Получение путем инфицирования лейкоцитов человека

Известны способы получения лейкоцитарного интерферона человека из лейкоцитов донорской крови человека, индуцированных вирусами и другими индукторами [2].

Лейкоциты крови человека — основные продуценты природного интерферона-альфа, количество которых для производственных целей лимитируется донорским сырьем. В этой связи решение вопросов оптимизации методов культивирования лейкоцитов для повышения выхода целевого продукта и разработки унифицированного эффективного метода получения природного ИФН для создания новых лекарственных форм представляется на сегодня весьма важным и актуальным для практического здравоохранения [5,7].

Известна технология производства человеческого лейкоцитарного интерферона, которая включает в себя следующую последовательность операций: выделение лейкоцитов из донорской крови, лейкоцитарной или эритроцитарной массы, суспензирование их в питательной среде при температуре (37±0,5)^oC, добавление к лейкоцитам аллантоисного вирус-индуктора и инкубирование при (30±0,5)^oC 3 ч. После этого отделяют вирус-индуктор, а к осадку лейкоцитов добавляют питательную среду и суспензию выдерживают при (37±0,5)^oC в течение 18−20 ч. На этом этапе происходит биосинтез интерферона в лейкоцитах и накопление его в питательной среде, полученной по этой технологии, имеет противовирусную активность 800−1000 МЕ в 1 мл препарата.

С целью увеличения продукции интерферона лейкоцитами на стадии биосинтеза в другом регламенте производства человеческого лейкоцитарного интерферона N 302−82 суспензию лейкоцитов выдерживают при 37,5^oC в течение 2 -10 ч в питательной среде, содержащей 100−200 ед/мл человеческого лейкоцитарного интерферона и 0,0015 ед/мл инсулина стадия прайминга добавляют вирус-индуктор на 1−2 ч стадия индукции интерферона. Затем удаляют вирус-индуктор, а к осадку лейкоцитов добавляют питательную среду и суспензию выдерживают при 37,5^oC в течение 18−20 ч стадия биосинтеза интерферона, а надосадочную жидкость, содержащую интерферон, подвергают инактивации.

Введение

стадии прайминга значительно повышает продукцию интерферона лейкоцитами, а противовирусная активность интерферона, полученного этим способом составляет 4000−5000 МЕ/мл. Необходимо отметить, что во всех вышеприведенных производственных технологиях и других известных способах получения человеческого лейкоцитарного интерферона, лейкоциты выделяют из крови, которая хранится при 4−6^oC, а сам процесс выделения идет при такой же температуре с последующим внесением их в питательную среду с температурой 37,5^oC и проведение стадии прайминга, стадии индукции и биосинтеза интерферона [4].

В качестве прототипа выбирается следующий способ получения интерферона, так как он является наиболее близким по технической сущности. Цель метода повышение выхода целевого продукта. С этой целью предложен способ получения интерферона, включающий выделение лейкоцитов, суспендирование их в питательной среде и праймирование в условиях постепенного повышения температуры суспензии с 20^o до (36,6 ±0,1)^oC в течение 4−6 ч, индукцию аллантоисным вирусом болезни Ньюкасла, биосинтез интерферона и инактивацию вируса-индуктора. Сравнительный анализ существенных признаков методов свидетельствует, что отличительными признаками заявляемого способа являются проведение прайминга лейкоцитов при медленном подъеме температуры суспензии с 20^o до (36,6±0,1)^oC в течение 4−6 ч. Предложенный температурный режим праймирования лейкоцитов обеспечивает условия для интенсивного биосинтезаИНФ. Способ осуществляется следующим образом. Выделенные лейкоциты из донорской крови, лейкоцитарной или эритроцитарной массы суспендируют в 5 л питательной среды (среда 199), содержащей 0,0015 ед/мл инсулина и 1500−3000 МЕ/МЛ человеческого лейкоцитарного интерферона 5−10% плазмы крови человека или 1,5−2% альбумина человека и антибиотики. В 1 мл питательной среды содержится 10 020 млн. лейкоцитов. Питательная среда, содержащая вышеперечисленные исходные компоненты, имеет исходную температуру 20^oC. В автоматизированном режиме, по программе, температуру суспензии с 20^oC повышают до (36,6±0,1)^oC в течение 4−6 ч. Затем температуру суспензии доводят до (36,9±0,1)^oC и в суспензию добавляют вирус-индуктор в дозе 2000;4000 ГАЕ на 2 млрд лейкоцитов, инкубируют взвесь при (36,9±0,1)^oC в течение 18−20ч, постоянно перемешивая. Лейкоциты удаляют центрифугированием, а надосадочную жидкость в количестве 4,5 л, содержащую интерферон, подкисляют 10% соляной кислотой до pH 2,2−2,4. Выдерживают подкисленный полуфабрикат интерферона в течение 10 дней для инактивации вируса-индуктора. Противовирусная активность полученного таким способом интерферона составляет 10−12тысяч МЕ/мл [15].

Таким образом, предлагаемый способ получения человеческого лейкоцитарнрого интерферона обеспечивает повышение его противовирусной активности в 2 и более раза по сравнению с предыдущим способом. Использование предлагаемого способа в производстве будет способствовать экономии материальных затрат, т.к. он направлен на более эффективное использование лейкоцитов, а не на увеличение их количествa.

Основным недостатком этих способов получения интерферонов являются вероятность контаминации конечного продукта вирусами человека, такими как вирус гепатитов В и С, вируса иммунодефицита и др [7].