Строение белковых молекул

Особый характер белка каждого вида связан не только с длиной, составом и строением входящих в его молекулу полипептидных цепей, но также и с тем способом, которым эти полипептидные цепи ориентируются в специфические, зачастую метастабильные конформации с различной степенью гидратации. В связи с этой метастабильностью хорошо известны изменения, быстро и необратимо происходящие при нагревании яичного белка. Они служат наглядным примером реакций, происходящих при денатурации.

Рис. 84. а-Спираль белковой молекулы.

Значительное внимание уделялось исследованию возможных способов расположения пептидных цепей, приводящих к устойчивым конформациям. В 1952 г. Л. Полинг показал, что наиболее выгодным расположением, которое осуществляется во многих пептидах и белках, является а-спираль. Пептидные цепи а-спирали свернуты таким образом, что возможно образование водородных связей между амидными водородными атомами и карбонильными группами, разделенными тремя-четырьмя аминокислотными фрагментами (рис. 84). Водородные связи почти параллельны основной оси спирали, а расстояние между витками составляет около 0,55 нм. На один виток а-спирали приходится около 3,6 остатка аминокислот. Боковые цепи аминокислот лежат на внешней стороне а-спирали. Однако пространственные затруднения, возникающие между боковыми группами некоторых аминокислот, могут существенно деформировать нормальную а-спираль и вызвать изгиб цепи. Наиболее существенно в этом отношении влияние пролина и оксипролина.

Вторичную структуру а-спирали имеют, например, миозин и а-кератин. Ряд белков (фиброин, p-кератин), состоящих в основном из небольших молекул аминокислот, образуют другую компактную вторичную структуру, называемую «сложенный лист*.

В структуре любого белка имеется, таким образом, несколько степеней усложнения. Первичная структура белка представляет собой специфическую последовательность аминокислот в полипептидной цепи. Вторичная структура определяется способом, которым скручена цепь; в частности, последняя может образовывать а-спираль. Наконец, третичная структура — это способ, которым свернутая в спираль цепь (цепи) изогнута и гидратирована в природном (нативном) белке. Для молекул белков, состоящих из нескольких полипептидных цепей, рассматривают и так называемые четвертичные структуры, определяющие тип взаимодействия между отдельными цепями.

Рис. 85. Пространственная структура цепи Р-гемоглобина.

На рис. 85 схематично изображена структура цепи р-гемоглобина. Черные точки изображают отдельные аминокислоты (их 146), связанные в цепь. Последовательность этих аминокислот образует первичную структуру этого фрагмента белковой молекулы. Конформация цепи в трехмерном пространстве, изображенная фигурой, похожей на свернутую змею, отражает третичную структуру цепи. Внутри обведенной фигуры цепь аминокислот имеет форму а-спирали, что определяет вторичную структуру фрагмента Р-гемоглобина. Квадрат со штриховкой обозначает гем с атомом железа. Молекула самого гемоглобина, находящегося в красных кровяных тельцах, состоит из четырех цепей: двух Р-гемоглобина и двух а-гемоглобина. Совокупность этих четырех цепей определяет четвертичную структуру гемоглобина.

Первичная структура белков устанавливается методами химической деструкции, в основном методом ступенчатого гидролиза или ферментативной деструкции с помощью различных «протеаз*. Используя набор различных «протеаз*, селективно гидролизующих связи между конкретными аминокислотами, изменяя условия ферментативного и химического гидролиза (время, температуру и pH), можно получать различные осколки, на основании которых создается представление об исходной белковой молекуле. Очень важную роль в определении первичной структуры белков сыграли методы определения концевых групп.

С-Концевые аминокислоты (аминокислоты со свободной СООН-группой) определяют, используя фермент карбоксипептидазу, которая селективно отщепляет эту аминокислоту от молекулы полипептида или белка. После ее идентификации операцию повторяют до определения всей последовательности аминокислот.

Метод Эдмана, разработанный для N-концевых аминокислот (аминокислот со свободной ГШ₂-группой), основан на реакции полипептидов или белков с фенилизотиоцианатом, образующим фенилтиомочевину по концевой NH₂-rpynne. При последующем гидролизе отщепляется фенилгидантоин, а остальная молекула не затрагивается:

После идентификации аминокислоты в фенилгидантоине (лучше всего с помощью ГЖХ) операцию повторяют до определения всей последовательности аминокислот.

Ранее для определения N-концевой аминокислоты широко использовали 2,4-динитрофторбензол. Незащищенные аминогруппы на концах цепей дают 2,4-динитрофенильные производные, по которым после кислотного гидролиза белка легко установить, какие именно аминокислоты были концевыми.

Последовательность аминокислот в коротких линейных пептидах (и особенно в циклопептидах) успешно определяют с помощью масс-спектрометрии.

В настоящее время первичная структура установлена приблизительно для 1300 белков, отдельные из которых содержат более 400 аминокислот (трансаминаза — 410 аминокислот), а получено синтетически более 60 белков.

Разработка автоматических анализаторов аминокислот с применением ионообменников и элюированием буферными растворами с возрастающими значениями pH позволяет в настоящее время работать с приборами, производящими за несколько часов полный количественный анализ любого белка (для навески в 5 мг) с точностью до 1%.

Рис. 86. Последовательность аминокислот в молекуле бычьего инсулина.

Найденная последовательность 51 аминокислоты в бычьем инсулине изображена на рис. 86. Дисульфидные связи удерживают две пептидные цепи в изогнутом состоянии и играют важную роль Ь определении конформации и физиологических свойств инсулина.

Последовательность аминокислот в пептидных цепях белков, например инсулина, производит впечатление случайного и лишенного систематичности набора; однако она может оказывать влияние на свойства белков несколькими способами. Так, кислотно-основные свойства белков и их изоэлектрические точки определяются числом и расположением кислых и основных аминокислот. Пространственное влияние замещающих групп определяет стабильность и точки изгиба пептидных спиралей. Последовательность аминокислот также может оказывать влияние на степень межмолекулярных взаимодействий и растворимость белков. Пептиды, состоящие из аминокислот одного типа, часто оказываются чрезвычайно малорастворимыми вследствие сильных внутримолекулярных взаимодействий. Если однородность цепи нарушается в результате включения в нее других аминокислот, то можно ожидать, что внутримолекулярные взаимодействия будут ослаблены.

Установлено, что белки могут иметь весьма различные размеры и форму. Определение молекулярной массы и размеров молекул белка выполняется с применением мощного арсенала физических методов исследований. Молекулярные массы можно определить с помощью измерения скоростей диффузии, скоростей седиментации в ультрацентрифуге, рассеяния света и даже путем измерения размеров индивидуальных больших по размеру молекул белка методом электронной микроскопии.

Сведения о форме молекул получают непосредственно с помощью электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа комплексов белков с тяжелыми металлами.

Применение этих методов часто встречает трудности вследствие высокой степени гидратации белков, а также способности многих белков вступать в обратимые реакции ассоциации, образуя димеры, тримеры и т. д. Молекулярные массы, молекулярные параметры и изоэлектрические точки ряда важных белков приведены в табл. 37.

Многие белки содержат такие металлы, как железо, цинк и медь. Атомы этих металлов принимают непосредственное участие в выполнении биологических функций тех молекул, в состав которых они входят. Примером могут служить известные свойства гемоглобина как переносчика кислорода в тканях, обусловленные наличием иона Fe²⁴.

Многие белки могут существовать в виде хорошо образованных кристаллов, что в принципе делает возможным установление их строения методом рентгеноструктурного анализа. Возникающие при этом проблемы весьма нелегки, поскольку даже в маленькой молекуле белка, например инсулина, надо установить положение 700 атомов (не считая Таблица 37. Некоторые типичные белки.

атомов водорода). Рентгеноструктурное исследование, оказавшееся чрезвычайно ценным источником сведений о структуре белков, приводит ко все большим успехам в установлении деталей их структуры. Например, на ранних стадиях исследования структуры железосодержащего белка миоглобина достигнутое разрешение составляло 0,6 нм, что не позволяло увидеть индивидуальные атомы, но указывало на скрученную форму пептидных цепей, обвивающих матрицу, состоящую из молекул воды (т. е. давало возможность установить третичную структуру). Увеличение разрешения до 0,2 нм позволило установить положение большинства индивидуальных аминокислот, основываясь на форме содержащихся в них заместителей (первичная и вторичная структура).

Биологические функции белков исключительно разнообразны. Некоторые из них обладают свойствами гормонов, регулирующих различные процессы обмена веществ (например, инсулин поддерживает уровень сахара в крови); другие белки действуют как катализаторы (ферменты) биологических процессов, и, наконец, ряд белков является биологическим строительным материалом (например, коллаген соединительных тканей и кератин волос). Выше уже были упомянуты свойства гемоглобина млекопитающих как переносчика кислорода. Функция некоторых белков крови заключается в образовании антител, обусловливающих сопротивляемость к заболеваниям, а так называемые нуклеопротеиды входят в качестве важной составной части в гены, которые несут наследственную информацию и передают ее в процессе деления клетки. Вирусы, например вирус табачной мозаики, состоят из нуклеопротеидов, заключенных в белковую оболочку. Структура многих вирусов настолько регулярна, что они могут быть получены в виде хорошо образованных кристаллов.