Жидкостная хроматография. 
Технические измерения и приборы в 2 т. Том 2 в 2 кн. Книга 1

Жидкостная хроматография — это метод разделения и анализа сложных смесей веществ, в котором подвижной фазой служит жидкость. Её применяют для разделения более широкого круга веществ, чем метод газовой хроматографии, поскольку большинство веществ не обладает летучестью, многие из них неустойчивы при высоких температурах (до 300 °С) (особенно высокомолекулярные соединения) и разлагаются при переводе в газообразное состояние. В жидкостной хроматографии разделение чаще всего происходит при комнатной температуре. Её особенности обусловлены наличием жидкой подвижной фазы. Применяя различные подвижные фазы, можно изменять параметры удерживания и селективность хроматографической системы. Возможно также использование градиентного элюирования. Селективность жидкостной хроматографии в отличие от газовой определяется природой не только неподвижной фазы, но и подвижной.

Модернизация аппаратуры, применяемой в классической жидкостной колоночной хромато1рафии, привела к разработке ВЭЖХ.

Скорость сорбции возрастает при увеличении поверхности сорбента, следовательно, надо применять мелкозернистый, пылевидный сорбент, при этом резко растёт гидравлическое сопротивление, поэтому колонку уменьшают в диаметре до 1 мм и до нескольких сантиметров в длину. Такие колонки обладают высокой разделяющей способностью (40 — 150 тысяч теоретических тарелок на 1 м), в сотни раз превышающей аналогичные характеристики обычных колонок. Но для этих колонок требуются насосы малой производительности, создающие большие давления — до 50 МПа.

Температура хроматографической колонки может быть комнатной, что позволяет хроматографировать белки, аминокислоты и другие термически нестойкие соединения. Молярная масса разделяемых веществ может достигать -2.000.

Комплект современного оборудования для ВЭЖХ, как правило, состоит из двух насосов 3, 4 (рис. 8.7), управляемых контроллером 5 и подающих подвижную фазу по определённой программе. Состав и скорость подачи жидкости-носителя в ходе анализа может изменяться линейно, экспоненциально или каким-либо образом в зависимости от условий анализа. Проба вводится через специальное устройство (инжектор, франц. injcctcur, от лат. injicio — вбрасываю) 7 непосредственно в поток жидкости. После прохождения через хроматографическую колонку 8 вещества детектируются высокочувствительным проточным детектором 9, сигнал которого регистрируется и обрабатывается микроЭВМ 11. При необходимости автоматически в момент выхода пика отбираются фракции.

Насос элюента, создающий давление до 50 МПа при расходе элюента 1 мл/мин, — одна из самых важных и дорогих деталей ионного ВЭЖХ. Дело в том, что малейшие пульсации давления, а следовательно, и расхода элюента, воспринимаются детектором как изменения концентрации и записываются на хроматограмме. При высоком уровне пульсации хроматограмма становится нечитаемой.

Рис. 8.7. Схема жидкостного хроматографа:

1,2- сосуды с жидкостью; 3,4- насосы; 5 — контроллер; б — смесительная камера; 7 — инжектор; 8 — колонка; 9 — детектор; 10 — регистратор; 11- блок автоматической обработки результатов анализа; 12 — коллектор фракций; 13 — термостат На рис. 8.8 показан насос с двухголовочной системой, обеспечивающий при давлении до 420 агм расход элюента 0,01 9,99 мл/мин.

Рис. 8.8. Насос ВЭЖХ.

Ионная хроматография представляет собой ионообменную хроматографию при последовательном использовании двух колонок с кондуктометрическим детектированием. Этот метод распределения, но существу хемосорбционный, позволяет применить весь арсенал химических реакций. В основу ионной хроматографии положено элюснтнос ионообменное разделение ионов на первой (разделяющей) колонке с последующим подавлением фонового сигнала элюента на второй (подавляющей) ионообменной колонке. Линейная зависимость кондуктометрического сигнала от концентрации ионов сохраняется в широком диапазоне концентраций (0,01 — 100 мг/мл), поэтому метод позволяет определять как микро-, так и макрокомпоненты анализируемой пробы.

Ионная хроматография получила широкое распространение для определения неорганических и органических ионов в промышленных объектах, окружающей среде, биологических и других объектах.

Распространение ионной хроматографии обусловлено рядом её достоинств, а именно:

• — низкий предел обнаружения (~10 ³ мкг/мл). Применение концентрирующей колонки позволяет снизить предел обнаружения еще на 2 — 3 порядка, т. е. до КГ⁶ — 10 ⁵ мкг/мл;
• — высокая селективность определения ионов в сложных смесях, а также возможность одновременного определения неорганических и органических ионов;
• — быстрота определения — в течение 20 минут из одной пробы можно определить до 10 ионов;
• — широкий интервал определяемых концентраций;
• — малый объём пробы (0,1 — 0,5 мл);
• — несложная подготовка пробы к анализу.

Принцип метода можно продемонстрировать на примере определения катионов щелочных металлов. В разделяющей колонке используют сильнокислотный катионит низкой ёмкости в 1 Г форме, а в подавляющей — сильноосновный анионит высокой ёмкости в ОН форме. Элюентом является разбавленный раствор НС1 (~10 ³ М). Разделённые на первой колонке ионы поступают вместе с элюентом во вторую колонку, где происходит обмен хлорид-ионов на ионы гидроксила, которые, взаимодействуя с водородными ионами НС1, образуют воду. Таким образом, снижается фоновая электропроводность элюента, и в детектор поступают гидроксиды щелочных металлов на фоне деионизированной воды. Процессы, протекающие на колонках, можно описать так:

При определении анионов в разделяющей колонке часто используют сильноосновный анионит в НССЬ форме, а в подавляющей колонке — сильнокислый катионит высокой ёмкости в Н* форме. Элюентом в этом случае является разбавленный раствор NaHCCb (~10″ ³ М), а разделённые анионы детектируют в виде сильных кислот на фоне малодиссоциированной кислоты Н₂СОз.

В этом случае процессы, протекающие на колонках, можно представить следующей схемой:

К недостаткам метода можно отнести необходимость периодической регенерации смолы подавляющей колонки.

Высокая эффективность разделения обусловлена свойствами ионообменных разделяющих смол. В разделяющих колонках используют смолы, представляющие собой поверхностно модифицированные сополимеры стирола и дивинилбензола с размером зёрен 40 — 60 мкм.

Хромато-масс-спекгрометрия заключается в том, что капиллярную газожидкостную хроматографию, обладающую высокой разделяющей эффективностью и селективностью, объединяют с масс-спектрометрическим анализом, что позволяет получать детальную информацию о строении молекул и воспроизвести структурную формулу исследуемого вещества.

Сущность данного комбинированного метода состоит в следующем. Анализируемая газообразная проба, попадая из газового хроматографа (минуя детектор) в масс-спсктромстр, ионизируется: из молекул выбиваются электроны. При этом происходит фрагментация молекулы — её распад на отдельные положительно заряженные части («осколки») с различной массой. Эти положительно заряженные частицы ускоряются электрическим полем масс-спектрометра и затем попадают в магнитное поле, иод действием которого они отклоняются по-разному, в зависимости от их массы, и разделяются на пучки, каждый из которых включает только частицы одинаковой массы. Детектор массспектрометра регистрирует эти пучки в виде масс-спектра (см. гл. 12).

Метод обладает чувствительностью 1(Г¹² — К)³ г/с, погрешность определения обычно нс превышает 3%.

Однако если смесь содержит более двух веществ, то результирующий суммарный масс-спектр становится настолько сложным, что его трудно однозначно интерпретировать.