Изучение потребностей прокариот в питательных веществах

Введение

Микробиология в своем развитии зачастую опирается на химическую и биохимическую основы. Перед культивированием и изучением микроорганизмов необходимо установить тип и особенности питания данного вида, его потребности в источниках биогенных элементов. Каждый вид микроорганизмов имеет свои потребности в питательных веществах, следовательно, и особый состав питательных сред для культивирования, свою экологическую нишу в природе.

Прокариоты — это надцарство организмов, которые имеют свои особенности. Клетки прокариот не имеют оформленного ядра и других внутренних мембранных органелл. К прокариотам относят архебактерии и эубактерии. Они различны по месту обитания, и особенностям метаболизма.

Целью данной работы является изучение потребностей прокариот в питательных веществах. Основные задачи заключаются в рассмотрении разнообразия источников питания прокариот, анализе связи между питанием и метаболизмом, определение факторов наибольшей продуктивности и роста, изучение универсальных и специальных сред.

Объектом изучения являются различные неорганические и органические вещества, которые могут служить источником питания для прокариот. Так, в данной работе будут рассмотрены источники основных биогенных химических элементов, которые нужны для построения и функционирования прокариотической клетки.

Знания о потребностях в питательных веществах прокариот используется на биотехнологических производствах, в научных лабораториях. С помощью таких знаний можно найти самые дешевые источники питания, и таким образом, удешевить микробиологическое производство, а также достичь максимальной продуктивности.

1. Источники углерода Все соединения, из которых построены живые организмы — это соединения углерода. Углероду принадлежит основная роль в конструктивном метаболизме. Прокариоты способны воздействовать на любое углеродное соединение, т. е. использовать его в своем в своем метаболизме. В зависимости от источника углерода все прокариоты делятся на две группы: автотрофы, к которым принадлежат организмы, способные синтезировать все компоненты клетки из углекислоты или других неорганических соединений, и гетеротрофы, источником углерода для конструктивного метаболизма которых служат органические соединения. Следует отметить, что в мире прокариот не существует резкой границы между автои гетеротрофными организмами [1, 2, 3].

1.1 Неорганические соединения углерода К самым распространенным неорганическим соединениям углерода относят СО₂ и СО, а также углекислоту и соли углекислоты — карбонаты.

Углекислый газ в качестве субстрата используют хемолитотрофы и фототрофы.

Хемолитотрофы в качестве единственного источника углерода используют СО₂ и превращают его в клеточный материал, используя энергию ATP и восстановительные эквиваленты, полученные при окислении неорганических субстратов. Такие микроорганизмы часто называют С-автотрофами. Фиксация СО₂ у хемолитотрофов осуществляется в результате цикла Кальвина. К таким бактериям относят цианобактерии.

Так же двуокись углерода в качестве источника углерода используют фототрофные бактерии трех семейств: Rhodospirillaceae (пурпурные несерные бактерии), Chromatiaceae (пурпурные серобактерии) и Chlorobiacaeae (зеленые бактерии).

Цианобактерии восстанавливают СО₂ водой, а пурпурные и зеленые бактерии — сероводородом и газообразным водородом; или пурпурные — органическими соединениями. При этом в процессе фотосинтеза цианобактерии выделяют кислород, а пурпурные и зеленые бактерии его не выделяют и фотосинтез у них происходит в анаэробных условиях.

Метанобразующие бактерии способны анаэробно сбраживать СО₂ с водородом по реакции:

СО₂+4Н₂>СН₄+2Н₂О

К хорошо изученным бактериям, имеющим такую способность относят Methanobacterium ruminantium, Methanobacterium thermoautotrophicum и Methanobacterium MoH [5, 6].

Угарный газ для большинства микроорганизмов является ядом, поскольку инактивирует цитохромоксидазы. Но есть виды, которые растут в аэробных условиях в присутствии СО: Hydrogenomonas carboxydovorans и Seliberia carboxyhydrogena (обе бактерии сейчас относят к роду Pseudomonas). СО окисляется до СО₂, а перенос освобождающихся электронов на кислород сопровождается синтезом ATP. При окислении угарного газа используется особая, не чувствительная к CO цитохромоксидаза. Данные бактерии называют карбокситрофными [5, 7].

1.2 Органические соединения углерода

1.2.1 Углеводороды и их производные Метанотрофы в качестве источника углерода используют метан. Окисление метана осуществляется в последовательности реакций:

СН₄> СН₃ОН> НСНО> НСООН> СО₂

Ассимиляция углерода С₁-соединений метанотрофами происходит в основном на уровне формальдегида и углекислого газа. У данных бактерий существуют два циклических пути ассимиляции углерода метана: рибулозомонофосфатный и сериновый пути. Так же, метанотрофы способны использовать в качестве дополнительного источника углерода СО₂, причем у бактерий, которые используют сериновый путь, эта способность выражена сильнее. Кроме метана и диоксида углерода, метанотрофы способны к утилизации метанола.

Факультативные метанотрофы кроме метана и его производных могут использовать полиуглеродные соединения в качестве источника углерода и энергии. Однако их способность к росту за счет метана однозначно не доказана.

Метилотрофные бактерии используют метанол, а также его производные (не имеющие С-С связей) в качестве основного источника углерода. К таким бактериям относят Methylobacterium organophilum, представители Hiphomicrobium [5, 8].

Метанобразующие бактерии используют в качестве субстрата (кроме СО₂) формиат, метанол, и ацетат. Формиат сначала превращается в СО₂ и водород, а потом только в метан. Метанол — хороший субстрат для Methanosarcina barkeri, является прямым предшественником метана. Ацетат относится к наиболее важным субстратам для образования метана в озерных осадках. Он превращается Methanosarcina barkeri, Methanospirillum hungatii и некоторыми другими метанобразующими бактериями в метан и СО₂.

На этане, пропане, бутане и углеводородах, содержащих до восьми атомов углерода способны расти относительно немного видов бактерий (микобактерии, флавобактерии, Nocardia). Использование же углеводородов с длинной цепью распространено у микроорганизмов широко, и н-алканы с 10−18 атомами углерода используются очень часто и с огромной скоростью. Среди бактерий это Pseudomonas fluorescens, Mycobacterium smegmatis, Nocardia petroleophila и др.

Этанол в качестве субстрата используют уксуснокислые бактерии. При этом одни виды (напр.Gluconobacter suboxydans) выделяют ацетат во внешнюю среду, так как не способны его утилизировать, а другие используют ацетат и окисляют его до СО₂, в условиях недостатка этанола. Кроме этанола, уксуснокислые бактерии окисляют большое число других спиртов (пропанол, изопропанол, глицерол) до соответствующих кислот и кетонов.

Стоит отметить, что питательная ценность источников углерода зависит от степени окисления атома С в соединении. Для большинства микроорганизмов лучшие источники углерода — органические соединения, содержащие частично окисленные атомы углерода. Значительно хуже ассимилируются вещества с большим количеством полностью восстановленных углеродов. Почти совсем не усваиваются органические соединения, содержащие углерод только в форме карбоксилаСООН.

Бактерии, которые используют данные источники углерода, являются специализированными. Они растут на определенном источнике, и имеют специализированные метаболические пути для их усвоения [9, 10].

1.2.2 Ароматические соединения Ряд бактерий способны расщеплять гентизиновую кислоту (рис.1), образуя в результате фумарат и пируват.

Рис 1.2.2.1 — Гентизиновая кислота [5]

Существует целый ряд ароматических соединений, которые под действием бактерий превращаются в катехол и протокатеховую кислоту. На рис. 2 и 3 показаны катаболические пути, ведущие к образованию катехола и протокатехоловой кислоты.

Рис 1.2.2.2 — Соединения, которые могут быть превращены в катехол [5]

Рис 1.2.2.3 — Ароматические и гидроароматические соединения, которые могут быть превращены в протокатеховую кислоту [5]

Катехол и протокатеховая кислота могут метаболизироватся в ходе орто-расщепления и мета-расщепления. Конечным продуктом является сукцинат. Разрыв ароматического кольца осуществляют диоксигеназы. При этом в субстрат включается молекулярный кислород.

Некоторые бактерии способны расщеплять полициклические углеводороды: нафталин, антрацен и фенантрен. Если выращивать бактерии на среде, содержащей одно из этих соединений, то можно часто наблюдать выделения в культуральную жидкость салициловой кислоты.

При благоприятных условиях даже асфальт подвергается разложению, хотя и очень медленно. В почве, населенной микроорганизмами, окисляется даже графит [5, 11].

1.2.3 Углеводы Большинству бактерий в качестве источника углерода нужны углеводы. Такие виды бактерий являются самыми распространенными. Углеводы усваиваются в виде D-изомеров, что является очень важным, так как мало бактерий имеют ферменты (рацемазы), способные превращать один оптический изомер в другой [7, 10].

Углеводы в качестве основного субстрата используют практически все гетеротрофные бактерии. Наиболее универсальным субстратом для культивирования бактерий является глюкоза. Способность усваивать разные углеводы является диагностическим признаком. Существуют специальные среды с индикаторами для определения потребления того или иного углевода видом бактерий [10, 12].

Углеводы выступают не только источником углерода для клетки, но и источниками энергии. Бактерии окисляют углеводы до органических кислот, или СО₂ для получения энергии; также используют углеводы как строительный материал. Например, Escherichia coli использует глюкозу и для получения энергии, и для построения клеточных фрагментов (рис.1).

Рисунок 1.2.3.1 — Схема использования глюкозы клеткой E. coli [5]

Транспорт глюкозы в клетку происходит с помощью фосфоенолпируватглюкоза-фосфотрансферазной системы. Далее глюкоза-6-фосфат расщепляется по пути Эмбдена-Мейергофа-Парнаса до пирувата. Этот путь впервые был открыт в мышечных тканях, еще его называют гликолизом. Гликолиз является универсальным путем катаболизма глюкозы [5, 14].

У аэробных бактерий гликолиз составляет первую стадию полного аэробного расщепления глюкозы до СО₂ и воды. Образовавшийся при гликолизе пируват потом теряет СО₂, а оставшийся двухуглеродный фрагмент включается в ацетил-КоА, и далее полностью окисляется до СО₂ и Н₂О в цикле лимонной кислоты. За таким механизмом усваивают глюкозу строго аэробные бактерии, могут и факультативно анаэробные [5, 15].

Анаэробные бактерии, которые после этапа гликолиза восстанавливают пируват до лактата — молочнокислые бактерии. Молочная кислота, образующаяся в результате их деятельности, вызывает скисание молока. Молочнокислое брожение протикает по двум путям: гомоферментативному и гетероферментативному. По особой схеме расщепляют глюкозу бифидобактерии.

Бактерии рода Zymomonas способны превращать глюкозу в этиловый спирт. Но превращении глюкозы в пируват у них идет по пути Энтнера-Дудорова. Sarcina ventriculi (строгий анаэроб) и Erwinia amylovora (факультативная анаэробная энтеробактерия) сбраживают глюкозу до этанола и СО₂ по гликолитическому пути, а также образуют побочные продукты в малых количествах: ацетат, молекулярный водород и лактат. 5, 14]

Некоторые облигатные анаэробы в качестве основного продукта брожения образуют бутират; к ним относятся представители четырех родов: Clostridium, Butyrivibrio, Eubacterium, Fusobacterium. Когда процесс брожения проходит на половину и рН среды снизился до 4,5, образуются новые продукты: ацетон и бутанол.

Также в ходе пропионовокислого и янтарнокислого брожения из глюкозы образуются пропионат, ацетат и СО₂. Предпочтительным субстратом для пропионовокислых бактерий является лактат. 5, 16]

Фруктоза также служит хорошим субстратом для многих бактерий. Как и в случае глюкозы, поступление фруктозы в клетки обеспечивается фосфоенолпируват-фосфотрансферазной системой. Однако в этом случае в клетке образуется фруктозо-1-фосфат, а не фруктозо-6-фосфат. Синтез фермента 1-фосфофруктокиназы специфически индуцируется фруктозой. При брожении фруктозы образуются лактат, ацетат, СО₂. Leuconostoc mesenteroides сбраживает фруктозу с образованием маннитола.

Гетероферментативные лактобациллы L. brevis и L. buchnery не могут расти в анаэробных условиях в присутствии глюкозы, зато могут в присутствии фруктозы.

Для использования лактозы, клеткам E. coli требуются дополнительные ферменты, образование которых индуцируется только при наличии в среде лактозы. Причем индукция происходит тогда, когда в питательной среде исчерпана глюкоза. Лактозопермеаза транспортирует лактозу в клетку, а в-галактозиада гидролизирует ее до галактозы и глюкозы [5, 17].

Сахарозу могут использовать многие бактерии. Например, молочнокислые бактерии растут на питательных средах с сахарозой, и синтезируют из нее внеклеточные полисахариды: декстран и леван.

Мальтозу могут использовать те организмы, которые используют и глюкозу. Но они должны иметь фермент мальтазу для расщепления мальтозы вне клетки, или соответствующие пермеазы для фосфоролитического расщепления в клетке [11, 18].

Пентозы бактерии способны утилизировать пентозофасфатном пути. По этому пути возможно превращение пентозофосфатов в гексозофосфаты и наоборот. Пентозофосфаты являются предшественниками нуклеотидов и нуклеиновых кислот в клетке. Среди пентоз наиболее широко потребляемым сахаром является ксилоза [10, 11, 19].

Рафинозу способны использовать в качестве субстрата бактерии кишечника человека (включая E. coli), в процессе расщепления в довольно больших количествах образуются газы: водород, диоксид углерода и метан.

Бактерии способны потреблять целлюлозу. Для расщепления таких больших молекул, бактерии сначала выделяют экзоферменты, и гидролизируют субстрат вне клетки. В почве целлюлозу разлагают аэробные и анаэробные бактерии. У таких видов бактерий в наборе ферментов преобладают целлюлитические ферменты, гидролизирующие целлюлозу до глюкозы. Аэробные бактерии выделяют много слизи, живут преимущественно в почве. В анаэробных условиях целлюлозу расщепляют чаще всего мезофильные и термофильные клостридии. Бактерии, которые живут в рубце жвачных животных, перерабатывают полимерные углеводы кормов в жирные кислоты и спирты. Продуктами анаэробного расщепления в почве являются этанол, уксусная, муравьиная и молочные кислоты, Н₂ и СО₂.

Крахмал бактерии могут расщеплять тремя способами: 1) фосфоролиз, 2) гидролиз и 3) трансгликозилирование. Фосфоролиз катализирует фермент б-1,4-глюканфосфорилаза, которая отщепляет по одной молекуле глюкозо-1-фосфата. Фосфорилазы играют решающую роль при мобилизации накопленных в клетках полисахаридов. Гидролиз катализируют амилазы вне клетки. У многих микроорганизмов имеется б-амилаза (эндоамилаза) и амило-1,6-глюкозидаза. Продуктами расщепления, кроме мальтозы, также олигомеры, содержащие от 3 до 7 остатков глюкозы.

Подавляющее большинство микроорганизмов не способно расщеплять агар. Лишь из морской воды и водорослей было выделено несколько видов бактерий, которые его гидролизуют. Виды, способные расщеплять агар, есть в родах Cytophaga, Flavobacterium, Bacillus, Pseudomonas, Alcaligenes.

Хитин способны использовать многие почвенные и водные бактерии. Они воздействуют на хитин экзоферментами: хитиназой и хитобиазой. При этом образуются хитобиозы, хитотриозы и N-ацетилглюкозамин.

Бактерии могут разрушать и лигнин. Однако его разложение проходит настолько медленно, что представляется совершенно ничтожным в сравнении с другими метаболическими процессами бактерий. Можно получать накопительные культуры Flavobacterium, Agrobacterium, Pseudomonas на частично переваренных препаратах лигнина [11, 20, 21, 22, 23].

1.2.4 Липиды, белки и другие вещества Известны некоторые бактерии (например, рода Pseudomonas), для которых источником углерода служат липиды. В результате гидролиза липидов ферментом липазой образуются глицерин и жирные кислоты. Оба эти компонента, или один из них могут быть источником углерода.

Жирные кислоты, имеющие среднюю длину цепей с 4… 12 атомами углерода, могут расщепляться бактериями до метилкетонов, которые имеют характерный вкус и запах.

Бактерии, обладающие специальными протеолитическими ферментами способны расщеплять и белки. К таким бактериям относятся роды Bacillus, Pseudomonas, Micrococcus, Serratia, Proteus, Achromobacter. Они встречаются во многих пищевых продуктах, так как способны одновременно расщеплять белки, жиры и углеводы [22]

Белки и части животных клеток потребляют паразиты и сапрофиты. Они могут использовать углеродный скелет аминокислот для пополнения запаса углерода.

Пектин может расщеплятся бактериями. Для этого необходимы пектолитические ферменты: эстеразы и деполимеразы. Пектинэстеразы разрывают эфирные связи, в результате чего высвобождаются метанол и полигалактуроновые кислоты, расщепляемые специальными гидролазами до олигомеров и мономеров D-галактуроновой кислоты, которые сбраживаются по типу маслянокислого брожения. Наиболее активно используют пектин бактерии Bac. macerans и Bac. polymyxa [11, 22].

Известно около миллиона соединений углерода. Прокариоты способны воздействовать на любое известное углеродное соединение, т. е. использовать его в своем метаболизме. Именно эта способность и объясняет такое широкое распространение бактерий в природе.

прокариотический клетка микроорганизм биогенный

2. Источники азота

2.1 Неорганические соединения азота Природный азот бывает в окисленной и восстановленной форме. Подавляющее большинство прокариот усваивает азот в восстановленной форме. Среди неорганических соединений таковыми являются соли аммония. Окисленные формы азота, нитраты и нитриты, также могут потребляться многими прокариотами. Так, как азот в конструктивном клеточном метаболизме используется в форме аммиака, нитраты перед включением в органические соединения должны быть восстановлены. Некоторые бактерии способны усваивать молекулярный азот из атмосферы, состояние окисления которого 0 [1, 3, 19].

Эволюционно первыми потребителями N₂ стали цианобактерии. Лишь позднее возникли свободноживущие бактерии и микробы-симбионты, способные усваивать молекулярный азот. К свободноживущим аэробным азотфиксаторам относятся азотобактеры. Из анаэробов азотофиксаторы известны среди клостридий, цианобактерий, фотосинтезирующих бактерий. Азотофиксатора-симбионты, ризобактерии и другие — выявлены в клубеньках бобовых растений, тропических растений, трав, деревьев ольхи. Способность к фиксации азота присуща только прокариотам. Некоторые азотфиксирующие микроорганизмы перечислены в таблице 2.1.1 [5, 6, 13].

Таблица 2.1.1 Представители азотфиксирующих бактерий [5]

Ферментная система, катализирующая реакцию восстановления N₂ до аммиака, называется нитрогеназой. Нитрогеназа состоит из двух белков, которые содержат железо, молибден, серу и кислотолабильный сульфид. Молекула N₂ является очень стабильной. Для осуществления нитрогеназной реакции еще необходимо присутствие в качестве субстратов восстановленного ферредоксина или флаводоксина. Восстановление молекулы N₂ сопряжено с гидролизом 12 молекул ATP. Важно отметить, что биосинтез нитрогеназного комплекса тормозится при накоплении аммиака, или снижении количества ATP по отношению к ADP. Система фиксации азота должна быть изолирована от молекулярного кислорода, который инактивирует нитрогеназу и конкурирует за восстановитель. Стехиометрия суммарного процесса фиксации азота следующая:

N₂+6e+12ATP+12H₂O>2NH₄⁺+12ADP+12P_i+4H⁺

Нитрогеназа может также катализировать восстановление соединений, содержащих тройные связи, например N₂O, NH₃, HCN, и других нитрилов, а также ацетилен.

Симбиотическая фиксация азота происходит в корневых клубеньках, которые образуются после инфицирования корневых волосков микроорганизмами, относящимися к видам Rhizobium. Бактерии превращаются в увеличенные в объеме клетки неправильной формы — бактероиды. Именно в них происходит фиксация азота. N₂ восстанавливается бактероидами до NH₃, который связывается глутамин-синтетазой, присутствующей в цитозоле растений. Растение не только обеспечивает бактероиды органическими субстратами, но и защищает нитрогеназу от действия кислорода. Азотфиксирующие клубеньки имеют леггемоглобин, который служит переносчиком кислорода, подобно гемоглобину [5, 16, 24].

Нитраты и нитриты могут потребляться многими бактериями в качестве источника азота (например, E. coli). При этом нитратный азот восстанавливается при участии фермента нитратредуктазы, а затем при участии нитритредуктазы нитрит восстанавливается до NH₃. Нитратредуктаза катализирует НАД•Н₂-зависимое восстановление:

NO₃^- +НАД•Н₂>NO₂^- +НАД⁺ +Н₂О ,

в результате которого осуществляется перенос на NO3- двух электронов. Нитритредуктаза катализирует шестиэлектронное восстановление NO₂^- до NH₃:

NO₂^- +3НАД•Н₂+Н⁺>NH₃+3НАД⁺ +2Н₂О .

Ферменты нитратредуктаза и нитритредуктаза, как и нитрогеназа, имеют в своем составе молибден, железо и кислотно-лабильный сульфид. [1, 6, 16].

Некоторые бактерии восстанавливают нитрат только до уровня нитрита, а другие могут его восстанавливать только до газообразного азота. В ходе этого процесса, называемого денитрификацией, связанный азот удаляется с высвобождением газообразного N₂ в атмосферу.

Бактерии способны не только восстанавливать, но и окислять нитриты. К таким видам относятся род Nitrobacter, Nitrospina, Nitrococcus и Nitrospira. Все они являются аэробами, кроме Nitrobacter, которые могут расти за счет анаэробного дыхания. В присутствии нитратов они образуют NO и N₂O. Известен один штамм Nitrobacter, способный окислять NO до нитрата [26, 27].

Усвоение аммиака бактериями проходит легко, так как атом азота аммиака имеет степень окисления -3, такой же, как и в органических веществах в клетке. Существует три реакции ассимиляции NH₃. Одна из них приводит к образованию аминогруппы глутаминовой кислоты, вторая ведет к появлению амидогруппы глутамина, а третья — к появлению карбамоилфосфата. Из карбамоилфосфата синтезируется аспарагин и пиримидины. Другие два продукта ассимиляции NH₃ — непосредственные предшественники белков, а роль аспарагина только в этом и заключается [15, 16].

Существуют бактерии, которые окисляют аммиак. Этот процесс называется нитрификацией. Она проходит в два этапа: на первом аммиак окисляется до нитрита, а на втором — до нитрата. Соответствующую начальную реакцию катализирует монооксигеназа. К таким видам относят роды Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosolobus, Nitrospira [15, 26, 28].

Следует отметить, что наиболее универсальным источником азотного питания являются соли аммония. Аммиак при накоплении в клетке вызывает ее гибель. При использовании солей (NH₄)₂SO₄, NH₄Cl по мере их использования бактериями, среда подкисляется, что не способствует нормальному развитию клеток.

Нитраты необходимы тем микроорганизмам, которые боятся подкисления, так как при использовании NO₃^- остаются ионы металлов Na⁺ и K⁺, которые создают щелочные условия среды

Микроорганизмы, которые способные синтезировать все необходимые им органические соединения (углеводы, аминокислоты и др.) из глюкозы и солей аммония, называются прототрофами [3, 19].

2.2 Органические соединения азота Существуют микроорганизмы, которые не способны синтезировать все аминокислоты для своей клетки из солей аммония. Они ассимилируют эти соединения и другие факторы роста в готовом виде из окружающей среды или организма хозяина (человека, животного). Такие микроорганизмы называют ауксотрофами. Ауксотрофами чаще всего являются патогенные или условно-патогенные для человека микроорганизмы. Некоторые представители пурпурных и зеленых бактерий растут на средах с мочевиной и аминокислотами. Большими возможностями в отношении использования аминокислот обладают несерные пурпурные бактерии [3, 25].

К органическим источникам азота относятся белки, азотистые основания, пептон, пептиды, аминокислоты, мочевина. Белки усваивают только те микроорганизмы, которые выделяют в среду протеиназы, расщепляющие белковую молекулу до пептидов и аминокислот. Пептиды поступают в клетки и гидролизуются внутриклеточными протеазами до аминокислот. Протеолитическую активность бактерий обычно проверяют на питательных средах с желатином [7, 10, 11, 19].

Микроорганизмы, которые живут в почве, способны утилизировать азот органических соединений. Минерализация органических веществ проводят бактерии-сапрофиты. Азотистые соединения в присутствии воздуха разрушаются с образованием аммиака. Часть азота ассимилируется самими микроорганизмами и таким образом превращается в компоненты микробной клетки.

К аэробным микроорганизмам, которые окисляют азотсодержащие вещества до полной минерализации, конечными продуктами которой являются аммиак, CO₂, H₂O, H₂S и другие относят: Bac. mycoides, Bac. mesentericus, Bac. subtilis, Bac. megaterium, Serratia marcescenc.

Разрушение белка в анаэробных условиях (гниение) обычно не приводит к немедленному освобождению всего аминного азота в виде аммиака. Некоторые аминокислоты превращаются в амины. К анаэробным микроорганизмам относят Clostridium putrificum и Clostridium sporogenes [15, 22, 29].

Кислотный гидролизат казеина, пополненный триптофаном, является столь же универсальным источником азота для всех микробов, как и аммонийные соли.

Пептон для культивирования микроорганизмов получают, обрабатывая белки ферментом пепсином. При этом разрывается только часть пептидных связей. Пептон состоит примерно на 30% по весу из свободных аминокислот, остальное составляют дии трипептиды, а также водорастворимые, уже не осаждаемые нагреванием или кислотой полипептиды. Пептон добавляют в основные питательные среды для культивирования, например мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар.

Более экономичный аналог мясо-пептонного бульона — триптичный перевар по Хоттингеру. Для гидролиза белка в этом бульоне используют панкреатин. [11, 12, 30].

Многие бактерии нуждаются в тех или других аминокислотах (одной или нескольких), поскольку они не могут их самостоятельно синтезировать, например клостридии — в лейцине, тирозине, а стрептококки — в лейцине, аргинине. Палочки тифа и ботулизма неспособны синтезировать триптофан. Глутаминовая кислота стимулирует рост гемолитических стрептококков, палочки сибирской язвы, гонококка; цистин нужен для Proteus morganii и т. д. Обычно микроорганизмы нуждаются в L-аминокислотах, но для некоторых из них характерна потребность в D-аланине, необходимом, вероятно, для синтеза гликопептида клеточной стенки. Концентрация аминокислот, обеспечивающие максимальный рост ауксотрофов, обычно находятся в пределах 20−50 мкг на 1 мл.

Аминокислоты, которые не используются сразу, подвергаются таким метаболическим превращениям: окислительное дезаминирование, гидролитическое дезаминирование, переаминирование (трансаминирование), декарбоксилирование. В большинстве случаев аминокислота сначала превращается в соответствующую оксокислоту. Из аминокислот бактерии могут синтезировать не только вещества для построения клетки, но и антибиотики: эдеин, грамицидин S, бацитрацин и другие.

Стоит отметить, что имея полный набор аминокислот в питательной среде, бактерии переключаются на аминогетеротрофный тип питания (поглощают готовые аминокислоты), и не синтезируют аминокислоты самостоятельно.

Хорошими источниками аминокислот, кроме мясных бульонов и пептонов, являются кукурузный экстракт и дрожжевой экстракт из клеток Saccharomyces cerevisiae. Эти источники дешевые, поэтому их можно использовать на биотехнологических производствах [3, 5, 10, 19, 27, 31].

Разложение мочевины, выделяющейся с мочой, осуществляют уробактерии, расщепляющие ее до аммиака, диоксида углерода и воды.

Степень усвояемости источника азота определяется тем, насколько он легко превращается в аммиак. Наиболее доступными являются аммонийные соли и готовые аминокислоты. Иные источники менее доступны, но тем не менее, бактерии могут усваивать и их.

Азот наряду с углеродом, водородом и кислородом является одним из четырех основных элементов, участвующих в построении клетки. Он необходим бактериям для синтеза жизненно важных молекул: нуклеиновых кислот, белков, пуринов, пиримидинов, некоторых витаминов [1, 3, 6].

3. Источники кислорода и водорода Кислород и водород, наряду с азотом и углеродом — основные компоненты органических соединений, содержащихся в тканях различных организмов.

Источниками кислорода для микроорганизмов служит O₂, H₂O, CO₂ и органические соединения.

Источниками водорода служат H₂, H₂O и органические соединения.

Данные элементы, вместе с углеродом, являются не только основными компонентами клетки, но и служат важными субстратами для получения микроорганизмами энергии.

3.1 Молекулярный кислород По отношению к кислороду микроорганизмы делятся на облигатных аэробов, факультативных анаэробов, аэротолерантных анаэробов и облигатных анаэробов. Большинство микроорганизмов являются облигатными аэробами, для их роста необходим молекулярный кислород. Отдельные виды могут расти даже в атмосфере чистого кислорода. Наряду с этим есть микроорганизмы, которые хотя и нуждаются в О₂, но могут расти или лучше растут только при низком его содержании (2−10%). Такие микроорганизмы называются микроаэрофилами, а условия, в которых они растут, микроаэробными.

Факультативные анаэробы растут как в присутствии, так и в отсутствии О₂. Но в зависимости от условий роста происходят изменения в их метаболизме, прежде всего в энергетических процессах. Как правило, при наличии молекулярного кислорода такие микроорганизмы переключаются на окисление субстрата с участием О₂, т. е. аэробное дыхание, поскольку оно более выгодно, чем получение энергии в результате анаэробных процессов. Таковыми являются представители рода Bacillus, Escherichia, Paracoccus denitrificans и ряд других.

К аэротолерантным анаэробам принадлежат многие молочно-кислые бактерии, способны расти в присутствии молекулярного кислорода, но при этом их метаболизм остается таким же, как и в анаэробных условиях. И в том и в другом случае они осуществляют брожение.

Облигатные анаэробы не только не нуждаются для роста в наличии молекулярного кислорода, но для многих видов он токсичен даже в малой концентрации.

Стоит отметить, что в присутствии света кислород может вызывать повреждающие эффекты, так как воздействие ультрафиолета на компоненты клеток способствует образованию кислородных радикалов, разрушающих, в том числе нуклеиновые кислоты [7, 28].

3.2 Диоксид углерода как источник кислорода СО₂ упоминался выше как источник углерода для микроорганизмов. В качестве источника кислорода он носит не первостепенный характер, в основном для анаэробных организмов.

Диоксид углерода ассимилируют фототрофные бактерии через восстановительный пентозо-фосфатный цикл или восстановительный цикл лимонной кислоты. Многие виды способны расти как хемоавтотрофы или хемоорганотрофы. Именно этот источник кислорода используют аноксигенные фототрофные бактерии.

3.3 Молекулярный водород К число хемолитоавтотрофовных микроорганизмов, окисляющих Н₂, относятся водородные, метанобразующие бактерии, отдельные представители ацетатобразующих, сульфати серовосстанавливающих бактерий. Для штаммов использующих молекулярный водород, характерно присутствие гидрогеназы. За счет молекулярного водорода идет восстановление СО₂ [7, 25].

3.4 Вода Из всех химических соединений для жизни на Земле наиболее важна вода. Вода служит хорошим растворителем для большинства биологически важных веществ, включая О₂, СО₂, неорганические соли и органические соединения.

Количество воды в разных клетках колеблется от 60 до 90%, даже в спорах бактерий она содержится до 18…20%. Вода необходима клеткам для их метаболизма и роста. Доступность воды определяется ее активностью в среде (a_w), а также зависит от осмотического давления раствора (р). Минимальное значение a_w, при котором бактерии способны расти, значительно варьирует, однако для большинства видов оно превышает 0,99. Некоторые галофильные бактерии растут при значении активности 0,8. Колебания величины a_w могут оказывать влияние на скорость роста бактерий, их состав и метаболическую активность. Формула для расчета активности воды:

где х — число ионов, образуемых на 1 молекулу раствора, m — моляльность жидкости и — моляльный осмотический коэффициент [6, 34, 35].

Наиболее активно используют воду в химическом плане фотосинтезирующие бактерии, у которых она является донором электронов (цианобактерии). Также воду используют пурпурные и зеленые серобактерии, когда они окисляют элементарную серу.

3.5 Органические соединения как источники кислорода и водорода Несерные пурпурные бактерии могут использовать вместо неорганического донора водорода различные органические вещества: дикарбоновые кислоты, пируват, лактат, ацетат, формиат, бензоат, этанол, малат, сукцинат, бутират, манит и другие.

Гетеротрофы получают эти элементы из основных органических питательных веществ.

Чтобы удовлетворить потребности микробов в двух органогенах — кислороде и водороде — в большинстве случаев бывает достаточно тех атомов кислорода и водорода, которые содержатся в молекулах органических веществ и в воде. Исключение представляют водородные бактерии, а также зеленые и пурпурные бактерии. Аэробные микроорганизмы не могут развиваться без доступа кислорода [10, 13, 25].

4. Источники серы Сера — еще один биогенный элемент, входит в состав аминокислот (цистеин, метионин), витаминов и кофакторов (биотин, липоевая кислота, кофермент, А и другие). В природе сера находится в форме неорганических солей, главным образом сульфатов, в виде молекулярной серы или входит в состав органических соединений [1, 36].

К неорганическим источникам серы относят сульфаты, тиосульфаты, сульфоновые кислоты, сульфиды, сероводород, элементарную серу.

Сульфат — наиболее обильно представленная в биосфере форма серы, усваиваемая живыми организмами — восстанавливается до H₂S в процессе диссимиляционной сульфатредукции бактериями родов Desulfovibrio, Archaeoglobus и многих других. На образование конечного продукта — сероводорода — используется восемь электронов. Донором электронов при этом может служить молекулярный водород, а также разнообразные органические субстраты.

В процессе ассимиляционной сульфатредукции, восстановление сульфата происходит в два этапа. Первый из них — это двухэлектронное восстановление сульфата да сульфита, второй — шестиэлектронное восстановление сульфита до H₂S. Образующийся H₂S немедленно связывается с О-ацетилсерином с образованием цистеина — конечного продукта ассимиляционной сульфатредукции. Сульфаты ассимилируют несерные пурпурные бактерии и некоторые серные пурпурные бактерии.

Помимо сульфатов, хорошим источником серы является тиосульфат. Он непосредственно взаимодействует с О-ацетилсерином с образованием S-сульфоната, который далее восстанавливается до цистеина.

Сульфоновую кислоту бактерии редко используют в качестве источника серы, так как связь C-S довольно устойчива. У аэробных бактерий разложение сульфоновых кислот происходит при участии диоксигеназ или монооксигеназ, осуществляющих отщепление сульфита при участии кислорода [25, 36, 37, 38].

Известны архебактерии, которые растут на элементарной сере. Это некоторые экстремальные термофилы и гипертермофилы. В анаэробных условиях они восстанавливают S⁰ до H₂S, в аэробных условиях окисляют H₂S до H₂SO₄. Донорами электронов служат Н₂ или органические соединения.

Окисление H₂S осуществляют фотосинтезирующие и хемоавтотрофные бактерии. Оно может происходить в аэробных условиях под воздействием бесцветных серобактерий или в анаэробных с помощью фотосинтезирующих пурпурных и зеленых серобактерий. Такие окислительные реакции приводят к образованию ионов водорода, поэтому серу обычно добавляют в щелочную среду.

Микроорганизмы, утратившие способность восстанавливать сульфаты, нуждаются в соединениях, содержащих атом серы в восстановленной форме, как, например, сероводород, цистеин.

5. Источники фосфора Фосфор — необходимый компонент нуклеиновых кислот, фосфолипидов, коферментов. Основной формой фосфора в природе являются фосфаты. Для их ассимиляции не требуется восстановление. В живых организмах он присутствует почти исключительно в степени окисления +5, в виде фосфата. Доступность его в природе лимитирована в основном низкой растворимостью фосфатов кальция и магния и способностью фосфата эффективно адсорбироваться на органических и неорганических полимерах. Концентрация фосфора обычно не превышает несколько микромоль, тогда как в клетках он содержится в миллимолярном количестве. Следовательно, во многих природных местообитаниях он лимитирует рост микроорганизмов.

Фосфат мобилизуется из неорганических полифосфатов и органических фосфатов (производные нуклеиновых кислот, нуклеотиды) под действием фосфатаз, которыми обладают прокариоты. Фосфат не восстанавливается в реакциях биологического преобразования энергии. Донором-переносчиком фосфата в клетке служит АТР.

Высокомолекулярные органические фосфаты, которые клетки прокариот не способны поглощать, гидролизуются в периплазматическом пространстве при участии эстераз. Высвобождающийся неорганический фосфат переносится в клетку по механизму активного транспорта.

Многие бактерии в условиях избытка фосфора и источника энергии, если рост лимитирован при этом другими факторами, образуют полифосфаты — резервный источник энергии и фосфора. Расщепление внутриклеточного пирофосфата (PP_i>2P_i) осуществляет фермент пирофосфатаза. Некоторые анаэробы используют PP_i вместо АТР для фосфорилирования тех или иных субстратов, например ацетата.

Присутствие неорганического фосфата подавляет ассимиляцию альтернативных источников фосфора — органических фосфорных эфиров, диэфиров, ангидридов и фосфоновых кислот, в которых фосфор непосредственно связан с углеродом.

Следует отметить, что фосфорорганические соединения могут служить источниками углерода, фосфора и энергии [1, 28, 36, 37, 39].

6. Минеральные элементы Помимо элементов-органогенов, из которых состоят клеточные полимеры и растворимые органические соединения, для построения клеток необходимы важные в качестве электролитов щелочные металлы (K, Na), щелочноземельные металлы (Mg, Ca, выполняющие функции кофакторов ферментов) и микроэлементы — металлы переходной группы (V, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Mo, W) и неметаллы (Se, B, Cl и другие).

Биоэлементы можно разделить еще на основные и минорные. К основным элементам (помимо С, H, O, N, S, P) принадлежат K, Mg, Ca, Fe. К минорным элементам относят Zn, Mn, Na, Cl, Mo, Co, Cu, W, Ni.

6.1 Основные биоэлементы (макроэлементы) Данные минеральные элементы требуются в сравнительно больших количествах — 0,2−0,5 г/л.

К⁺ является основным неорганическим катионом в клетке и кофактором некоторых ферментов, важен для синтеза белка.

Mg²⁺ — кофактор многих ферментов (например, киназ); присутствует в клеточных стенках, мембранах и эфирах фосфорной кислоты. Большинство биоактивных фосфорных эфиров находится в клетках в виде комплексов с магнием. Фосфолипопротеиды клеточной стенки бактерий также образуют хелатные комплексы с ионами магния. Магний необходим для функционирования рибосом.

Ca²⁺ — кофактор ферментов, присутствует в экзоферментах (в амилазе, протеазе); Са-дипиколинат является важным компонентов эндоспор.

Fe²⁺, Fe³⁺ содержатся в цитохромах, ферредоксинах и других железосеропротеидах — входят в состав компонентов электронпереносящей цепи, кофактор ферментов (некоторые дегидратазы).

Важную роль у бактерий играет способность к поглощению железа, поскольку в природе содержание этого элемента часто относится к лимитирующим рост факторам. В аэробных условиях железо присутствует в среде в окисленной форме, Fe (III), образуя практически нерастворимые гидраты оксида железа, карбонат железа, и магнетит [оксид Fe (II/III)], в связи с чем большинство аэробных микроорганизмов для поглощения железа секретирует в среду сидерофоры — органические соединения-переносчики железа, образующие хелаты с Fe³⁺. В анаэробных условиях железо не является лимитирующим рост элементов, присутствуя в форме Fe²⁺, хорошо растворимой, и в отсутствии кислорода довольно устойчивой.

Известны бактерии, которые способны окислять двухвалентное железо до трехвалентного — это железобактерии. Многие ацидофильные железобактерии способны также окислять восстановленные соединения серы с образованием серной кислоты, используются для выщелачивания металлов из сульфидных руд [5,6, 37, 40].

6.2 Минорные биоэлементы (микроэлементы) Набор требуемых микроэлементов зависит от вида микробов. В природе микроэлементы обычно присутствуют в виде свободных катионов или анионов, поглощаемых микробными клетками с помощью относительно специфичных транспортных систем.

Некоторые из микроэлементов встречаются в форме оксианионов, таких как SeO₃^-, WoO₄^2- и MoO₄^2-. В клетках они подвергаются ферментативному восстановлению, приобретая валентность, необходимую для ассимиляции.

Микроэлементы нужны в очень низких концентрациях — 0,1−0,001 мг/л.

Zn²⁺ содержится в алкогольдегидрогеназе, щелочной фосфатазе, альдолазе, РНКи ДНК-полимеразе.

Mn²⁺ содержится в бактериальной пероксиддисмутазе; кофактор некоторых ферментов (фосфоэнолпируват-карбоксикиназы, цитрат-синтазы). Марганец способны окислять представители различных систематических групп. В реакции образуется нерастворимый MnO₂.

Ионы цинка и марганца необходимы всем микроорганизмам.

Na⁺, Cl^- необходимы галофильным и морским бактериям в больших концентрациях. Однако эти организмы составляют исключения. У большинства микроорганизмов потребность в ионах натрия и хлора невелика. Потребность в Na⁺ у негалофилов обнаруживается только в том случае, когда они выращиваются в присутствии специфических источников углерода и энергии: например, E. coli нуждается в Na⁺ для роста с максимальной скоростью на среде с L-глутаматом, а Enterobacter aerogenes — на среде с цитратом. В обоих случаях количественная потребность невелика.

Mo содержится в нитратредуктазе, нитрогеназе и формиатдегидрогеназе. Молибденпротеиды играют важную роль в азотном обмене и в окислении формиата. Ксантиндегидрогеназа также содержит молибден.

Se содержится в глицинредуктазе и формиатдегидрогеназе. Глицинредуктаза содержит селен в форме селенцистеина.

Co²⁺ содержится в коферменте витамин-В12-ферментов (глутаматмутазе, метилмалонил-СоА-мутазе).

Cu²⁺ содержится в цитохромоксидазе и оксигеназах — ферментах, переносящих электроны от субстратов к кислороду.

W содержится в некоторых формиатдегидрогеназах.

Ni²⁺ содержится в уреазе; требуется для автотрофного роста водородных бактерий.

Небольшие молекулы и ионы поддерживают оптимальный уровень обмена веществ в клетках, они вносят определенный и существенный вклад в осморегуляцию микроорганизмов.

Присутствие в питательной среде хелатирующих веществ является важным фактором, определяющим доступность ионов металлов; поэтому, если необходимо добиться интенсивного роста бактерий, концентрация этих агентов должна быть сбалансирована с количеством микроэлементов. Хелатирующими свойствами обладают аминокислоты, цитрат, малат и др.

Минеральные элементы вносятся в питательную среду в виде соответствующих солей, составляя ее минеральную основу [5, 6, 27, 40, 41].

7. Факторы роста К факторам роста относят аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, витамины, и другие соединения.

Аминокислоты уже были упомянуты в источниках азота и углерода.

7.1 Пуриновые и пиримидиновые основания Некоторые микроорганизмы нуждаются в пуриновых и пиримидиновых основаниях, или их производных, входящих в состав нуклеиновых кислот. Эти вещества нужны в основном в качестве строительного материала для нуклеотидов. Одно из пуриновых оснований — аденин — входит не только в нуклеиновые кислоты, но и в состав коэнзимов, в частности коэнзима, А (КоА). Они являются факторами роста для разных видов стрептококков, стафилококков, микоплазм и других видов. Потребность в пуриновых и пиримидиновых основаниях больше всего выражена у молочнокислых бактерий.

Наряду с основными азотистыми основаниями, микроорганизмы отзываются положительно еще на один пурин — ксантин.

Концентрация пуринов и пиримидинов, необходимые для максимального роста микроорганизмов, обычно составляет 10−20 мкг на 1 мл. В одних случаях азотистые основания только ускоряют рост микроорганизмов, в других случаях они оказываются для них обязательными [3, 10, 19, 27].

7.2 Витамины и родственные соединения Витамины осуществляют свои каталитические функции в клетке обычно в качестве компонентов коферментов или как простетические группы ферментов. Готовые витамины необходимы для ряда бактерий.

n-Аминобензойная кислота служит предшественником в биосинтезе фолиевой кислоты и поэтому оказывает воздействие на метаболизм тимина, метионина, серина, пуриновых оснований и витамина В₁₂. В свою очередь, присутствие этих компонентов в среде может оказывать влияние на увеличение или снижение потребности бактерий (вплоть до нулевой) в n-аминобензойной кислоте. Парааминобензойная кислота является ростовым фактором для многих патогенных бактерий: пневмококков, гонококков, возбудителей дизентерии.

Некоторые формы фолиевой кислоты, встречающиеся в природе, отличаются по своей усвояемости отдельными бактериями. Птероил-L-глутаминовая кислота и ее N¹⁰-формильное производное полностью усваиваются Lactobacillus casei и S. faecalis; птероилтриглутаминовая кислота обеспечивает хороший рост L. casei, но мало активна в случае S. faecalis, птероилгептаглутаминовая кислота вообще не стимулирует рост бактерий. N⁵-формилтетрагидроптероилглутаминовая кислота (лейковорин) активна в случае L. casei и S.faecalis. Фолиевая кислота участвует как кофактор в синтезе тимина, пуринов, серина, метионина и пантотеновой кислоты. Если эти компоненты добавлены в среду, то потребность бактерий в фолиевой кислоте часто отпадает.

Биотин участвует в разных реакциях биосинтеза, требующих фиксации СО₂, в том числе в синтезе оксалоацетата и жирных кислот. Биоцитин (N?-биотиниллизин) является природным соединением; он так же, как и биотин, активен в случае L. casei, но не в случае Lactobacillus arabinosus.

Никотиновую кислоту и ее производные используют большинство ауксотрофов. Коферментные формы витамина — никотинамидадениндинуклеотид (NAD) и никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADP) — участвуют в окислительно-восстановительных реакциях клеточного метаболизма. Некоторые организмы не способны синтезировать NAD из никотиновой кислоты и поэтому нуждаются в готовом коферменте.

Пантотеновая кислота является компонентом кофермента, А (СоА) и ацилпереносящего белка (АПБ), которые служат переносчиками ацильной группы в процессах метаболизма. Некоторые бактерии используют интактный кофермент как фактор роста, но для роста значительно большего числа бактерий необходимы пантотеновая кислота или пантетеин. Потребность отдельных видов бактерий в том или ином родственном соединении обусловлена способностью к их синтезу и транспорту.

Относительно немногие виды бактерий требуют рибофлавин (витамин В₂). Почти все бактерии, очевидно, содержат этот витамин, а некоторые виды синтезируют его в достаточно большом количестве, т. е. могут служить источником выделения рибофлавина в виде препарата. ФМН (флвинмононулеотид) и ФАД (флавинадениндинуклеотид) являются главными коферментными формами рибофлавина, участвующими в окислительно-восстановительных реакциях. Все эти три вещества одинаково активно поддерживают рост рибофлавинового ауксотрофа L.casei. Этот витамин необходим всем аэробным микроорганизмам.

Большое число бактерий являются ауксотрофными по тиамину (витамин В₁), его предшественникам или коферментной форме — тиаминпирофосфату (ТПФ). ТПФ участвует в декарбоксилировании б-кетокислот и в транскетолазной реакции.

Различные виды ауксотрофных по витамину В₆ (пиридоксин, пиридоксаль, пиридоксамин) бактерий по-разному реагируют на его фосфорилированные производные. Пиридоксаль наиболее широко используется как фактор роста. Для роста некоторых бактерий необходим пиридоксамин-5'-фосфат; однако для большинства ауксотрофов фосфорилированные формы витамина В₆ неактивны, так как клетки не имеют для них соответствующих транспортных систем. Пиридоксаль-5'-фосфат и пиридоксамин-5'-фосфат участвуют во многих реакциях синтеза и деградации природных б-аминокислот.

Витамин В₁₂ (кобаламин) синтезируется в природе исключительно микроорганизмами, которые вместе с их побочными продуктами являются источником выделения витамина в виде препарата. Коферментная форма витамина В₁₂ (кобаламин, связанный с адениннуклеозидом) так же активно, как и витамин, стимулирует рост бактерий. Кофермент участвует во многих метаболических реакциях изомеризации, а также (прямо или косвенно) в биосинтезе дезоксирибонуклеозидов, метионина и, вероятно, других веществ.