Трансформация микробных клеток

На основе генно-инженерных методов можно конструировать микробные клетки, способные синтезировать структуры растительного и животного происхождения, имеющие важное значение для медицины и промышленности.

Инсулин играет основную роль в лечении диабета — болезни, по распространенности занимающей третье место после сердечно-сосудистых заболеваний и рака. Получение этого гормона генно-инженерным способом представлялось весьма перспективным и было выполнено в начале 80-х гг. XX столетия. В качестве компетентной клетки использовали Е. coli, гены обеих цепей молекулы человеческого инсулина были получены методом химического синтеза. Эти гены присоединяли к З'-концу гена, кодирующего белок р-галактозидазу, и вводили в векторную плазмиду. Трансформированные клетки Е. coli

синтезировали химерные белки, состоящие из Аили В-цепи инсулина, присоединенной через метионин к р-галактозилазс. При помощи бромциана, специфически расщепляющего белки по остатку метионина, выделяли индивидуальную цепь инсулина. Далее цепи соединяли в единую активную молекулу инсулина. Образование дисульфидных цепей in vitro явилось лимитирующей стадией всего процесса, причем выход был незначительным. В связи с этим был разработан метод получения проинсулина человека с последующим созреванием его in vitro. Были синтезированы несколько десятков олигонуклеотидов, соединенных затем при помощи ДНК-лигазы. Полученные двухцепочечные фрагменты ДНК, соответствующие гену, кодирующему человеческий инсулин, были встроены в плазмиду, а затем перенесены в Е. со//(рис. 31.5).

Полученные рекомбинантные клетки синтезировали проинсулин, который затем in vitro превращали в зрелый инсулин. В настоящее время генно-инженерный инсулин широко применяется в медицинской практике.

Соматотропин — гормон роста — играет существенную роль в постнатальном развитии организма, контролируя многие стороны углеводного, липидного и минерального обменов. Дефицит гормона приводит к карликовости, лечение которой проводится посредством соматотропинотерапии. В отличие от инсулина соматотропин обладает видовой специфичностью, и до недавнего времени его выделяли из гипофиза трупов. Выраженная гетерогенность этого гормона негативно сказывалась на его фармакологическом эффекте. Получение генно-инженерного соматотропина явилось решением проблемы обеспечения медицины этим препаратом.

Рис. 31.5. Получение инсулина человека генно-инженерным метолом (по В. А. Ефимову).

Процедура получения генно-инженерного гормона проводилась с учетом того, что просоматотропин нс подвергается процессингу в бактериальной клетке. Был использован комбинированный метод получения гена соматотропина. Фрагмент ДНК, кодирующий первые 23 аминокислотных остатка с N-конца, был получен методом химико-ферментативного синтеза, а олигонуклеотид, кодирующий остальные аминокислотные остатки гормона, представлял собой кДНК, полученную посредством обратной транскриптазы на матрице мРНК. Затем оба фрагмента объединяли в одной плазмиде и переносили в Е. coli. Образованный гормон обладал биологической активностью, сопоставимой с гипофизарным соматотропином.

Интерфероиы — низкомолекулярные белки, обладающие выраженной противовирусной активностью. Кроме того, интерфероны проявляют фармакологический эффект при таких заболеваниях, как гепатит В, рассеянный склероз, некоторые локализации опухолей. Различают три класса интерферонов по месту их синтеза в клетках человека и животных: а-интерферон из лейкоцитов, p-интерфсрон из фибробластов и у-интерферон из тимуса, а-Интерферон является простым белком, ри у-белки — гликозилированы. Интерферон является одним из самых эффективных средств лечения вирусных инфекций, но он видоспецифичен и может быть получен только из клеток человека. Технология выделения и очистки интерферонов малоэффективна прежде всего из-за крайне малого выхода конечного продукта. Поэтому получение генноинженерного продукта является перспективной альтернативой традиционным методам выделения интерферона.

Впервые ген интерферона был введен в бактериальную клетку Е. eoli около 20 лет назад, и в последующие годы техника генно-инженерных процедур постоянно совершенствовалась. Лейкоцитарный интерферон был получен на основе трансформированных клеток Е. coli следующим образом. Ген интерферона получали химико-ферментативным методом. Одной из трудностей, которую пришлось преодолеть, было то, что интерферон синтезируется в виде предшественника с дополнительной (сигнальной) последовательностью аминокислотных остатков. Бактериальные клетки нс имеют протеиназ, превращающих предшественники в зрелые белки, поэтому надо было синтезировать ген, кодирующий только зрелый интерферон. Такой ген в конце концов был получен и введен в клетку ?. coli. Рекомбинантный штамм синтезировал в больших количествах интерферон, обладающий выраженной биологической активностью. Значительным событием явилась удачная попытка введения гена интерферона в дрожжевые клетки. Ген, кодирующий интерферон, был получен с помощью мРНК и обратной транскриптазы. кДНК а-интерферона соединили с олигонуклеотидом, кодирующим алкогольдегидрогеназу дрожжей и встроили в плазмиду. Плазмиду, нагруженную чужеродными генами, ввели в дрожжевую клетку Saccharomyces cerevisiae. Замена промотора гена человеческого интерферона на ген дрожжевой алкогольдегидрогеназы обеспечила эффективную экспрессию гена интерферона. Замена бактериальной клетки в качестве реципиента на дрожжевую сыграла огромную роль для всей генноинженерной техники вообще и для получения интерферонов в частности. Дело в том, что ри у-интерфероны представляют собой гликозилированные белки, а процесс гликозилирования невозможен в Е. coli, но вполне осуществим в дрожжевой клетке.