Геномика — примеры моделей

Поиск открытых рамок считывания. Поиск кодирующих фрагментов

Открытые рамки считывания — это последовательности нуклеотидов в геноме исследуемого организма, потенциально кодирующие белковый продукт. Определена открытая рамка считывания как последовательность нуклеотидов РНК (или ДНК), при трансляции которой с помощью генетического кода данного организма не встречаются стоп-кодоны, или как фрагмент от стартового кодона до стоп-кодона. Важно понимать, что открытая рамка считывания не гарантирует реального присутствия в исходном организме хотя бы даже матричной РНК, транскрибируемой с данного фрагмента ДНК, а декодированная последовательность может существенно отличаться от аминокислотной последовательности реального белка. Вот лишь примерный список причин:

• • необходимость входа данного участка в транскрибируемую единицу;
• • возможная деградация/модификация мРНК или негативная регуляция транскрипции/трансляции для исследуемого организма (типа клеток/ ткани/физиологического состояния);
• • необходимость наличия на транскрипте факторов инициации трансляции;
• • возможные посттрансляционные модификации белка.

В случае прокариотических геномов задача поиска открытых рамок считывания успешно решается алгоритмами, напрямую декодирующими последовательность ДНК (пропуская транскрипцию), т. е. последовательность генома просто разбивается на открытые рамки считывания (участки, не несущие сгоп-кодонов), после чего полученные фрагменты транслируются в последовательности аминокислот. В качестве примера сервера, осуществляющего подобный сервис, можно отметить ORF Finder (http: // www.ncbi.nlin.nih.gov/gorf/gorf.html) (рис. 3.17), который позволяет производить поиск как во вводимых пользователем последовательностях, так и в базе нуклеотидных последовательностей GenBank. Также для отсеквенированных геномов часто доступны уже оттранслированные последовательности предполагаемых белков. В целом эффективность алгоритмов, решающих данную задачу, считается высокой.

Puc. 3.17. Пример вывода сервиса GoOrf:

показаны шесть вариантов трансляции последовательности нуклеотидов в последовательность аминокислот (три фазы триплетного кодирования для каждой из комплементарных цепей). Возможные рамки считывания (ORF) отмечены закрашенными областями. Справа приведены подробные характеристики обнаруженных фрагментов В случае эукариот из-за наличия сплайсинга поиск открытых рамок считывания прямым методом теряет смысл, поскольку интроны могут нести стоп-кодоны, но зато данный метод применим для анализа библиотек эукариотических кДНК^[1]. В итоге анализ эукариотических геномов требует создания моделей, производящих поиск сайтов инициации/терминации трансляции, а также создания методов, моделирующих процесс сплайсинга РНК.

В качестве примера подобного продвинутого метода, ориентированного на поиск эукариотических генов и выделения кодирующих последовательностей, рассмотрим архитектуру веб-сервиса GeneMark (http://exon. gatec h .edu/eu kh m m. cgi).

В основе сервиса GeneMark лежит скрытая модель Маркова с сохранением состояния (with duration). Характерным ее отличием является явное моделирование вероятности сохранения текущего скрытого состояния в череде итераций. Напомним, что в классических реализациях скрытых моделей Маркова сохранение текущего состояния обеспечивается через специальный переход к самому себе с константной вероятностью. При этом вероятность сохранения моделью текущего состояния в череде итераций характеризуется геометрическим распределением.

В НММ с сохранением состояния переход состояния к самому себе заменен более сложным поведением самого состояния, позволяя модели сохранить текущий статус (не осуществлять переход) с некоторой вероятностью, определяемой явно заданным распределением, в зависимости от непрерывного количества итераций, которые модель уже провела в данном состоянии.

Подобный подход может быть оправдан при моделировании с помощью одного состояния некоторых последовательностей, обладающих минимальной, максимальной и «типичной» длиной и, например, отличным от геометрического распределением отклонений от средней длины. Также данный подход применим для моделирования последовательностей, обладающих сложным распределением зависимости вероятности возникновения фрагмента от его длины (рис. 3.18).

Рис. 3.18. Пример распределения длин интронов Ciotia intestinalis.

Архитектура модели сервиса GencMark. hmm приведена на рис. 3.19 и включает следующие состояния:

• • состояние «межгенного интервала» — моделирует последовательности, находящиеся между генами;
• • стартовый участок (сайт) — моделирует участок инициации трансляции (начало гена);
• • состояние одноэкзонного гена;
• • состояние «стартового экзона» в гене, содержащем интроны;
• • цикл из состояний, моделирующих последовательности интронов, внутренних экзонов, а также последовательностей, располагающихся в сайтах, фланкирующих интроны (донорный и акцепторный сайты);
• • состояние «конечного экзона»;
• • состояние терминирующего сайта — конец гена.

Схема переходов состояний обеспечивает возможность моделирования межгенного участка, разделяющего гены, безинтронных генов, а также многоэкзонных генов с отдельным моделированием последовательностей, фланкирующих интроны.

Еще одним интересным отличием данной модели от классических НММ является применение негомогенных марковских цепей для описания генерируемых символов некоторыми из состояний. Если обычные (гомогенные) состояния генерируют символы с одинаковыми частотами вне зависимости от текущей итерации модели, то для негомогенных состояний частоты символов зависят от параметра t.

Рис. 3.19. Схема скрытых состояний и переходов модели GeneMark.hmm.

Так, вес состояния модели, кодирующие аминокислоты (начальный, конечный и внутренний экзоны, а также одноэкзонный ген), используют для генерации символов нуклеотидов трипериодическую негомогенную марковскую цепь. Иными словами, частоты символов нуклеотидов для кодирующих состояний в моменты t = 1, 4, 1… отличаются от частот для моментов t = 2, 5, 8… и от частот в моменты t- 3, 6, 9. Оправданность подобного подхода связана с тем, что кодирование аминокислот производится триплетами нуклеотидов и это приводит к появлению три-периодичности частот нуклеотидов в кодирующих участках генома. Также негомогенные (апериодические) марковские цепи использовались для частот сайтов инициации/терминации и участков, фланкирующих интроны.

Начальные параметры модели рассчитывались на основании соответствующих участков аннотированных геномов или задавались авторами модели исходя из общебиологических соображений, после чего производилась итерационная адаптация некоторых параметров к геномам конкретных организмов. Каждая итерация адаптации (обучения модели) включала обработку генома моделью с текущим состоянием параметров и перенастройку параметров модели с учетом произведенной аннотации. Так, в случае донорных (акцепторных) последовательностей, фланкирующих интроны, исходные параметры включали генерацию ГТ (АГ) пар, но после нескольких итераций самообучения были выявлены более протяженные участки, характеризующие данные сайты (рис. 3.20). Для выделения участков использовался расчет расстояния Кульбака — Лейблера между распределениями отдельных позиций соответствующих сайтов и средним распределением, характерным для интронных последовательностей.

Puc. 3.20. Логотипы сайтов, фланкирующие интроиы (донорный и актцепторный), обнаруженные алгоритмом GeneMark в результате самообучения.

• [1] Библиотеки кДНК (клонированной ДНК) получают путем применения обратнойтранскрипции к экстрактам мРНК. При наличии отссквенированной ДНК генома организмаудобнее оказывается работать с короткими фрагментами кДНК — экспрессируемыми маркерными последовательностями (EST, expressed sequence tags). Данные фрагменты можновыравнять с геномной ДНК, определив таким образом кодирующие участки.