Генетическая изменчивость клеток in vitro

Гетерогенность культур клеток. Полученные от одного экспланта, помещенные в одинаковые условия температуры, влажности, освещенности, на одной и той же питательной среде, клетки в культуре, казалось бы, не должны различаться между собой. Но исследования показывают, что клеточные культуры гетерогенны (разнокачественны). В них наблюдаются морфологические и физиологические различия между клетками. Это проявляется на уровне формы и размера, числа ядер, степени вакуолизации, толщине стенок, активности метаболизма, способности к биосинтезу вторичных соединений. В культуре in vitro наряду с недифференцированными клетками присутствуют элементы сосудистой системы: трахеиды и ситовидные трубки и другие специализированные клетки. Клетки могут отличаться по продолжительности клеточного цикла, количеству запасных веществ и других продуктов вторичного метаболизма (рис. 1.9).

Рис. 1.9. Гетерогенность клеток в суспезионной культуре женьшеня.

Перечисленные выше вариации сильно зависят от условий выращивания клеток и, как правило, не наследуются. Такие изменения, не затрагивающие генома, называются модификациями. Они помогают клеткам адаптироваться при изменении условий выращивания. Но клетки в культуре in vitro могут быть неодинаковы и в генетическом отношении. Генетическая разнокачественность клеточных культур обусловлена изменениями на различных уровнях: геномном, хромосомном или генном. Геномная изменчивость подразумевает изменение числа хромосом, хромосомная — изменения структуры хромосом, а генная — мутации отдельных генов.

Вариации числа и структуры хромосом. Наиболее подробно исследованы геномная и хромосомная изменчивость культивируемых клеток растений. В процессе изолирования тканей из исходного растения нарушается гормональная регуляция, что приводит к аномалиям функционирования митотического аппарата. Из-за неправильного расхождения хромосом в митозе, задержки клеточного деления (цитокинеза) и других отклонений возникают полиплоидные (рис. 1.10) и анеуплоидные клетки (имеющие число хромосом, некратное гаплоидному набору), повышается частота хромосомных нарушений (аберраций) (рис. 1.11). Удвоение числа хромосом может быть результатом эндоредупликации генетического материала: клетки, находившиеся в исходном растении в G2 фазе, вместо митоза повторно вступают в S фазу. Затем такие клетки с удвоенным числом хромосом делятся и дают начало полиплоидным клонам. Другой причиной появления полиплоидных клеток является эндомитоз — процесс нерасхождения хромосом в анафазе из-за нарушения функции веретена деления.

Рис. 1.10. Диплоидный и тетраплоидный набор хромосом в культивируемых Crepis capillaries.

Рис. 1.11. Неправильное расхождение хромосом: образование «мостов».

Вариации числа хромосом регистрируются уже на ранних этапах культивирования. Например, в каллусах, производных от диплоидных клеток незрелых зародышей ячменя, а также мягкой и твердой пшениц, первые тетраплоидные клетки были обнаружены уже на третий-пятый дни после введения в культур), их частота в разных клеточных линиях составляла 1,6—8,7%. На восьмой день культивирования были обнаружены первые анеуплоидные метафазы. На примере каллусных культур, полученных из листовых дисков картофеля, показано, что удвоение числа хромосом происходит уже в первый день культивирования. По мере увеличения продолжительности культивирования доля полиплоидных клеток, как правило, возрастает. Иногда процесс полиплоидизации идет медленно, например, через 6 месяцев культивирования в каллусной культуре чеснока 90%, в каллусной культуре проса 76%, а в каллусной культуре ячменя 70% клеток оставались диплоидными. В других случаях число хромосом удваивалось быстро, так доля тетраплоидных метафаз в культурах пшеницы и ячменя могла достигать через 3—4 месяца 70—80% от общего числа проанализированных.

Значительно реже в процессе культивирования тканей происходит уменьшение числа хромосом. Тем не менее, явление гаплоидизации диплоидных эксплантов в культуре in vitro описано для фасоли и чеснока.

Наряду с изменением числа хромосом в культуре in vitro часто происходит модификация их структуры. Описаны потери (делеции), удвоение (дупликации) или поворот на 180° (инверсии) участков хромосом, перенос фрагмента одной хромосомы на другую (транслокации). Значительный прогресс в исследованиях хромосомной изменчивости был достигнут после разработки метода дифференциального окрашивания хроматина, позволяющего выделять суперспирализованные гетерохроматиновые участки хромосом. Расположение гетерохроматиновых блоков является характерным и устойчивым признаком, позволяющим идентифицировать отдельные хромосомы и регистрировать изменения их структуры (рис. 1.12).

Рис. 1.12. Дифференциальная окраска хромосом

В динамике хромосомной изменчивости важная роль принадлежит частоте возникновения измененных кариотипов и их избирательной выживаемости в определенных условиях среды. Различия между клетками по числу хромосом отражаются в скорости их роста, устойчивости к неблагоприятным воздействиям и т. д., определяющим селективную ценность того или иного генотипа. В результате клетки с разным числом хромосом вступают в конкурентные взаимоотношения, что приводит к отбору наиболее приспособленных к данным условиям культивирования генотипов. В этом отношении культуры клеток растений подобны природным популяциям животных или растений, в них также возникают мутации, и действует естественный отбор. Поэтому культивируемые клетки иногда называют клеточными популяциями. Если начальный период культивирования клеток in vitro характеризуется повышением уровня геномной и хромосомной изменчивости, то при длительном культивировании наблюдается стабилизация клеточных популяций на определенном уровне плоидности (рис. 1.13).

Рис. 1.13. Динамика изменения числа хромосом в клетках Haplopappus gracilis при длительном культивировании Процесс преимущественного размножения клеток определенного генотипа получил название автоселекции. В процессе автоселекции формируется наиболее приспособленный к данным условиям кариотип или кариотипы. В качестве примера можно привести длительно пассируемую культуру клеток конских бобов. Первоначально она состояла из примерно равного количества диплоидных и тетраплоидных клеток. Однако скорость размножения диплоидных клеток была выше вследствие более короткой лаг-фазы. После 40 месяцев культивирования данной культуры диплоидные клетки почти полностью вытеснили тетраплоидные (рис. 1.14).

Иногда в стабилизированных популяциях присутствуют клетки в основном одного класса плоидности. Имеется достаточно примеров, когда полиплоидные и анеуплоидные клеточные линии постепенно превращаются в диплоидные. Но чаще культуры становятся стабильно разнородными, они содержат клетки разной плоидности, анеуплоидные, при этом соотношение метафаз с разным числом хромосом остается относительно постоянным. Такие популяции называют миксоплоидными. Рекордсменом по стабильности миксоплоидного состояния является культура клеток женьшеня, поддерживаемая с 1960 г. и сохраняющая более 50 лет примерно одно и то же распределение клеток по числу хромосом. По-видимому, гетерогенность по числу хромосом предпочтительна для большинства клеточных популяций, так как она позволяет быстро реагировать на изменение условий преимущественным размножением наиболее приспособленного типа клеток.

Рис. 1.14. Стабилизация популяции клеток конских бобов на диплоидном уровне.

U 1 месяц? 4 месяца? 18 месяцев.

Мутации отдельных генов. Большинство генных мутаций не имеет внешнего проявления на уровне культивируемых клеток, под микроскопом мутантные клетки не отличаются от немутантных. Чтобы обнаружить изменения отдельных генов, культуры выращивают в селективных условиях, способствующих росту только мутантных клеток, или используют молекулярно-генетические методы анализа ДНК. В культурах клеток растений применяют такие селективные системы как устойчивость к токсичным аналогам аминокислот и аналогам оснований нуклеиновых кислот, антибиотикам, стрессовым факторам, гербицидам, фитотоксинам, используют также системы прототрофности и ауксотрофности по фитогормонам, витаминам, аминокислотам, т. е. отбирают клетки, способные или, наоборот, неспособные расти на среде без этих веществ.

Исследуемые клетки растений высевают в чашки Петри на поверхность агаризованной селективной среды или смешивают с расплавленной и остуженной до 45 °C агаризованной средой. После застывания питательной среды клетки оказываются закрепленными на определенных местах. На фоне гибели чувствительных клеток устойчивые начинают делиться и дают начало клону (рис. 1.15). Разделив количество образовавшихся клонов на количество высеянных на чашку клеток, можно определить частоту мутантных клеток в данной культуре. Как показали эксперименты, частота мутантных по определенному гену клеток, выявляемых таким образом, варьирует для разных видов растений и разных признаков от 1(У⁵ до 10~⁸. Однако описаны отдельные случаи, когда мутации в культуре in vitro возникали гораздо чаще.

зо.

Рис. 1.15. Схема отбора мутантных клеток

Развитие методов молекулярной биологии позволяет анализировать непосредственно изменения в структуре ДНК. Было показано, что сильно подвержены изменчивости в культуре in vitro повторяющиеся последовательности, которые составляют около 60% генома типичных растений. Вариабельность повторяющихся последовательностей у клеточных культур проявляется, главным образом, в увеличении или уменьшении числа копий. Уникальные последовательности, кодирующие определенные белки, также иногда амплифицируются в культуре in vitro. Для генов, которые не могут существенно менять свою экспрессию, механизм амплификации и деамплификации является способом регуляции количества продукта. Показано, что устойчивость к гербициду фосфинотрицину у клеточной линии люцерны была следствием 4—11-кратной амплификации гена глютамин-синтазы. Устойчивость к другому гербициду глифосату у клеток табака достигалась за счет амплификации по крайней мере двух генов. Амплифицированное состояние этих генов сохранялось в отсутствии селективного давления, доказывая стабильность этого изменения.

Было показано, что изменчивости in vitro подвержен не только ядерный геном, но и гены хлоропластов и митохондрий. У большинства растений митохондриальная ДНК (мтДНК) существует в виде гетерогенной популяции кольцевых молекул. Наличие повторов, которые действуют как сайты гомологичной рекомбинации, делает популяцию субгеномных молекул мтДНК очень лабильной. При введении в культуру in vitro нередко появляются новые фрагменты мтДНК и изменяется соотношение уже существующих.