Стрептомицин (XXII). Пищевая химия

Контроль содержания стимуляторов роста животных (в том числе гормональных препаратов), лекарственных средств (в том числе антибиотиков), применяемых в животноводстве для целей откорма, лечения и профилактики заболеваний скота и птицы, а также других препаратов, не указанных в предыдущем абзаце, основывается на информации, представляемой изготовителем (поставщиком) продукции об использованных при ее изготовлении и хранении стимуляторов роста животных и лекарственных препаратов.

Определение ветеринарных препаратов Ускоренный метод качественного и количественного обнаружения антибиотиков в пищевых продуктах и других субстратах описан в методических указаниях 4.2.026 «Экспресс-метод определения антибиотиков в пищевых продуктах». Метод основан на подавлении антибиотиком дегидрогеназной активности тест-культур в жидкой питательной среде.

Дегидрогеназы-ферменты активируют процессы дыхания в живой клетке. Повреждение дегидрогеназ приводит к нарушению окислительно-восстановительных процессов и гибели клетки. Высокая чувствительность этих ферментов к неблагоприятным воздействиям использована для выявления повреждающего действия антибиотика на различные тест-культуры.

В методе используется способность клеток тест-культур восстанавливать метиленовый синий в анаэробных условиях. Если антибиотик оказывает цитотоксическое действие, клетки тесткультур лишаются такой возможности и метиленовый синий не восстанавливается. Метиленовый синий играет в этой системе одновременно роль акцептора водорода и индикатора, позволяющего судить о повреждающем действии антибиотиков на клеточные дегидрогеназы за определенный отрезок времени.

Преимущество экспресс-метода заключается в возможности получения ответа через 4−5 ч, относительной простоте и значительной экономии питательной среды.

Доза биологически активного вещества или лекарственного средства, вызывающая определенный, объективно регистрируемый физиологический или, соответственно, терапевтический эффект и принятая в качестве меры при дозировании, называется единицей действия (ЕД). Так, допустимое содержание антибиотиков в продуктах не должно превышать для тетрациклинов 0,01 ЕД, для пенициллина — 0,01 ЕД, для стрептомицина — 0,5 ЕД на 1 г (см³) продукта.

Отбор проб

Отбор проб молока и молочных продуктов производится по ГОСТ 13 928 и 9225, мяса и мясных продуктов — по ГОСТ 7269, яйца отбираются в пределах 0,5−1% в зависимости от объема партии.

Пробоподготовка

Пробоподготовку осуществляют согласно МУК 4.2.026. Перед проведением исследования проводят термическую обработку проб пищевых продуктов на водяной бане при 60 °C. При анализе мяса и субпродуктов перед термической обработкой проводят их измельчение. Антибиотики экстрагируют, обрабатывая пробу соответствующим буферным раствором: при определении тетрациклина — цитратным (pH 5,8−6,0), стрептомицина — фосфатным (pH 7,8−8,0), пенициллина — фосфатным (pH 6,8−7,0).

Определение «рабочей дозы» тест-культур

Тест-культурами служат вегетативные формы спорообразующих и неспорообразующих культур, обладающих высокой чувствительностью к антибиотикам.

При определении пенициллина и стрептомицина предпочтительно использовать спорообразующие тест-культуры Вас. subtilis, Вас. mycoid. es и Micrococcus luteum; для тетрациклина—Вас. subtilis.

«Рабочая доза» тест-культуры — это наибольшее разведение суспензии, вызывающее обесцвечивание метиленового синего в определенное время в термостате при температуре 37 °C.

Следует учитывать, что время обесцвечивания метиленового синего обратно пропорционально количеству клеток в смыве.

Предварительное определение «рабочей дозы» тест-культур необходимо потому, что количество жизнеспособных клеток тесткультуры от смыва к смыву варьирует.

Определение концентрации антибиотика и степени его активности

При определении концентрации антибиотика в пищевых продуктах параллельно осуществляют контрольный ряд проб с известным содержанием антибиотика в пробирках. После этого вносят взвесь, содержащую «рабочую дозу» тест-культуры, вызывающую обесцвечивание метиленового синего через 1 ч. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при температуре 37 °C на 3-часовую экспозицию тест-культуры с антибиотиком. Затем в каждую пробирку добавляют метиленовый синий и глюкозу. Содержимое пробирок вновь смешивают и инкубируют.

Если в исследуемом объекте содержится антибиотик, то он блокирует дыхательные ферменты бактериальных клеток тесткультур и вызывает их гибель. В этих пробирках метиленовый синий не обесцвечивается.

О степени активности антибиотика судят по его минимальной концентрации, которая вызывает полное подавление дегидрогеназ клеток тест-культур через 1 ч или 2 ч инкубации в термостате при температуре (37 ± 1) °С по сравнению с контрольной системой.

Определение концентрации антибиотиков в испытуемом растворе проводят аналогично определению концентрации антибиотиков в стандартных образцах.

Определение остаточных количеств ветеринарных препаратов биологическими методами описано и в других нормативных документах, например ГОСТ Р 52 842, МУ 3049 и др.

ГОСТ Р ИСО 13 493 «Мясо и мясные продукты. Метод определения содержания хлорамфеникола (левомицетина) с помощью жидкостной хроматографии» описывает определение хлорамфеникола методом жидкостной хроматографии в мышечной ткани мяса, включая мясо птицы, где содержание хлорамфеникола составляет не менее 6,5 мкг/кг. Данный метод неприменим к испорченным образцам.

Отбор проб

Отбор проб не является частью метода, изложенного в настоящем стандарте, рекомендуемый метод отбора образцов приведен в ИСО 3100−1.

Пробоподготовка

Пробоподготовка заключается в удалении жировой ткани, несъедобных частей образца и измельчении. В случае определения лекарственных препаратов тетрациклинового ряда после гомогенизации добавляют минеральные кислоты для отщепления тетрациклинов от белков. Хлорамфеникол экстрагируют из пробы водой. Очистку фильтрата экстракта от липофильных компонентов проводят методом твердофазной экстракции, используя патрон с диатомитовой землей. Элюируют хлорамфеникол дихлорметаном, элюат концентрируют выпариванием растворителя.

Определение и обработка результатов

Хлорамфеникол определяют методом обращенно-фазовой хроматографии с детектированием в УФ области спектра при 285 нм. Подвижной фазой является смесь ацетонитрила и ацетатного буферного раствора, неподвижной фазой — обращенная фаза С₈ или С_|8.

Количественное содержание хлорамфеникола определяют методом внешнего стандарта.