Иммунологические методы

РЕФЕРАТ

Иммунологические методы

ВВЕДЕНИЕ

В иммунологии применяется целый ряд экспериментальных методов из других областей биологии. Так, выделение антигенов и антител производят с помощью биохимических методов фракционирования белков, гены иммунологически важных молекул секвенируют обычными молекулярно-генетическими методами. Вместе с тем в иммунологии разработаны и свои специальные методы исследования, основанные на взаимодействии антиген—антитело. Эти иммунологические методы в свою очередь нашли применение в различных областях биологии. В частности, любые молекулы, обладающие антигенными свойствами, можно выявлять в тканях иммуногистохимическими методами. Для количественного определения таких молекул, присутствующих в чрезвычайно низких концентрациях, применяют радиоиммуноанализ и ферментный иммуносорбентный анализ. В настоящее время существуют сотни разнообразных иммунологических методов: наиболее широко применяемые из них описаны в этой работе.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АНТИГЕН-АНТИТЕЛО Реакция преципитации. Одним из первых описанных проявлений взаимодействия антиген—антитело было образование преципитата при смешивании обоих реагентов в эквивалентных или близких к эквивалентным количествах. Оно наблюдается при постановке классической реакции преципитации с растворимыми антигенами и антителами. Если проводить эту реакцию в агаровом геле, можно дифференцировать отдельные реакции антиген—антитело, обусловленные различными популяциями антител, присутствующими в сыворотке. Такой метод, названный методом двойной иммунодиффузии, применяется также для проверки сходства между различными антигенами.

Однако некоторые смеси антигенов слишком сложны для разделения просто путем диффузии и преципитации, и для анализа таких смесей был разработан метод иммуноэлектрофореза — прежде чем выявлять антигены визуально в реакции преципитации, их разделяют по заряду с помощью этого метода.

Методы, основанные на диффузии в геле, позволяют определять антигены и антитела лишь качественно, количественную же оценку реагирующих компонентов проводят разработанным позднее методом простой радиальной иммунодиффузии.

Иммунодиффузию в электрическом поле можно производить с одновременным встречным движением антигенов и антител; этот способ назван встречным электрофорезом. Аналогичная модификация простой радиальной иммунодиффузии получила название ракетный электрофорез.

Описанные методы используются для определения антигенов и антител в концентрации от 20 м кг/мл до 2 мг/мл.

Реакции гемагглютинации и связывания комплемента Если антитела присутствуют в столь низких концентрациях, что их не удается обнаружить и количественно определить при помощи встречного и ракетного электрофореза, применяют реакцию гемагглютинации. Она основана на способности антител перекрестно связываться с эритроцитами, взаимодействуя с их поверхностными антигенами.

Реакция антиген—антитело ведет к образованию иммунных комплексов, которые связывают комплемент при его активации по классическому пути, и на этом основан один из количественных методов определения антигенов и антител. С помощью реакций гемагглютинации и связывания комплемента удается выявлять антитела, присутствующие в концентрации <1 мкг/мл.

Прямая и непрямая иммунофлуоресценция Иммунофлуоресцентные методы широко используются для обнаружения аутоантител и антител к тканевым и клеточным антигенам. Хотя эти методы технически более сложны, чем описанные выше, они имеют явное преимущество в тех случаях, когда требуется определить число видов антител. Используя срезы тканей, на одном предметном стекле можно выявить антитела к нескольким разным антигенам, установив при этом их внутритканевое или внутриклеточное распределение.

Кроме того, с помощью иммунофлуоресцентных тестов можно идентифицировать отдельные клетки в клеточной суспензии, т. е. выявлять антигены на поверхности живых клеток. Для этой цели суспензию живых клеток, флуоресцентно окрашенных специфичными реагентами, пропускают через проточный флуоресцентный клеточный сортер — прибор, измеряющий интенсивность свечения каждой клетки в разных областях спектра и затем разделяющий клетки по параметрам свечения. Данный метод позволяет выделять различные клеточные популяции, т. е. разделять клетки, несущие специфические поверхностные антигены и соответственно этому окрашенные различными флуоресцентно меченными антителами.

Иммунологический анализ антигенов и антител с помощью меченых реагентов Методы этой категории отличаются очень высокой чувствительностью и экономичностью в расходовании реагентов. Наиболее распространенный из всех иммунологических методов — это, вероятно, иммуносорбентный анализ антител с применением лигандов, меченных радиоизотопами или ферментами; он позволяет исследовать большое число образцов в относительно короткое время. Количество антигена можно измерять при помощи метода «двойной антигенной ловушки» или конкурентного иммуноанали-за с применением любого маркера для определения.

Иммуноблоттинг и иммунопреципитация Описанные выше методы обычно применяют для определения уровня конкретных известных антигенов и антител, однако часто необходимо идентифицировать и охарактеризовать не известные заранее антигены, содержащиеся в многокомпонентной смеси. Для этой цели особенно подходит иммуноблоттинг.

При проведении иммуноблоттинга сложную смесь антигенов вначале подвергают гель-электрофорезу, а затем фракционированные пептиды переносят на лист нитроцеллюлозы для идентификации индивидуальных антигенов при помощи специфических антисывороток. Производя предварительное разделение в геле с додецилсульфатом натрия или в геле для изо-электрического фокусирования можно получить данные о размерах и изоэлектрической точке исследуемых антигенов, а также о сходстве между ними.

В некоторых случаях в результате электрофореза в геле и процедуры блоттинга антиген денатурирует так, что некоторые из его эпитопов разрушаются и теряют способность связываться со специфическими антителами. В такой ситуации вместо блоттинга следует использовать иммунопреципитацию, чтобы установить, какой антиген связывают антитела. Данный метод может быть применен для определения как растворимых, так и мембранных антигенов.

ПОЛУЧЕНИЕ ЧИСТЫХ АНТИТЕЛ В иммунологических исследованиях часто возникает необходимость в получении очищенных препаратов антител, т. е. антигенспецифичных либо неспецифичных иммуноглобулинов. Выделение неспецифичных иммуноглобулинов из сыворотки обычно проводят путем последовательного фракционирования белков, которое включает следующие этапы.

* Осаждение гамма-глобулинов в 30—50% растворе сульфата аммония.

* Гель-фильтрация для получения молекул соответствующих размеров.

* Ионообменная хроматография с целью выделения молекул, несущих суммарный положительный заряд при нейтральном рН.

* Аффинная хроматография с использованием естественных лигандов иммуноглобулинов, например стафилококкового белка А.

Выделение антигенспецифичных иммуноглобулинов осуществляют методом аффинной хроматографии. Антиген «пришивают» к частицам сефарозы и связавшиеся с ним «чистые» антитела элюируют с иммуносорбента хаотропными агентами или буферным раствором. Метод аффинной хроматографии применяют и для получения очищенных препаратов антигенов.

Получение моноклональных антител Другим способом получения индивидуальных антител определенной специфичности служит гибридомная технология — создание иммортали-зованной линии клеток, продуцирующих антитела только одной специфичности, т. е. моноклональные. В такой культуре можно поддерживать антителообразование неопределенно долгое время. Моноклональные антитела несравнимо лучше соответствуют целям иммуноанализа, чем гетерогенные сыворотки, получаемые от иммунных животных, и поэтому нашли широкое применение в различных областях биологии в качестве высокоспецифичных зондов.

Эффективно продуцировать моноклональные антитела могут любые В-клетки, необходимо лишь сделать их для этого бессмертными и пролиферирующими. Чаще всего для этой цели получают гибридные клетки — путем слияния мышиных спленоцитов с миеломными В-клетками от мышей той же линии, не секретирующими собственных антител. Возможно также получить межлинейные или межвидовые гибриды, однако они часто нестабильны. Другой метод иммортализации — это трансформация клеток, например в случае В-клеток человека путем инфицирования вирусом Эпштейна—Барр.

Разработан также новый метод получения антител, основанный на использовании бактериофагов. С помощью этого интересного метода удается получить экспрессию на поверхности нитевидного бактериофага М13 вариабельных областей в виде фрагментов антител, связывающих антиген с определенной специфичностью и авидностью. Располагая библиотекой таких экспрессируемых бактериофагом фрагментов, можно производить отбор фаговых частиц, продуцирующих тот или иной Fv-фрагмент. Кроме того, если данным бактериофагом инфицировать соответствующие бактерии, они начинают выделять Fv-белок в большом количестве в культуральную среду. Такой подход не требует обязательной иммунизации животных или человека.

Моноклональные антитела представляют собой четко определенный реагент, но они не обладают более высокой специфичностью по сравнению с поликлональной антисывороткой, распознающей антиген в результате взаимодействия иммуноглобулинов с его различными эпитопами.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОМПЛЕМЕНТА Наиболее простой способ измерения активности комплемента состоит в определении концентрации сыворотки, вызывающей гемолиз 50% клеток в стандартном препарате эритроцитов, сенсибилизированных антигеном. Реакцию проводят в пробирках или на микропланшетах. Для приблизительной оценки активности комплемента более удобен простой радиальный гемолиз. Этот метод сходен с простой радиальной им-мунодиффузией, за исключением того что в лунки вносят исследуемую сыворотку, а гель содержит ЭСА. Вокруг лунки, содержащей активный комплемент, образуется зона гемолиза, величина которой пропорциональна количеству комплемента в исследуемой сыворотке. Данный метод позволяет определять общую активность компонентов классического и литического путей активации, однако если в сыворотке обнаружен дефицит комплемента, этим методом невозможно установить, отсутствием какого компонента дефицит обусловлен.

Существуют также методы для определения различных отдельных компонентов комплемента по их содержанию или функциональной активности. Это важное различие, так как компонент может присутствовать в нормальном количестве, но быть функционально неактивным. Содержание индивидуальных белков комплемента обычно определяют при помощи радиоиммуноанализа или ферментного иммуносорбентного анализа, используя антитела, специфичные к данному белку. Для измерения функциональной активности в суспензию сенсибилизированных эритроцитов вносят все компоненты комплемента, необходимые для лизиса, за исключением исследуемого белка.

ВЫДЕЛЕНИЕ ПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ Для проведения многих иммунологических исследований in vivo и in vitro требуются те или иные популяции лимфоцитов. Их получают от экспериментальных животных, в основном из тимуса, селезенки и периферических лимфоузлов. Некоторые специальные исследования требуют выделения клеток из других участков организма, например из пейеровых бляшек. Рециркулирующие клетки можно получить путем канюлирования грудного лимфатического протока и сбора клеток в течение нескольких часов. У человека наиболее легко выделить лимфоциты периферической крови, а хирургическим путем можно получить также клетки селезенки, миндалин и лимфоузлов. Однако хирургически отобранный материал часто содержит инфекционные агенты или опухолевые клетки, в зависимости от заболевания, которое вызвало необходимость хирургического вмешательства. Следует иметь в виду, что клеточные популяции, содержащиеся в перечисленных тканях, совершенно различны как по степени зрелости лимфоцитов, так и по численному соотношению в них клеток разных типов.

Тимус является источником довольно чистой Т-клеточной популяции, однако составляющие ее лимфоциты различаются по степени зрелости. При работе с лимфоцитами из других органов и тканей часто возникает необходимость в выделении отдельных субпопуляций для анализа их особых функций. Применение с этой целью описанного выше проточного флуоресцентного клеточного сортера, позволяющего разделять лимфоциты по их поверхностным маркерам, позволяет получать лишь ограниченное число клеток, поскольку скорость цитометрии с сортировкой весьма низка. Существует, однако, и ряд методов, позволяющих выделять лимфоциты и их отдельные субпопуляции сразу из всего объема исследуемого образца, — центрифугирование в градиенте плотности, розеткообразование, пэннинг и магнитное разделение.

Выделение в градиенте плотности основано на том, что лимфоциты имеют меньшую плотность, чем эритроциты и гранулоциты. Этот способ позволяет выделять большую часть лимфоцитов крови. Розеткообразование и пэннинг используют для выделения субпопуляций. Пэннинг представляет собой разновидность аффинной хроматографии применительно к лимфоцитам. На сходном принципе основан и способ разделения с помощью магнитных гранул, покрытых специфическими антителами. При смешивании с клетками гранулы связывают те из них, которые распознаются фиксированными антителами. Эти клетки можно затем смыть с гранул или выделить путем наложения магнитного поля.

Другой способ — он применяется для удаления ненужной клеточной популяции, — основан на использовании антител и комплемента. Если к смеси клеток добавить специфические антитела, а затем комплемент, клетки соответствующей субпопуляции будут лизированы. Конечно, для этого метода пригодны лишь такие антитела, которые связывают комплемент; кроме того, клетки-мишени должны нести на поверхности достаточное количество молекул антигена, чтобы фиксировать литическую дозу комплемента.

Источником определенных популяций лимфоцитов могут служить антигенспецифичные Т-клеточные линии, культивируемые в течение длительного периода. Получение таких линий позволяет обойтись без частого выделения первичных культур из органов и тканей животных.

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТОРНЫХ КЛЕТОК Разработаны различные методы для определения эффекторных функций лимфоцитов, в частности продукции антител, цитотоксичности и опосредованной Т-клетками помощи и супрессии.

В-клетки, продуцирующие IgMили IgG-антитела, можно определить при помощи метода локального гемолиза, или реакции бляшкообразования. Другим способом выявления антителообразующих клеток служит иммуноферментный тест ELISPOT. Он позволяет определять функционально активные Т-клетки, секретируюшие те или иные растворимые медиаторы, т. е. цитокины. Определение проводят на подложке с иммобилизованными антителами к специфическому цитокину. Эти антитела связывают данный цитокин, выделяемый Т-клеткой в окружающую зону, и эффект связывания можно выявить путем соответствующей обработки подложки: вокруг цитокинвыделяющих Т-клеток будут видны окрашенные пятнышки.

Для определения антигенспецифичных Т-клеток часто используют тест стимуляции лимфоцитов — пролиферативный ответ Т-клеток на антиген, выявляемый по включению ими 3Н-тимидина. Цитотоксическую активность клеточных популяций обычно определяют по их способности лизировать клетки-мишени. Количественно лизис клеток-мишеней определяют при помощи теста с высвобождением меченого хрома.

Миграция лимфоцитов В экспериментах по изучению миграции лимфоцитов in vivo обычно исследуют распределение в тех или иных тканях введенных внутривенно мелекул адгезии, метят лимфоциты или эндотелиальные клетки и используют блокирующие адгезию антитела для иммунопреципитации специфических молекул адгезии.

ТРАНСГЕННЫЕ ЖИВОТНЫЕ И НАПРАВЛЕННАЯ ДОСТАВКА ГЕНОВ Трансгенные животные Один из путей для изучения функций той или иной молекулы — это создание трансгенных животных, у которых ген данной молекулы либо делетирован, либо экспрессируется, но на сверхвысоком уровне или с образованием измененного продукта. Оригинальный способ получения трансгенных животных состоит в инъекции примерно ста копий данного гена непосредственно в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки. Яйцеклетку переносят затем в яйцевод ложнобеременной мыши-самки, в матке которой и развивается эмбрион. Потомство таких мышей отличается вариабельностью. У небольшого числа эмбрионов одна или больше копий гена встраивается в одну из хромосом до первого клеточного деления. Эти животные являются гетерозиготами по трансгену. У другой части животных включение трансгена происходит после первого деления, и мыши оказываются химерами, у которых наряду с нормальными клетками имеются клетки, содержащие трансген. У большинства мышей трансген не встраивается в хромосому. Статус каждой мыши определяют путем исследования образцов клеток на присутствие гена, для чего применяют саузернблоттинг. На основании данных анализа отбирают трансгенных гетерозиготных животных, которых затем используют для скрещивания и получения гомозиготной трансгенной линии.

Обычно включение трансгенов в хромосому происходит случайным образом и в виде блока из нескольких копий. Важно, что при включении трансгенного блока не образуется разрывов в других, функционально важных генах. Характер экспрессии трансгенов зависит от ряда факторов. Иногда эти гены оказываются под контролем промоторов общего типа и экспрессируются в большинстве тканей. В других случаях они связаны с тканеспецифическими промоторами и их экспрессия ограничена лишь некоторыми тканями и клетками или определенными стадиями развития. К интерпретации фенотипа трансгенных животных необходимо подходить с осторожностью, поскольку высокую экспрессию трансгенов в несоответствующих тканях нельзя считать физиологичной.

Направленная доставка гена Этот более тонкий метод на первом этапе состоит в переносе гена, который взаимодействует или рекомбинирует с исследуемым эндогенным геном и вызывает в результате его изменение. Например, в этом эндогенном гене может произойти делеция, в нем могут возникнуть точковые мутации или выпасть экзон. Такой измененный ген вводят в эмбриональную полипотентную стволовую клетку, где он рекомбинирует с аналогичным эндогенным геном. Эту стволовую клетку переносят затем в бластоцисту или имплантируют описанным выше способом.