) и функции.

По данным авторов работы эритроциты представлены в крови человека в количестве около 5×10¹² в 1 литре крови. Как уже говорилось выше, основная функция эритроцитов — дыхательная — транспортировка кислорода и углекислоты. Эта функция обеспечивается дыхательным пигментом — гемоглобином. Средняя продолжительность жизни эритроцитов в крови около 100 дней (в некоторых источниках от 80 до 120 дней), а затем они разрушаются. В организме ежедневно разрушается (и образуется) около 200 млрд. эритроцитов.

§ 1.3 Форма и строение эритроцитов

Популяция эритроцитов неоднородна по форме и размерам. Форма стойко сохраняется не только целым эритроцитом, но и его стромой после выхода гемоглобина. В кровеносном русле при нормальных физиологических условиях основную массу составляют эритроциты двояковогнутой формы — дискоциты (80−90%). Кроме того, имеются планоциты (с плоской поверхностью) и стареющие формы эритроцитов — шиповидные эритроциты, или эхиноциты, куполообразные, или стоматоциты, и шаровидные, или сфероциты.

Одним из проявлений процессов старения эритроцитов является их гемолиз, сопровождающийся выходом гемоглобина; при этом в крови обнаруживаются так называемые «тени» эритроцитов — их оболочки.

Обязательной составной частью популяции эритроцитов являются их молодые формы, называемые ретикулоцитами, или полихроматофильными эритроцитами. В норме их содержание в плазме крови достигает 1−5% от общего количества всех эритроцитов. В них сохраняются рибосомы и эндоплазматическая сеть, формирующие зернистые и сетчатые структуры, которые выявляются при специальной окраске.

Размеры эритроцитов в нормальной крови варьируются. Диаметр эритроцита колеблется от 5,0 до 9,0 мкм (рис.1). Размеры эритроцитов человека различаются в зависимости от пола и возраста, климатогеографических условий проживания. Большинство эритроцитов имеют диаметр около 7,5 мкм и называются нормоцитами. Остальная часть эритроцитов представлена микроцитами и макроцитами.

Эритроцит человека и других млекопитающих является монофазной клеткой, т. е. не имеет эндоплазматических мембран. Снаружи эритроцит окружен белково-липидной мембраной. Цитоплазма эритроцита состоит из воды (60%) и сухого остатка (40%), содержащего, в основном, гемоглобин, молекулы которого вблизи от мембраны расположены упорядоченно, а в более глубоких слоях — хаотично. Плотность «упаковки» молекул гемоглобина в эритроците такова, что даже в центральных частях подвижность его каждой молекулы ограничена пространством в 10 A. Количество гемоглобина в одном эритроците называют цветовым показателем. При электронной микроскопии гемоглобин выявляется в гиалоплазме эритроцита в виде многочисленных плотных гранул диаметром 4−5 нм.

§ 1.4 Строение и функции гемоглобина

Гемоглобин — главный компонент эритроцита и основной дыхательный пигмент, обеспечивающий перенос кислорода (О₂) из легких к тканям в организмах позвоночных животных, и, в меньшей степени, углекислого газа (СО₂) от тканей в легкие. Главным образом, углекислота переносится в виде в плазме крови. Подсчитано, что в одном эритроците содержится ~ 340.000.000 молекул гемоглобина, каждая из которых состоит примерно из 103 атомов. В крови человека в среднем содержится ~ 750 г гемоглобина.

Гемоглобин представляет собой сложный белок, относящийся к группе гемопротеинов. Белковый компонент его представлен глобином, состоящим из двух и двух субъединиц и, соответственно, содержит четыре полипептидные цепочки двух сортов. Небелковый компонент (так называемая простетическая группа) представлен четырьмя одинаковыми железопорфириновыми соединениями — гемами.

Иржак Л.И. в своей работе описал большинство физиологических свойств гемоглобина, его виды и подвиды. Основное внимание в этой работе уделено описанию процессов связывания кислорода гемоглобином в норме и при некоторых патологиях. Также приведена кривая диссоциации оксигемоглобина и описан эффект Бора.

Наиболее подробно физико-химические свойства гемоглобина изучены и представлены в работах Блюменфельда Л. А. [5, 6]. В них большое внимание уделено зарядовым характеристикам молекул гемоглобина. Эти характеристики в значительной степени определяют адгезивные свойства молекул гемоглобина (комплексование и ассоциацию с липидной мембраной). В указанных работах приведены теоретические и экспериментальные исследования, в которых сравниваются свойства оксии деоксигемоглобина, а также гемоглобина и миоглобина.

При взаимодействии молекулярного кислорода с гемоглобином в условиях in vivo существует небольшая, но конечная вероятность окисления гема двухвалентного железом до трехвалентного, причем молекула О₂ не присоединяется, но окисляет железо: Fe²⁺ + O₂ Fe³⁺ O₂. Поэтому при дыхании в эритроцитах непрерывно образуется метгемоглобин, который не способен переносить О₂. Восстановление Fe³⁺ метгемоглобина до Fe²⁺ происходит с затратами энергии и обеспечивается ферментом — метгемоглобинредуктазой.

В ходе метаболизма глюкозы, протекающего в эритроците по побочному пути гликолиза, контролируемого ферментом дифосфоглицератмутазой, в эритроците образуется 2,3-дифосфоглицерат (2,3-ДФГ). Основное его значение заключается в уменьшении сродства гемоглобина к кислороду. 2,3-ДФГ связывается с в-цепями гемоглобина, облегчая отсоединение О₂ от молекулы гемоглобина.

Большое количество опубликованных работ посвящено строению мембран клеток, в том числе и эритроцитов. В одной из классических работ приведены данные по количеству и белковому составу мембран эритроцитов и функциональному назначению этих белков, архитектонике липидного бислоя.

Методики и результаты идентификации некоторых видов белков мембранных структур представлены в работе. В мембране эритроцита идентифицировано 15 главных белков. Более 60% всех белков составляют: примембранный белок спектрин и мембранные белки — гликофорин и белок полосы 3.

Спектрин является белком цитоскелета, связанным с внутренней стороной мембраны. Он участвует в поддержании двояковогнутой формы эритроцита.

Гликофорин — белок, относящийся к классу мембранных гликопротеинов, по мнению авторов работ [9, 10, 11], играет важную роль в механизме авторегуляции неспецефической проницаемости цитоплазматической мембраны эритроцита. Этот белок пронизывает мембрану в виде одиночной спирали. Большая его часть выступает с наружной поверхности эритроцита, где к нему присоединены 15 отдельных цепей олигосахаридов, на ветвях которых расположены сиаловые кислоты, несущие отрицательные заряды. В распрямленном виде максимальное удаление ветвей гликофорина от поверхности эритроцита может достигать 200 нм, что больше поляризационной длины плазмы крови (радиуса экранировки Дебая). В результате этого отдельные отрицательные заряды экранированы противоионами плазмы, так что нити гликофорина не взаимодействует с поверхностью своей мембраны. Так как противоионы могут быть общими для гликофоринов различных эритроцитов, то эритроциты могут образовывать монетные столбики.

Белок полосы 3 представляет собой трансмембранный гликопротеид, полипептидная цепь которого много раз пересекает бислой липидов. Этот гликопротеид участвует в обмене кислородом и углекислотой.

§ 1.5 Разрушение эритроцитов

Известно, что эритроциты живут 2−3 месяца. Основной причиной ухода их из кровяного русла является потеря отрицательных зарядов сиаловых кислот. Отбор из кровяного русла функционально неспособных эритроцитов осуществляется по нативности сиаловых кислот на нитях гликофорина в тонких (2−3 мкм диаметр) капиллярах микроциркуляционной сети крови, в основном в селезенке, а также легких и печени.

§ 1.6 Процессы энергетического метаболизма и основные энергетические параметры эритроцитов

В цитоплазме эритроцитов в процессах анаэробного усвоения молекул глюкозы синтезируются основной макроэрг — АТФ и энергетические потенциалы НАДФ-Н и НАД-Н. С помощью этих соединений обеспечиваются энергией главные процессы, связанные с жизнеобеспечением и функциональной деятельностью эритроцитов. Концентрация АТФ (в дальнейшем, nАТФ) является основным энергетическим параметром эритроцита. Энергия, выделяющаяся при разрыве макроэргической связи АТФ, обеспечивает активный транспорт катионов через мембрану, поддержание оптимального соотношения концентраций К⁺ и Na⁺ (поддержание нормальной работы Na⁺/К⁺каналов), сохранение формы и целостности мембраны эритроцита. НАД-Н участвует в метаболизме гемоглобина, предотвращая окисление его в метгемоглобин, а НАДФ-Н участвует в метаболизме липидов.

Атауллаханов Ф.И. выполнил ряд фундаментальных работ [12, 13], в которых использовал и усовершенствовал модель кинетики метаболизма эритроцитов, представленную в работах Селькова Е. Е. Он провел теоретические и экспериментальные исследования, касающиеся процессов энергетического метаболизма эритроцитов. В полном объеме представил биохимию этих процессов, описал соответствующие реакции и участвующие в них ферменты. В частности, исследовал процессы поддержания постоянства объема эритроцитов, обеспечивающие их целостность клеток. Рассмотрел кинетику обмена АТФ в этих клетках и связал ее с механизмом, обеспечивающим постоянство объема эритроцитов. Показал, что постоянство объема связано с поддержанием на постоянном уровне величины энергетического заряда

ц=,

где, , — концентрации АТФ, АДФ и АМФ соответственно.

Фок М.В. в своих исследованиях кинетики процессов метаболизма клеток, в том числе эритроцитов, графическим методом показал кинетику основных процессов метаболизма, обеспечивающих гомеостаз величин кислотности (рН) и концентрации АТФ (nАТФ) в цитоплазме клеток в состоянии покоя. На основании этого он объяснил принцип действия механизма стабилизации этих параметров. Для этого была рассмотрена кинетика метаболизма эритроцитов изменения каждого из указанных параметров как функции рН и nАТФ, при постоянстве всех других параметров клетки:

1. скоростей притока (V⁺) и стока (V^-) ионов Н⁺ от значений самих параметров рН и nАТФ в цитоплазме;

2. скоростей синтеза (V⁺) и расхода (V^-) молекул АТФ от рН и nАТФ в цитоплазме.

ГЛАВА 2. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

§ 2.1 Выбор физической модели кинетики энергетического метаболизма

Метаболизм большинства соматических клеток, выполняющих определенные функции в организме, описывается огромным количеством параметров, что, как правило, существенным образом затрудняет создание математической модели их состояний. Исключение составляют только отдельные виды клеток с простейшим метаболизмом, к которым относится эритроцит. Однако физические модели, основанные на качественном анализе закономерностей протекания конкретных процессов метаболизма, могут дать значимые результаты для решения фундаментальных и прикладных задач. В данной работе использовались только физические модели, которые более просты и наглядны.

В литературе наиболее известна модель Селькова [14], используемая в работе Атауллаханова. Математическая модель сложного равновесного процесса усвоения глюкозы по пути Эмбдена-Мейэргофа представлена системой уравнений, описывающих каждую реакцию последовательного превращения молекулы глюкозы в лактат. Расчеты приводятся при постоянном значении рН и при постоянстве пула ферментов и регуляторных субстанций, участвующих в этих реакциях. В результате получают зависимость скоростей утилизации глюкозы от концентрации АТФ в цитоплазме эритроцита, то есть зависимость скорости V⁺ синтеза АТФ от его концентрации nАТФ. В модели принято, что расход АТФ обусловлен суммарной тратой этого макроэрга в простых ферментативных реакциях. Следовательно, скорость V^- трат АТФ в зависимости от nАТФ в цитоплазме эритроцита изменяется по закону Михаэлиса-Ментен:

где — скорость траты АТФ, — концентрация АТФ, величины k_m и, А — константы. В данной модели k_m>> nАТФ, тогда

Данная модель представлена на рис. 3.

При пересечении кривых V⁺ и V^- реализуется только одна стационарная точка. Устойчивость точки определяется по двум условиям устойчивости по Ляпунову:

(1) — первое условие устойчивости,

где б_i — рассматриваемый параметр, исоответственно, скорости притока и убыли данного параметра, б_j — параметр, по которому проверяется устойчивость, при этом i может быть равно j.

(2) — второе условие устойчивости.

Стационарная точка является устойчивой по условию (1). Видно, что данная модель не допускает существования большего количества устойчивых стационарных точек.

Следовательно, можно заключить, что для установления возможности существования устойчивых точек с помощью моделей, в которых допускается свободной одна переменная, достаточно знать вид кривых зависимостей скоростей синтеза V⁺ и расхода V^- АТФ от его концентрации и их взаимное расположение. Такой графический метод анализа кинетики метаболизма наиболее нагляден и позволяет на качественном уровне устанавливать наличие устойчивых стационарных точек, поэтому в дальнейшем будет решаться поставленная задача данным методом, без привлечения сложных математических уравнений.

Другой физической моделью, схожей с предыдущей, является модель, приведенная в работах Фока М. В. и его соавторов. Она используется для анализа кинетики энергетического метаболизма и представлена на рис. 4. Данная модель принята за основную в данном исследовании.

Зависимости скоростей синтеза (V⁺) и расхода (V^-) АТФ от его концентрации (nАТФ) в цитоплазме при постоянстве всех остальных параметров, таких как рН, концентраций всех ферментов, количества аденозиновых оснований (АДФ и АМФ) и запасов неорганического фосфата, имеют вид, представленный на рис. 4. Свободным параметром, также как и в первой модели, является концентрация АТФ в цитоплазме.

Кривая зависимости V⁺ от nАТФ имеет колоколообразную форму с максимумом. При нулевой концентрации АТФ в цитоплазме скорость синтеза V⁺ АТФ имеет ненулевое значение. Это обусловлено тем, что в рассматриваемых условиях (заданном значении рН, концентрации АДФ, ограниченном запасе неорганического фосфата и при нулевом значении концентрации АТФ) в результате теплового движения субстраты (АДФ и молекул фосфата) сталкиваются, вследствие чего преодолевается активационный барьер, и в результате, происходит синтез АТФ. Дальнейший ход кривой зависимости скорости (V⁺) синтеза АТФ от nАТФ определяется автокаталитической реакцией синтеза, в которой часть выработанного АТФ расходуется в процессах гликолитических реакций. Поэтому скорость синтеза АТФ сначала зависит линейно от nАТФ, а затем экспоненциально. Далее по мере истощения запасов органического фосфата достигается максимум скорости синтеза АТФ. Дальнейший спад кривой зависимости V⁺ АТФ от nАТФ обусловлен, в основном, истощением запасов неорганического фосфата. При нулевой скорости синтеза в области высоких значений nАТФ все запасы неорганического фосфата израсходованы.

Зависимость скорости V^- расхода АТФ от nАТФ, также как и в первой модели изменяется по закону Михаэлиса-Ментен:

где — скорость траты АТФ, — концентрация АТФ, величины k_m и, А — константы. В данной модели нет условия k_m>> nАТФ, и кривая скорости расхода V^- при высоких значениях nАТФ, отклоняясь от прямой, выходит на постоянный уровень.

Рис. 4 демонстрирует один из возможных вариантов взаимного расположения кривых зависимостей скоростей V⁺ синтеза АТФ и расхода V^- АТФ от nАТФ, которые при пересечении дают три стационарные точки: две из которых (1 и 3), устойчивы по условию (1), одна (точка 2) неустойчивая и является дискриминационной. Таким образом, вторая модель допускает существование второй устойчивой точки в областях низких значений nАТФ.

Если кинетику метаболизма эритроцитов крови в организме можно представить в виде, приведенном на рис. 4, то их состоянию in vivo соответствует точка 3. Это доказывают эксперименты с отмытыми эритроцитами, приведенные в работах Атауллаханова Ф. И. [12, 13].

С помощью данной модели Фока М. В. можно проанализировать возможность перехода метаболизма эритроцита из одного устойчивого состояния в другое. Первый способ осуществления перехода — это запуск быстрых неравновесных процессов (например, при добавлении в пробу крови ингибиторов АТФ), которые могут привести к существенному уменьшению концентрации АТФ, причем значения других параметров не успевают изменяться. При этом метаболизм эритроцитов перейдет в другое устойчивое состояние с гомеостазом концентрации АТФ в области низких значений. Но на практике такой вариант трудно реализуем.

Другой способ осуществления перехода — это кратковременное изменение регулирования (активации или ингибирования) процессов синтеза и трат АТФ, в результате которого изменяется взаимное расположение кривых V⁺ и V^-. Рис. 5 иллюстрирует такое изменение кинетики процессов, которое приводят к упомянутому выше переходу. Условия, при которых производится анализ этих изменений, соответствуют условиям основной модели, используемой в данной модели.

На рис. 5 показаны семейства кривых зависимостей скоростей синтеза V⁺ и расхода V^- АТФ от nАТФ при различных уровнях регулирования процессов энергетического метаболизма эритроцитов. На рис. 5а изображено семейство кривых V⁺, соответствующих разным уровням активности процесса синтеза АТФ, при неизменном уровне активности процесса трат АТФ. При этом положение кривой зависимости скорости расхода V^- от nАТФ неизменно для всех рассматриваемых кривых V⁺. На рис. 5б показано семейство кривых V^-, соответствующих разным уровням активности процессов трат АТФ при неизменном уровне активности процесса синтеза АТФ. Соответственно, положение кривой V⁺ неизменно для всех рассматриваемых кривых V^-.

Рассмотрим случай регулирования активности процесса синтеза АТФ (рис. 5а). Пусть процесс синтеза АТФ активирован. Этому соответствует верхняя кривая на рис.5а. Система имеет одну устойчивую стационарную точку 3. Допустим, что активирование постепенно снимается. Кривая V⁺ переходит в положение под кривой V⁺_исх.. Видно, что появляются ещё 2 стационарные точки, одна (точка 1) из которых, при низких значениях, устойчива, а вторая (точка 2) — не устойчива (дискриминационная). Дальнейшее смещение кривой V⁺ может быть обеспечено продолжающимся снятием активирования и включением ингибирования процесса синтеза АТФ. При смещении кривой V⁺ вниз, в сторону все более низких скоростей гликолиза, устойчивая точка 3 смещается в сторону низких значений nАТФ, а дискриминационная точка 2 в сторону высоких его значений, затем 2-я и 3-я точки сливаются, а при дальнейшем усилении ингибирования исчезают. В конечном итоге остается одна устойчивая точка 1 в области низких концентраций АТФ. Рассмотренная картина смены состояний обратима. Постепенное снятие ингибирования процесса синтеза АТФ и последующая его активация этого процесса, переводят систему из конечного состояния в начальное.

На рис. 5б рассмотрен другой случай регулирования энергетического метаболизма, когда процесс синтеза АТФ не регулируется, а процесс трат постепенно активируется. В исходном состоянии системы второй процесс подавлен, и кривая V^-_исх. занимает самое нижнее положение, а положение кривой V⁺ не меняется. Система имеет одну устойчивую стационарную точку. При постепенной активации процессов трат АТФ кривая V^- смещается в сторону высоких скоростей расхода АТФ. При касании V^- с кривой V⁺ появляется вторая точка 2 неустойчивая по условию (2). При дальнейшем смещении кривой V^- появляется ещё одна точка — 1, которая устойчива по первому условию Ляпунова. При этом устойчивая точка 3 смещается в сторону низких значений nАТФ, а дискриминационная точка 2 в сторону высоких его значений. Затем 2-я и 3-я точки сливаются и при дальнейшем активировании процессов расхода АТФ исчезают. В конечном итоге остается одна устойчивая точка — 1 в области низких значений концентрации АТФ. Подобно предыдущему рассмотренному случаю, данная картина перехода обратима.

Таким образом, изменяя скорости протекания процессов синтеза и трат АТФ с помощью их активации и ингибирования, можно переводить систему из одного устойчивого состояния в другое, если данная физическая модель допускает существование двух устойчивых состояний энергетического метаболизма эритроцита.

В свете изложенного выше, взаимные переходы между состояниями эритроцита с высокой и низкой концентрацией АТФ осуществляются тогда, когда кривые V⁺ синтеза и V^- расхода АТФ смещаются в противоположные стороны (сближаются либо расходятся). Это смещение может достигаться за счет ингибирования процесса синтеза АТФ и одновременной активации процесса его трат. На основе анализа кинетики метаболизма эритроцитов с помощью выбранной за основу физической модели нельзя утверждать, что всегда существует вторая устойчивая точка, лежащая в области низких значений АТФ, поскольку эта модель допускает варианты, когда такой точки не существует. Для данного исследования интересны не все возможные ситуации, а только те, когда энергетический метаболизм эритроцитов близок к in vivo. Для прояснения вопроса о том, всегда ли существует состояние эритроцитов с низкой nАТФ, требуется привлечение более точной модели, которая возможно даст однозначный ответ о наличии в этих условиях указанной устойчивой точки.

Рассмотрим модель равновесных процессов метаболизма, предложенную Фоком М. В. и соавторами в работе [10], дополнив ее некоторыми деталями и назвав обобщенной моделью, как это сделано в работе. В этой работе рассматривается состояние покоя клеток, режимы их активности и деления. Нас интересует только состояние покоя, в котором достигается гомеостаз всех параметров, обеспечивающий жизнеспособность и жизнедеятельность клеток.

В обобщенной модели основными параметрами при анализе кинетики энергетического метаболизма выбраны показатель кислотности рН цитоплазмы, концентрация АТФ в ней и количество липидов C в мембране. Первые два параметра относятся к быстроменяющимся параметрам, так как величины их могут изменяться за доли секунды, то есть значительно быстрее времени обращения крови по большому кругу. В отличие от этих параметров, количество липидов в мембране эритроцитов меняется медленно, но также является важным энергетическим параметром, который определяет жизнеспособность и целостность клетки. Количество ферментов, запасы глюкозы в цитоплазме, объем эритроцитов и др. в модели приняты постоянными. Свободными же оставляют 2 переменные — nАТФ и рН цитоплазмы, которые определяют скорости таких энергозависимых процессов в эритроцитах как скорости синтеза и распада АТФ, скорости подкисления и подщелачивания цитоплазмы, а также скорости синтеза и распада липидов. Эти скорости будут функциями только двух указанных переменных.

 — скорости синтеза и расхода АТФ;

 — скорости подкисления подщелачивания цитоплазмы;

 — скорости синтеза и распада липидов.

Зависимости скоростей каждого из перечисленных процессов от рН и nАТФ в трехмерном пространстве величин (pH, nАТФ, V — скорости процессов) могут быть представлены сложными поверхностями [15, 16]. На линиях пересечения поверхностей, полученных для каждых двух противоположно направленных процессов (синтез и расход АТФ, подкисление и подщелачивание цитоплазмы, синтез и распад липидов в мембранных структурах), достигается баланс их скоростей.

На рис. 6 представлены участки этих поверхностей. Их линии пересечения трехмерны. Пара участков поверхностей V⁺_АТФ и V^-_АТФ дают линию пересечения, в точках которой скорость синтеза АТФ равна скорости расхода АТФ; пара поверхностей V⁺_рН и V^-_рН дают линию пересечения, в точках которой скорость подкисления равна скорости подщелачивания цитоплазмы; пара поверхностей V⁺_С и V^-_С дают линию пересечения, в каждой точке которой скорость увеличения равна скорости уменьшения количества липидов в мембране. Следами этих линий пересечения (в проекции на плоскость (nАТФ; рН)) являются кривые АВ, MN и KL, соответственно, для каждой из перечисленных выше линий пересечения. Как видно из рис. 6, эти кривые попарно пересекаются, что отражает рассогласованность процессов метаболизма.

На рис. 7. эти следы показаны на фазовой плоскости (nАТФ; рН) для случая согласования процессов метаболизма. При значениях рН и nАТФ, соответствующих точкам на этих кривых,

V⁺ = V^-? V_обмена (V_обмена — скорость обмена параметра).

Скорость обмена является важнейшей характеристикой проточного равновесия противоположно направленных процессов клеточного метаболизма в состоянии покоя.

Как видно из рис. 7 кривые АВ и КL монотонно возрастают, а МN спадает, при этом все кривые пересекаются в точке О. Такая конфигурация и взаимное расположение кривых определяют устойчивость точки О по всем трем параметрам.

Рассмотрим устойчивость точки О по концентрации АТФ. В области над кривой АВ преобладают скорость V⁺ синтеза АТФ, а под кривой скорость V^- его трат, следовательно, частная производная V_обмена концентрации АТФ по nАТФ отрицательна. При отклонении состояния метаболизма от точки О в сторону меньших концентраций АТФ, то, начнут преобладать процессы синтеза АТФ и состояние вернется в исходное устойчивое положение. То есть концентрация АТФ возрастает в результате интенсификации окислении субстратов и цитоплазма подкисляется.

Можно показать также, что точка О устойчива по рН согласно условию (1). Как говорилось, кривая МN монотонно спадает. Над кривой баланса MN преобладает скорость притока V⁺ ионов водорода Н⁺ в цитоплазму, а под кривой — скорость V^- убыли Н⁺, значит, частная производная V_обмена ионов Н⁺ по рН отрицательна. При отклонении состояния метаболизма от точки О вверх по рН будут преобладать процессы подкисляющие цитоплазму, в результате которых значение рН возвращается к исходному.

Проведя аналогичные рассуждения можно заключить, что точка О также устойчива по количеству липидов в цитоплазматической мембране. Над кривой баланса KL преобладает скорость V⁺ синтеза липидов, а под кривой — скорость V^- их ферментативного распада. При переходе через точку О слева направо частная производная V_обмена количества липидов по nАТФ отрицательна, также при переходе через точку О снизу вверх частная производная по рН также отрицательна. Следовательно, согласно условию (1) эта точка устойчива по количеству липидов С в цитомембране.

Для дальнейшего анализа кинетики метаболизма эритроцитов важно получить указанные следы кривых баланса скоростей V^- и V⁺ для основных параметров, используемых в принятой за основу модели, во всем физиологическом диапазоне изменений концентрации АТФ и рН, включая область больших, чем в состоянии покоя, значений концентрации АТФ. Ясно, что конфигурации и взаимное расположение кривых, обеспечивающих устойчивость новой точки 3 с координатами (nАТФ₃, рН₃), в случае согласованности процессов метаболизма, будут подобны рассмотренному выше случаю для состояния покоя клетки. Для эритроцитов это имеет место. Для подавляющего большинства соматических клеток (кроме возбудимых клеток) согласно работе в области высоких значений nАТФ устойчивости состояний метаболизма по рН нет. Поэтому для дальнейшего анализа кинетики метаболизма эритроцитов мы воспользуемся следующей моделью, которая проиллюстрирована на рис. 8.

Кривая ABCD на фазовой плоскости (nАТФ; рН) является следом кривой баланса скоростей синтеза V⁺ и расхода V^- АТФ. Форма этой кривой имеет зигзагообразный вид. Точки ветвей АВ и CD устойчивы по условию (1), кроме точек В и С, которые неустойчивы по условию (2). Точки ветви ВС не устойчивы по условию (1).

Из таких же соображений получена форма кривой KLК₁L₁. Точки ветвей участков кривой KL и К₁L₁ устойчивы по условию (1), а точки ветви LK₁ не устойчивы по этому условию. Точки L и K₁ неустойчивы по условию (2).

Для качественного анализа (достаточного для получения необходимых результатов) хода кривой баланса MN не требуется строить соответствующие поверхности. Расположение и характерную конфигурацию кривой MN можно получить аналитически. Имея начальную точку, для определения конфигурации и расположения на плоскости (nАТФ, рН) кривой MN, можно воспользоваться известной зависимостью рН цитоплазмы от величины трансмембранного потенциала.

Поскольку цитомембрана не представляет значительного препятствия для ионов Н⁺, то можно использовать соотношение Больцмана:

(3),

где — концентрация ионов в цитоплазме эритроцитов; - концентрация ионов в плазме крови; - элементарный заряд; - трансмембранный потенциал; k — постоянная Больцмана; T — температура. Прологарифмировав соотношение (1), получим зависимость рН цитоплазмы от концентрации АТФ (4):

(4),

где величина U_м является функцией рН и nАТФ.

Соотношение (4) на фазовой плоскости (nАТФ; pH) определяет кривую, являющуюся следом кривой баланса скоростей роста и убыли концентрации Н⁺ в цитоплазме эритроцитов.

Обычно in vivo кислотность плазмы крови =7,45; а ~25 мэВ и =26мэВ, т.о. из (4) следует, что в норме в цитоплазме эритроцитов =7,05.

Трансмембранная разность потенциалов состоит из трех компонент

где U_D — потенциал термодинамического равновесия Доннана; U_Na/K — величина трансмембранного потенциала, обусловленного деятельностью молекулярных K⁺/Na⁺ насосов, зависящая от концентрации АТФ по закону Михаэлиса-Ментен; U_H+ — величина трансмембранного потенциала, которая определяется выходом части ионов Н⁺ при накоплении кислых продуктов при протекании реакций гликолиза. Последней составляющей можно пренебречь.

При нулевом значении концентрации АТФ величина трансмембранного потенциала ненулевая, соответствует потенциалу Доннана и составляет 10 мВ. В организме строго поддерживается рН межклеточной жидкости и плазмы крови на уровне рНе=7,35−7,45. Следовательно, рН цитоплазмы эритроцита ниже, чем рН плазмы на величину ДрН=0,05, обусловленную наличием доннановского потенциала, и имеет значение рН_Д=7,3. Тогда кривая MN взяв начало в точке (0, рН_д) далее спадает, постепенно доходя до насыщения в области высоких значений концентрации АТФ, как это показано на рис. 8.

Для всех соматических клеток (кроме, нейронов), кривая MN обязательно пересекает участок АВ следа АВСD, расположенный в области низких значений АТФ, поскольку у всех этих клеток есть состояние покоя (рис. 9). Ретикулоцит в этом отношении от этих клеток не отличается, поскольку имеет ядро и все признаки обычной соматической клетки. Эта клетка, несомненно, может также находиться в состоянии покоя, и соответствующая ему точка лежит в области низких значений концентраций АТФ. Эритроцит значительно проще своего предшественника. Его энергетическая база ослаблена, поскольку гликолиз является единственным источником энерговыделения. Интенсивность трат АТФ значительно меньше. Эти факторы влияют на взаимное расположение следов кривых в рассматриваемой качественной модели энергетического метаболизма. Подробный анализ изменений энергетического метаболизма ретикулоцита при превращении его в эритроцит, выполненный с помощью обобщенной модели, не позволяет однозначно ответить на вопрос о существовании второй устойчивой точки в области низких значений АТФ в условиях, близких к in vivo. Для этих целей необходимы эксперименты с цельной кровью.

§ 2.2 Факторы, способствующие переходу метаболизма эритроцитов из состояния с высокой концентрацией АТФ в устойчивое состояние с низкой концентрацией АТФ

Способы перевода энергетического метаболизма эритроцитов на новый уровень можно разделить на две группы: равновесные и неравновесные.

Поскольку исходное высокоэнергетическое состояние имеет определенный диапазон устойчивости по двум указанным свободным параметрам рН и nАТФ, то тактика равновесного перевода должна включать постепенное приближение (за счет регулирования процессов метаболизма) к границе устойчивости и переход за нее. Далее система сама обеспечит достижение низкоэнергетического состояния, если такое имеется. Рис. 10 иллюстрирует кинетику возможного перехода метаболизма эритроцита из одного устойчивого состояния в другое состояние в результате изменения регулирования скоростей протекания равновесных процессов.

На этом рисунке на фазовой плоскости (nАТФ, рН) представлены следы кривых баланса скоростей притока и убыли основных параметров: АВСD — концентрации АТФ в цитоплазме, КLK₁L₁ — количества липидов С в мембране эритроцитов, МN — концентрации ионов Н⁺ в цитоплазме. Точка 3 на этом рисунке иллюстрирует взаимное расположение кривых, определяющее исходное состояние системы до изменения регулирования процессов. Для того, чтобы осуществился переход в область низких значений nАТФ необходимо, чтобы в результате регулирования активности равновесных процессов кривые АВСD и КLK₁L₁ смещались в сторону увеличения рН, а MN в сторону меньших значений этой величины. Так как для перехода важно только изменение взаимного расположения указанных кривых, то для простоты и ясности рассмотрения, можно положить, что 2 зигзагообразные кривые не меняют своего положения, а меняется только положение кривой МN. При смещении кривой MN_i происходит постепенное приближение ее к границе устойчивости, что означает приближение точки N_i к точке С. Такое смещение приводит к рассогласованию рассматриваемых процессов, в результате чего появляются автоколебания параметров (рис. 11). Исследование этих колебательных процессов не является предметом рассмотрения данной работы.

Колебания, изображенные на рис. 11, облегчают переход системы в указанное выше низкоэнергетическое состояние. На этом рисунке представлены участки кривых на фазовой плоскости (nАТФ, рН), показанных на рис. 10, относящихся к исходному состоянию системы. Обозначения кривых те же, что и на предыдущем рисунке. Рассогласование процессов проявляется в том, что участки кривых не пересекаются в одной точке. За счет обратных связей между скоростями процессов и самими значениями параметров и за счет инерционности процессов, режим метаболизма системы будет характеризоваться непрерывным изменением как скоростей, так и значений самих параметров. Возникают их незатухающие колебания. Непрерывная смена значений рН и концентрации АТФ определяет на фазовой плоскости замкнутую траекторию. Процессы смены указанных величин существенно неравновесны, но среднее значение параметров за цикл «равновесно» в том смысле, что система ведет себя так, как будто строго гомеостатируется величина каждого из этих изменяющихся параметров. Соответственно, средние за цикл значения параметров рН и nАТФ для каждого отрезка кривых CD, K₁L₁ и MN_i, находятся на каждом из них. Таким образом, достигается стабилизация процессов. Значение параметров рН, nАТФ, С и их скоростей роста V⁺ и убыли V^- параметров стабилизированы в пределах значений точек траектории. Устойчивость будет нарушена, когда точка (nАТФ_ср, рН_ср) отрезка СD, соответствующая среднему значению концентрации АТФ за цикл, достигнет точки С и перейдет за нее. Последующий переход в низкоэнергетческое состояние может сопровождаться гемолизом эритроцитов, в зависимости от взаимного расположения точек К₁ и С. Чем выше ордината точки К₁ по сравнению с ординатой точки С, тем выше вероятность гемолиза, так как при таком расположении может нарушится баланс скоростей уменьшения и увеличения количества в мембране липидов в сторону преобладания скоростей уменьшения количества липидов. Подробное исследование не входит в данную работу.

Рассмотрим теперь неравновесный переход энергетического метаболизма эритроцитов на новый уровень. Обратимся к рис. 12. На нем представлены те же самые кривые, что на рис. 8.

Если неравновесными процессами изменить концентрацию АТФ и рН так, что соответствующая точка будет левее отрезка ВС, то возможен переход в устойчивое состояние, соответствующее точке Е. Поскольку под кривой АВСD преобладает скорость расхода АТФ, то последующее уменьшение концентрации АТФ приближает состояние эритроцита к устойчивой точке 1. Одновременно точка оказывается под кривой KL, где доминируют процессы распада липидов. Следовательно, при движении состояния системы к устойчивой точке 1, возможно достижение критически минимального значения количества липидов, когда клетка превратится в сферу и распадется. Вероятность распада тем больше, чем дальше точка находится от кривой KL.

Итак, для проведения теоретического исследования кинетики энергетического метаболизма эритроцитов in vivo с целью выяснения наличия устойчивых состояний и их числа за основу была выбрана основная физическая модель, предложенная в работе. Эта модель была нами дополнена элементами, приближающими рассмотрение метаболизма эритроцитов к in vivo. Дополненная (обобщенная) модель допускает существование второй устойчивой точки гомеостатирования параметров (рН, nАТФ и С) при низкой концентрации АТФ. Исследование выбранной модели позволило выяснить условия, при которых может происходить переход метаболизма эритроцитов из одной устойчивой точки в другую.

Для надежного установления этого факта необходимо провести экспериментальное исследование.

§ 2.3 Постановка экспериментальных задач

С целью экспериментальной проверки нашей гипотезы о возможности реализации двух устойчивых состояний метаболизма эритроцитов необходимо первоначально определить, каков их метаболизм эритроцитов in vitro после взятия пробы крови у пациента. Исследования необходимо проводить на цельной крови, что гарантирует наибольшее приближение к условиям in vivo. Для предотвращения свертывания крови следует использовать гепарин, добавление которого в кровь существенным образом не нарушает естественный ход процессов метаболизма эритроцитов. Возможно, при нарушении связи «кровь-организм» при взятии крови из организма будут протекать неравновесные процессы релаксации системы к новому состоянию. В конечном итоге метаболизм эритроцитов может оказаться в одном из двух, указанных выше, состояний.

§ 2.4 Неравновесные процессы, протекающие в плазме пробы крови после ее взятия у донора, приводящие к изменению метаболизма эритроцитов

Когда кровь находится в организме, все процессы метаболизма в эритроцитах согласованы, что соответствует точке 3 на рис. 8. После взятия пробы крови нарушается работа регуляторных механизмов, стабилизирующих процессы метаболизма клеток крови. Это происходит из-за распада сложных органических соединений в плазме крови в результате деятельности протеолитических ферментов (пептидаз). Поэтому для того, чтобы замедлить процессы ферментативного распада в лабораторной практике используют специальные вещества, ингибирующие эти процессы, — антипептидазы (ингибиторы протеолитических ферментов). Следствием деятельности пептидаз в плазме пробы крови является повышение ее осмолярности. В свою очередь такое повышение, если оно существенно по сравнению с уровнем осмолярности внутренней среды, гомеостатируемой в организме, может нарушить согласование равновесных процессов метаболизма эритроцитов, вызвав уменьшение объема эритроцитов. Соответственно, в плазме крови концентрации всех веществ, которые проходят через мембрану медленнее воды, понизятся, в том числе и концентрация глюкозы. Изменения объема эритроцитов и уровня глюкозы в плазме пробы крови можно контролировать с помощью известных приборов. В цитоплазме эритроцитов концентрации биологически активных веществ, таких как ферменты, регуляторные субстанции и др., не способных покинуть ее за время установления нового равновесия по воде, наоборот возрастут. Наиболее важным следствием протекания быстрых неравновесных процессов распада пептидов может оказаться повышение концентрации АТФ. Тогда дальнейшая цепочка причинно-следственных связей, приводящая к нарушению согласования метаболических процессов, будет следующая. Повышение концентрации АТФ вызовет усиление деятельности K⁺/Na⁺-АТФазы, которое приведет к повышению трансмембранной разности потенциалов. В свою очередь, такое изменение вызовет увеличение напряженности поля в липидах, а это, согласно работе М. В. Фока [15], приведет к уменьшению неспецифической проницаемости мембран эритроцитов для кислорода. Из-за высокой проницаемости цитомембран для ионов Н⁺ концентрации их между плазмой крови и цитоплазмой эритроцита устанавливаются практически в соответствии с соотношением Больцмана (4).

В организме рН плазмы крови гомеостатируется специальными системами, поддерживающими проточный гомеостаз баланса процессов подкисления (ацидоз) внутренней среды и ее подщелачивания (алкалоз). Алкалоз осуществляется, благодаря процессам, происходящим в легких, тонкой кишке и коже, а ацидоз обусловлен окислительными процессами во всех живых клетках. При взятии пробы крови связь между организмом и кровью в пробе прекращается. Генерируемая на мембране эритроцитов разность потенциалов между плазмой и цитоплазмой распределяется по буферной емкости указанных двух сред (~40% - плазма, ~60% - эритроциты). Поэтому, если какие-то процессы вызвали рост трансмембранной разности потенциалов, то рН плазмы крови понижается и, наоборот, при уменьшении трансмембранной разности потенциалов на мембране эритроцитов величина рН плазмы крови будет повышаться. Изменения величины рН плазмы крови можно контролировать с помощью известных приборов. Заметим, что после взятия пробы крови из организма плазма крови по вышесказанной причине подкисляется, и устанавливается новое равновесие по ионам Н⁺ между цитоплазмой и плазмой. рН плазмы при этом будет ниже, чем in vivo. Чем ниже установившееся значение рН плазмы крови, тем выше трансмембранная разность потенциалов на мембране эритроцитов пробы.