Использование метода полимеразной цепной реакции в реальном времени для детекции хантавирусной РНК

Использование метода полимеразной цепной реакции в реальном времени для детекции хантавирусной РНК

В настоящее время метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени широко используется для диагностики различных, в том числе и вирусных, заболеваний. Предлагаемая методика позволит проводить диагностику ГЛПС за довольно непродолжительное время. Методика включает в себя ПЦР в реальном времени, совмещенную с предварительной реакцией обратной транскрипции вирусной РНК и построением кДНК. Особенностью методики является проведение обеих реакций с помощью одного фермента — термостабильной ДНК-полимеразы Thermus thermophilus, которая обладает обратнотранскрибирующей активностью в присутствии ионов Mn І+ и полимеразной активностью в присутствии ионов MgІ+.

Башкортостан был и остается одним из самых крупных в мире районов-очагов ГЛПС. Возбудителями ГЛПС являются вирусы рода Hantavirus (семейство Bunyaviridae), которые подразделяются на несколько различных серотипов. Изоляты, выделенные в Башкортостане (Tkachenko et al., 1984), относятся к серотипу Puumala, представители которого вызывают менее тяжелые формы ГЛПС, нежели, например, серотип Hantaan. Однако, за последние несколько десятилетий (с момента регистрации ГЛПС в 1957 г.), эпидемиологическая картина мало изменилась. ГЛПС по заболеваемости занимает первое место среди природно-очаговых инфекций в РФ. Число зарегистрированных случаев в отдельные годы может достигать 20 тысяч и более, нередки летальные исходы (Морозов, 2001; Ткаченко, Дроздов, 2002). Поэтому разработка быстрых и эффективных диагностических тестов является актуальной проблемой.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени имеет несколько преимуществ перед обычной ПЦР (Klein, 2002; Tse, Capeau, 2003, Mackay, 2004):

1. возможность наблюдения за накоплением целевого продукта в данный момент на любой из стадий реакции амплификации

2. отсутствие постреакционных манипуляций для детекции образования целевого продукта (электрофоретический анализ и пр.), и, вследствие этого

3. сокращение времени от начала проведения ПЦР до получения конечного результата.

При этом, с использованием новой термостабильной ДНК-полимеразы Thermus thermophilus (Tth-полимеразы), появилась возможность проводить построение кДНК и последующую ее амплификацию в одной пробирке (Myers, Gelfand, 1991), опять же, значительно сокращая время проведения реакции.

Материалы и методы

Рибоолигонуклеотид. Для постановки модельных экспериментов был синтезирован 35-членный рибоолигонуклеотид HVIRNA (НПФ «СИНТОЛ», Москва.), соответствующий консервативному участку S-сегмента РНК хатавируса штамма CG-1820 / Уфа-83 (серотип Puumala):

5' - UGGCAUUUACAUCAAGGACAUUUCCAUACCUAAGG-3'

Праймеры. Для проведения синтеза кДНК использовался 16-членный праймер HV1, соответствующий участку с 288 по 303 нуклеотид «+» цепи кДНК S-сегмента штамма CG-1820 / Уфа-83:

5' - TAGGTATGGAAATGTC-3',

или соответствующий тому же участку кДНК праймер HV1-FAM (или его 21-членный аналог HV11-FAM), меченый флуоресцентным красителем карбоксифлуоресцеином (место модификации указано заглавной буквой):

5' - taggTatggaaatgtc-3' (5' - aggcttaggTatggaaatgtc-3').

Для последующей амплификации полученной кДНК использовались пары праймеров HV1/HV3 и HV1-FAM/HV3-ROX соответственно. Праймер HV3 комплементарен участку с 304 по 320 нуклеотид «+» цепи кДНК S-сегмента штамма CG1820 / Уфа-83:

5' - TGGCATTTACATCAAG-3'.

Праймер HV3-ROX комплементарен тому же участку кДНК и мечен флуоресцентным красителем карбокси-Х-родамином:

5' - tggcaTttacatcaag-3'.

Праймеры HV1 и HV3 были синтезированы в нашей лаборатории, праймеры с флуоресцентной меткой — НПФ «СИНТОЛ», Москва.

Для детекции результатов в реальном времени в реакции с немечеными праймерами использовали интеркалирующий флуоресцентный краситель SYBR Green I (Molecular Probes, USA), специфичный для двуцепочечной ДНК, который добавлялся непосредственно в реакционную смесь.

Ферменты. Синтез кДНК и последующая ПЦР проводились с помощью фермента термостабильной ДНК-полимеразы Thermus thermophilus — Tth-полимеразы («Сибэнзим», Новосибирск). Важным моментом является способность Tth-полимеразы вести обратную транскрипцию. Нужно отметить, что этой способностью Tth-полимераза обладает только в присутствии ионов Mn І+, а для полимеразной активности необходимы ионы MgІ+(Гребенникова и др., 1995). Поэтому, при проведении реакции, после стадии построения кДНК в буферной системе, содержащей ионы Mn І+, в реакционную смесь добавлялись ионы MgІ+ в достаточной для полимеразной активности фермента концентрации.

Синтез кДНК и ПЦР в реальном времени. Синтез комплементарной модельному рибоолигоонуклеотиду ДНК и последующую амплификацию полученной кДНК проводили в приборе iCycler iQ фирмы Bio-Rad (USA), в 30 мкл реакционной смеси, содержащей буфер для реакции обратной транскрипции (1×50мМ Tris-HCl, pH=8,5/25єС; 100мM KCl, 0,5мM MnCl2), 0,25 ммоль смеси dNTP, 40 пкмоль каждого праймера (т.к. обе реакции идут друг за другом, то в реакционную смесь добавляется сразу пара праймеров), 1 пкмоль рибоолигонуклеотида и 1−2 ед. Tth-полимеразы. Критической стадией при проведении данной реакции является стадия отжига праймера-затравки на рибоолигонуклеотидной матрице и последующее построение кДНК. Поэтому время для проведения этих операций было сознательно завышено и составило 5 мин. на каждую стадию: первая стадия — отжиг праймера при 32єС — 5 мин., синтез кДНК при 50єС — 5 мин., затем в реакционную смесь добавляли MgCl2 до конечной концентрации 10 мМ и проводили вторую стадию — 25 циклов — 80єС -4 с., 32єС — 8 с. Вся реакция, включая и время на добавление в реакционную смесь ионов MgІ+, занимает менее одного часа.

Параллельно для наглядности и сравнения эффективности методов проводились ПЦР в реальном времени с кДНК, полученной с помощью двух обратных транскриптаз: M-MLV-обратная транскриптаза, фирмы «Силекс» и AMV Reverse Transcriptase, фирмы «Promega». Синтез кДНК проходил на той же самой рибоолигонуклеотидной матрице в общем объеме 20 мкл при разбавлении ее в 10 раз. Реакционная смесь состояла из буфера (для M-MLV — обратной транскриптазы: 1×70мМ Tris-HCl, pH=8,3/25єС, 16,6 мМ (NH4) 2SO4, 75мM MgCl2; для AMV — обратной транскриптазы: 1×25мМ Tris-HCl, pH=8,3/25єС, 25 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 0,25 мМ спермидин, 5 мМ DTT), 0,25 ммоль смеси dNTP, 10 пкмоль праймера HV1 или HV1-FAM (HV11-FAM), 1 пкмоль рибоолигонуклеотида и 10 ед. обратной транскриптазы. Подготовленную смесь прогревали при 65єС в течение 2 мин, затем медленно охлаждали до комнатной температуры и проводили синтез кДНК при 37єС в течение 30 мин. Далее брали по 1 мкл полученного раствора в качестве матрицы для ПЦР в реальном времени со следующим режимом: 20 циклов — 32єС — 8 с., 80єС — 4 с. Время проведения реакции: синтез кДНК — 1 час, ПЦР — 40 минут.

Результаты и обсуждение В результате проводимых модельных реакций обратной транскрипции и амплификации мы получали ДНК-продукты размером 32 пн, которые для наглядности анализировали в 10% полиакриламидном геле (рис. 1а). На рис. 1б представлена кривая накопления ДНК-продукта в реальном времени в зависимости от количества циклов реакции. Видно, что количество наработанного продукта можно было детектировать уже с 15 цикла, и далее его накопление увеличивалось экспоненциально.

Рис. 1а Рис. 1б Рис. 1а: Рис. 1б:

1 — маркер pBSK/Hpa II 1 — амплификат с праймерами HV1/HV3

2 — амплификат с праймерами HV1/HV3 2 — минус-контроль

3 — минус-контроль Т. к. система флуоресцентных красителей FAM-ROX обладает большей чувствительностью, чем краситель SYBR Green I, то, хотя накопление ПЦР-продукта начинается несколько позже (рис. 2б), оно идет быстрее, поэтому для реакции с такими праймерами достаточно 20−22 циклов, что значительно сокращает время на проведение анализа.

Рис. 2а Рис. 2б

1 — маркер pBSK/Hpa II 1 — амплификат с праймерами HV1F/HV3R

2 — амплификат с праймерами HV1F/HV3R 2 — амплификат с праймерами

3 — минус-контроль HV11F/HV31R

4 — амплификат с праймерами 3 и 4 — минус-контроль

HV11F/HV31R

5 — минус-контроль Для сравнения на рис. 3а, б приведены результаты опытов с применением обратных транскриптаз. На кривой накопления ПЦР-продукта видно, что амплификат кДНК, полученной обратной транскриптазой M-MLV фирмы «Силекс», начинает детектироваться так же, с 14−16 цикла, но его накопление почти в два раза медленнее, и не достигает такого количества, как в предыдущих случаях. Накопление амплификата кДНК, полученной обратной транскриптазой AMV фирмы «Promega», достигает больших значений, но начинается только с 18−20 цикла и требует увеличения числа циклов реакции до 35, что значительно увеличивает время проведения анализа.

Рис. 3а, б:

1 и 2 — амплификаты кДНК, полученной обратной транскриптазой M-MLV:

1- с праймерами HV1F/HV3R, 2- с праймерами HV11F/HV31R

3 и 4 — амплификаты кДНК, полученной обратной транскриптазой AMV:

1- с праймерами HV1F/HV3R, 2- с праймерами HV11F/HV31R

5 — минус-контроль, 6 — маркер pBSK/Hpa II

Таким образом, проведенные модельные эксперименты показали возможность использования Tth-полимеразы и метода полимеразной цепной реакции в реальном времени для создания быстрого и эффективного диагностического теста — детекции хантавирусной РНК.

полимеразный цепной диагностика вирусный

1. Морозов В. Г. Применение индуктора эндогенного интерферона амиксина для лечения геморрагической лихорадки с почечным синдромом. /РМЖ — 2001, т. 9, № 15, с. 656−660/.

2. Ткаченко Е. А., Дроздов С. Г. Хантавирусы и хантавирусные лихорадки. /Эпидемиология и вакцинопрофилактика — 2002, № 6, с. 14−18/.

3. Гребенникова Т. В., Глюков А. И., Чистякова Л. Г., Киселев В. И., Северин Е. С. Использование термостабильной ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus KTP в комбинированной реакции обратной транскрипции и амплификации для детекции РНК интерлейкина 2-б и определения экспрессии гена множественной устойчивости к антибиотикам (MDR-1). /Молекулярная биология — 1995, т. 29, № 4, с. 930−941/.

4. Klein D. Quantification using real-time PCR technology: applications and limitations. /Trends Mol. Med. — 2002, V. 8 (6), p. 257−260/.

5. Mackay I.M. Real-time PCR in microbiology laboratory. /Clin. Microbiol. Infect. — 2004, V. 10 (3), p. 190−212/.

6. Myers T.W., Gelfand D.H. Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase. /Biochemistry — 1991, V. 30 (31), p. 7661−7666/.

7. Tse C., Capeau J. Real time PCR methodology for quantification of nucleic acids. /Ann. Biol. Clin. — 2003, V. 61 (3), p. 279−293/.