Перенос ДНК с помощью агробактерий

Другая, наиболее распространенная группа методов—трансформация с помощью A. tumefaciens или A. rhizogenes, имеющих генно-модифицированные плазмиды Ti или Ri.

Трансформация in vitro. При агробактериальных методах переноса используется, как правило, метод совместного культивирования эксплантов в течение некоторого времени (обычно 2—3 суток) с суспензией агробактерии (co-cultivation), а затем экспланты переносят для регенерации каллуса или прямого побегообразования на среду, содержащую антибиотики для подавления роста бактерий. Экспланты, используемые в таких экспериментах по трансформации, могут быть двух видов: большими гетерогенными или малыми гомогенными. Большие экспланты — это, как правило, участки органов, содержащих огромное число клеток: листья и стебли, сегменты гипокотилей и семядольные листья проростков, соцветия и различные части цветка, сегменты корней. Малые экспланты — микроспоры и проэмбрио, а также одиночные клетки, образовавшиеся из протопластов.

Этот метод достаточно универсален и пригоден для многих видов растений, хорошо образующих регенеранты. Таким способом к настоящему времени получено большинство трансгенных растений различных генотипов. Однако сложностей хватает и при использовании агробактериальной трансформации. Основными трудностями являются — отсутствие универсальных методов переноса генов в клетку, сложность получения соответствующих систем культуры тканей и регенерации растений, необходимость подбора соответствующего штамма агробактерии. Успех получения трансгенных растений зависит от множества факторов, поэтому в каждом конкретном случае приходится подбирать строго индивидуальные условия для каждого генотипа растения.

Трансформация in planta. Агробактериальную трансформацию можно проводить, инфицируя растения через поранение ткани какимлибо острым инструментом, на котором находятся агробактерии, например, уколов препаровальной иглой апикальную меристему проростка или пазушную почку растения. Побег, выросший из такой почки, затем срезают и высаживают на селективную среду, чтобы отобрать трансформированные растения.

Другой способ трансформации in planta — через нанесение суспензии агробактерий с активированными vir-генами на пестики цветков растений с последующим опылением пыльцой, собранной с других растений того же сорта. Так можно трансформировать, например, кукурузу или любое другое растение, имеющее достаточно большой пестик. В некоторых случаях проводят предварительную трансформацию пыльцевых зерен с дальнейшим опылением цветков. Для растений арабидопсиса, имеющих очень маленькие цветки, разработан метод трансформации путем опускания нераскрывшихся цветочных бутонов в агробактериальную суспензию. Дальнейший отбор трансформированных растений проводят, высевая образовавшиеся после трансформации семена в селективных условиях. Метод трансформации in planta имеет преимущество перед классической процедурой трансформации, поскольку при этом можно избежать некоторых стадий культивирования тканей и последующей регенерации. Однако этот метод очень трудоёмок, т.к. частота трансформации при его использовании очень мала и требуется проведение очень большого объема работ.