Общая микробиология

АЛТАЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ

Контрольная работа

по Общей микробиологии

Выполнил студент IIкурса заочного обучения:

Ряполов Д. Н г. Барнаул 2011

1. Понятие о культурных, ферментативных и тинкториальных свойствах микробов Бактериологическое исследование, применяемое для выявления патогенных бактерий в материале от больных животных или их трупов, обнаружение микробов в объектах внешней среды, кормах, мясе и т. д. Характер и методика взятия проб, способ пересылки материала при различных инфекционных болезнях неодинаковы, но существуют общие положения, которые необходимо учитывать независимо от объекта исследования и свойств материала. Исследуемый материал по возможности собирают в асептических условиях в стерильную посуду и доставляют в ближайшее время с сопроводительным документом в лабораторию (в нём указаны дата взятия, характер и источник материала, основные клинические признаки болезни и патологоанатомические изменения, цель исследования). Бактериологическое исследование включает 3 основных метода: микроскопию (бактериоскопию) мазков из патол. или др. исследуемого материала; выделение чистой культуры бактерий с последующим изучением морфологич., культурально-биохимич., антигенных и патогенных свойств бактерий.

Бактериологическое исследование начинают с микроскопии, что позволяет обнаружить в материале микробов, изучить их морфологию (форму, размер, строение). При микроскопии патол. материала готовят мазки-отпечатки из органов, тканей или тонкие мазки из др. исследуемого материала, высушивают их на воздухе, фиксируют (чаще фламбированием) и окрашивают тем или иным методом в зависимости от направленности исследования. Для обнаружения некоторых бактерий (напр., возбудителя туберкулёза) патол. материал предварительно обрабатывают одним из методов обогащения, чтобы повысить в нем концентрацию бактерий и избавиться от посторонних микробов. Для ускоренного обнаружения бактерии применяют люминесцентную микроскопию. Для изучения подвижности бактерий, обусловленной наличием жгутиков, используют микроскопию молодой (12—24 ч) живой культуры с помощью препаратов висячей капли или раздавленной капли. Подвижность бактерий может быть установлена также на основе особенностей роста культуры в полужидком МПА.

Выделение культуры бактерий проводят путём посева материала на питательные среды. Чтобы облегчить и ускорить выделение бактерий, используют дифференциально-диагностические и элективные питат. среды (плотные и жидкие), на к-рых определенные виды бактерий дают характерный для них рост (при этом задерживается рост посторонних микробов). Посев на плотные питат. среды в бактериол. чашках проводят путём растирания шпателем нескольких капель материала по поверхности среды. При исследовании паренхиматозных органов убитых или павших животных обжигают или фламбируют кусочек органа, затем надрезают его стерильными ножницами и с помощью пинцета проводят надрезанной поверхностью по питат. среде в чашке. В жидкую среду посев материала делают пастеровской пипеткой. Чтобы получить рост изолированных колоний микробов на плотной среде и отделить исследуемые бактерии от сопутствующих микроорганизмов, проводят дробный посев по методу Дригальского. Засеянные чашки и пробирки инкубируют в термостате при оптимальной для роста каждого вида бактерий темп-ре (чаще 37 °С) в течение 1—2 суток, в некоторых случаях (туберкулёзные бактерии) — до 3—4 нед. Наиболее длительный и сложный этап Б. и.— родовая и видовая идентификация выделенных культур. Изучают только чистые культуры, полученные после пересева из одной колонии и имеющие идентичные морфологич. и тинкториальные свойства. Антигенные свойства культуры изучают в реакции агглютинации. Определение патогенных свойств бактерий проводят путём заражения лабораторных животных культурой или фильтратом культуры (при определении токсинообразования).

После изучения свойств бактерий сопоставляют полученные данные с признаками бактерий, имеющимися в классификационных схемах или определителях микробов (Д. Берджи, 1974; Н. А. Кра-силышков, 1949, и др.), и проводят их родовую и видовую дифференциацию. В сомнительных случаях проводят повторное исследование материала. Результаты Б. и. записывают в регистрационный журнал или на бланке лабораторной экспертизы, в заключении к-рой указывают, какой микроб выделен из исследуемого материала. Диагноз на инфекционную болезнь может быть поставлен только при учёте эпизоотологич., клинич. и патологоанатомич. данных.

КУЛЬТУРА МИКРООРГАНИЗМОВ, популяция клеток микроорганизмов (бактерии, дрожжи, актиномицеты, плесневые грибы), выращенная в жидкой или на плотной питательной средах. Различают чистую и смешанную культуры. Если на питательной среде вырастают микроорганизмы одного вида, то такая культура называется чистой; при наличии роста микробов двух или большего числа видов — смешанной. Чистоту культуры определяют путём микроскопии мазков, приготовленных из культур в жидкой и на плотной средах, учитывая при этом однотипность колоний на плотной среде, а также на основе изучения культуральных, биохимических и антигенных свойств микроорганизмов.

Культура бактериальная — популяция жизнеспособных бактерий, выращенных на питат. среде. Чистая культура бактерий, выделенная из к.-л. источника в определённое время, наз. штаммом. Наиболее типичные штаммы, обладающие характерными физиол. и биол. свойствами, присущими данному виду бактерий, наз. эталонными и используются для сравнения с ними вновь выделяемых культур. Идентификация и дифференциация бактерий могут быть проведены лишь в том случае, когда имеется чистая культура. Поэтому при получении смешанной культуры прибегают к различным методам очистки её от посторонних микробов. Эталонные штаммы применяют в производстве диагностических и иммунных препаратов (для изготовления антигенов, получения сывороток, вакцин, антитоксинов). Для продолжительного хранения культуры бактерий чаще используют полужидкий (0,25—0,3%) МПА (к полученной культуре добавляют слой стерильного вазелинового масла), мясопептонный печёночный бульон с вазелиновым маслом и др. Наиболее надёжная сохранность культур достигается при их лиофиль-ном высушивании. Правила хранения культуры бактерий и порядок их отпуска в учреждения определены специальной инструкцией. На каждый штамм бактерий заполняется паспорт, в котором указывают время и источник выделения культуры, свойства и особенности штамма.

Тинкториальные свойства — свойства бактерий, грибов и простейших, характеризующие их способность вступать в реакцию с красителями и окрашиваться определенным образом.

Бактерии имеют разнообразную форму и довольно сложную структуру, определяющую многообразие их функциональной деятельности. Для бактерий характерны четыре основные формы: сферическая (шаровидная), цилиндрическая (палочковидная), извитая и нитевидная. Бактерии шаровидной формы — кокки — в зависимости от плоскости деления и расположения относительно друг друга отдельных особей подразделяются на микрококки (отдельно лежащие кокки), диплококки (парные кокки), стрептококки (цепочки кокков), стафилококки (имеющие вид виноградных гроздьев), тетракокки (образования из четырех кокков) и сарцины (пакеты из 8 или 16 кокков).Палочковидные бактерии располагаются в виде одиночных клеток, диплоили стрептобактерий. Извитые формы бактерий — вибрионы и спириллы, а также спирохеты. Вибрионы имеют вид слегка изогнутых палочек, спириллы — извитую форму с несколькими спиральными завитками. окраски микроорганизмов используют основные красители, которые более интенсивно связываются кислыми компонентами клетки. Из сухих красителей, продающихся в виде порошков, готовят насыщенные спиртовые растворы, а из них — водно-спиртовые, которые и служат для окрашивания микробных клеток. Микроорганизмы окрашивают, наливая краситель на поверхность мазка на определенное время. Окраску основным фуксином ведут в течение 2 мин, метиленовым синим — 5—7 мин. Затем мазок промывают водой до тех пор, пока стекающие струи воды не станут бесцветными, высушивают осторожным промоканием фильтровальной бумагой и микроскопируют в иммерсионной системе. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения совершенно прозрачно, а клетки интенсивно окрашены.

Существуют несколько основных окрасок: по Граму, по Цилю-Нильсену, по Ауески, Нейссера, Бури-Гинса.

Ферментативные свойства бактерий обусловлены набором ферментов, отражают определенные условия питания и обмена веществ, свойственные данному виду микроорганизмов в тех или иных условиях внешней среды. Бактерии рода Salmonella характеризуются следующими ферментативными свойствами: не разжижают желатина, не разлагают адонита и не ферментируют сахарозу; подавляющее большинство не расщепляет салицина и не разлагает лактозу, не образует индола, не расщепляет мочевину, не дает реакции Фогес-Проскауера (реакция на ацетилметилкар-бинол); ферментирует (за небольшим исключением мальтозу, маннит, сорбит, расщепляет глюкозу с образованием газа (S. typhi, S. pullorum обычно не образуют газа); дает положительную реакцию с метиловым красным, утилизирует аммоний и редуцирует нитраты; большинство из них продуцирует сероводород.

Для изучения ферментативных свойств бактерий рода Salmonella обычно используют короткий цветной (пестрый) ряд, состоящий из сред с глюкозой, маннитом, арабинозой, дульцитом, рамнозой (среда Биттера); глицеринофуксиновый бульон (бульон Штерна). Помимо указанных сред для дифференциации серологических типов сальмонелл используют также среды с мальтозой, инозитом, трегалозой, ксилозой; лакмусовое молоко (изменение лакмусового молока при росте сальмонелл позволяет их дифференцировать по способности образовывать кислоту или щелочь). Вместо лакмусового можно использовать обезжиренное молоко с индикатором бромтимоловым синим (1 мл 0,4%-ного раствора в 100 мл молока). Известное значение для дифференциации сальмонелл имеет образование сероводорода культурой. Протеолитические свойства исследуют путем посева изучаемой культуры сальмонелл на МПЖ и молоко.

Ввиду сходства бактерий рода Salmonella с другими микроорганизмами семейства Enterobacteriaceae возникает необходимость их дифференциации. В настоящее время в бактериологической практике широко используют плотные дифференциально-диагностические питательные среды с лактозой (среды Плоскирева, Эндо, Левина). По способности бактерий ферментировать лактозу гальмонеллы отличают от часто сопутствующей Е. соН, поэтому при исследовании материала на сальмонеллы вначале производят высев на одну из дифференциально сред. На этих средах E. coli, ферментирующая лактозу с образованием кислоты и изменением и пета индикатора, образует колонии, отличающиеся по цисту от колоний сальмонелл, не ферментирующих лактозу. На среде Эндо бактерии E. coli дают колонии красного цвета, часто с металлическим блеском, сальмонеллыбесцветные или бледно-розовые (окрашенные в цвет среды); на среде Плоскирева E. coli — колонии оранжево-красного цвета, сальмонеллы — прозрачные пли нежно-розовые; на среде Левина E. coli формируют колонии черного цвета, окруженные ободком, сальмонеллыпрозрачные, нежно-розовые или розовато-фиолетовые. Для дифференциации сальмонелл и культурально сходных штаммов, а также бактерий рода Proteus и бактерий группы кишечных палочек применяют среды с мочевиной (среда Прейса, Ресселя, Олькеницкого), SS-arap (Salmonella — Shigella — агар) и др. Цвет этих сред обусловлен неодинаковой интенсивностью расщепления микроорганизмами азотистых веществ с образованием щелочных продуктов. Бактерии группы кишечных палочек и Proteus (за исключением 0-формы), как правило, на SS-arape не дают роста, а сальмонеллы растут в виде нежных, бесцветных колоний.

Плотные дифференциально-диагностические среды служат лишь для определения принадлежности бактерий к роду Salmonella и отделения их от сопутствующей микрофлоры.

Для наиболее эффективного выделения сальмонелл из патологического материала, содержащего большое (количество сопутствующей микрофлоры, препятствующей их росту, используют специальные среды обогащения (Мюллера, Кауфмана и др.). Тетратионовый натрий, добавляемый в среду Мюллера, подавляет рост бактерий группы кишечных палочек, но не препятствует развитию сальмонелл. Среда Кауфмана представляет собой модифицированную среду Мюллера, к которой добавлены раствор бриллиантовой зелени и натуральная бычья желчь. Эти компоненты задерживают рост бактерий группы кишечных палочек и особенно протеуса, но способствуют росту сальмонелл.

Ферментативные свойства сальмонелл не всегда стабильны и могут изменяться в зависимости от условий внешней среды, поэтому правильное типизирование сальмонелл возможно лишь в результате изучения комплекса морфологических, культуральных, ферментативных свойств и антигенной структуры.

2. Генетические рекомбинации. Трансдукция. Трансформация. Конъюгация микроб пищеварение инфекция Рекомбинация — процесс обмена генетическим материалом путем разрыва и соединения разных молекул. Рекомбинация происходит при репарации двунитевых разрывов в ДНК и для продолжения репликации в случае остановки репликационной вилки у эукариот, бактерий и архей. У вирусов возможна рекомбинация между молекулами РНК их геномов.

Рекомбинация у эукариот обычно происходит в ходе кроссинговера в процессе мейоза, в частности, при формировании сперматозоидов и яйцеклеток у животных. Рекомбинация, наряду с репликацией ДНК, транскрипцией РНК и трансляцией белков, относится к фундаментальным, раноГомологичная рекомбинация Гомологичная рекомбинация Классификация типов гомологичной рекомбинации: аллельная, эктопическая и гомеологичная; реципрокная (кроссинговер) и нереципрокная (генная конверсия).

Реципрокная рекомбинация. Ранние представления о природе кроссинговера: гипотезы «разрыв и соединение» и «выборочное копирование». Опыты Мезелсона по доказательству механизма «разрыв и соединение». Разработка методических подходов к изучению молекулярных механизмов рекомбинации. Два этапа формирования рекомбинантной ДНК: «состыкованная» (joint) и первичная рекомбинантная молекулы.

Генетический контроль гомологичной рекомбинации у бактериофагов. Система Red у бактериофага l. Экзонуклеаза l. Система Orf. Бактериофаг Т4: роль генов 30, 32, 43, 46, 47, 49 и uvsX. Энзимология рекомбинационных реакций: эндои экзонуклеазы, ДНК-полимераза, ДНК-лигаза, белок UvsX, белок SSB и другие белки. Процессы «вытеснения нити», образования D-петли, «миграции ветвления», коррекции гетеродуплекса. Основные стадии кроссинговера: пресинапсис, синапсис и постсинапсис. Схемы кроссинговера у бактериофагов. Общность процессов рекомбинации и репарации ДНК.

Основные модели гомологичной рекомбинации. Модель Холлидея. Предпосылки модели, сущность, значение. Развитие модели в последующих исследованиях, ее современное состояние. Модель Мезелсона-Рэдинга. Модель репарации двунитевых разрывов (ДНР) ДНК у дрожжей (Жостак и др.) применительно к кроссинговеру и конверсии.

Рекомбинация при трансформации хромосомной ДНК у бактерий. Параметры рекомбинации. Размеры интегрируемых фрагментов донорной ДНК. Кинетика и эффективность трансформации. Доказательства интеграции однонитевых фрагментов донорной ДНК. Генетический контроль и основные этапы процесса трансформации у Bacillus subtilis и Streptococcus pneumoniae. Донорно-реципиентный комплекс. Генетический контроль и механизм рекомбинации при трансформации у Haemophilus influenzae. Трансформосома.

Рекомбинация при конъюгации у Escherichia coli. Характеристика конъюгационного переноса ДНК. Механизмы интеграции донорной ДНК в хромосому реципиентной клетки.

Генетический контроль гомологичной рекомбинации у E.coli. Гены, участвующие в пресинапсисе: recA, recB, recC, recD, recE, recJ и др. Плейотропный эффект мутаций recB и recC. АТФ-зависимая RecBCD-нуклеаза, ее актвности, механизмы действия и роли в различных генетических процессах. Chi-сайт как горячая точка рекомбинации. Универсальность АТФ-зависимых нуклеаз для бактерий. Гены, контролирующие процесс синапсиса: recA, recF, recO, recR, ssb и др. Свойства recA-мутантов. Белок RecA, его характеристика. Реакции, катализируемые белком RecA, его ключевая роль в первых этапах процесса кроссинговера: пресинапсисе и синапсисе. Природа синапсиса при гомологичной рекомбинации. RecA-ДНК-филаменты, их структура и функции в рекомбинации. Схема кроссинговера у E. coli с участием RecBCD-нуклеазы и белка RecA. RecA-гомологи у других прокариотических и эукариотических организмов. Роль белка SSB. Гены постсинапсиса: ruvA, ruvB, ruvC, recG и их продукты. Pоль в осуществлении миграции полухиазмы Холлидея и в ее разрешении.

Супрессорные мутации sbcA, sbcB, sbcC и sbcD. Экзонуклеазы I и VIII. SbcCD-нуклеаза. Три пути рекомбинации хромосомной ДНК у E. coli K-12 по Кларку: RecBCD, RecF и RecE, их характеристика. Роль путей RecF и RecE в гомологичной рекомбинации плазмид.

Особенности процесса кроссинговера у эукариот. Мейотический кроссинговер. Роль синаптонемного комплекса. Генетический контроль мейотической рекомбинации. Разнообразие RecA-подобных белков (рекомбиназ) у эукариот.

Митотический кроссинговер: соотношение между реципрокной и нереципрокной рекомбинацией. Кроссинговер в G1-клетках. Различия в генетическом контроле мейотического и митотического кроссинговера у дрожжей-сахаромицетов.

Горячие точки рекомбинации у эукариот. Роль ДНР ДНК в инициации мейотического и митотического кроссинговера.

Рекомбинационная репарация ДНР в хромосомной и плазмидной ДНК у дрожжей. Генетический контроль и разнообразие механизмов: модель Жостака и др. и ее модификации, механизмы «разрыв и копирование», «отжиг комплементарных цепей ДНК» («single-strand annealing»), «гомолог-зовисимое лигирование».

Эктопическая рекомбинация, ее генетический контроль, молекулярные механизмы и биологическое значение.

Конверсия гена (коррекция рекомбинационного гетеродуплекса). Нереципрокность внутригенной рекомбинации. Гипотеза коррекции неспаренных оснований (Холлидей). Генетический контроль и пути коррекции гетеродуплексов у E.coli. Системы репарации неспаренных оснований с образованием и застройкой протяженных брешей в гетеродуплексе. Система Mut HLSU, ее характеристика. Молекулярная модель коррекции гетеродуплекса с участием системы MutHLSU. Эволюционный консерватизм белков MutL и MutS. Роль белков MutL и MutS в процессах коррекции неспаренных оснований и в регуляции гомеологичной рекомбинации. Системы коррекции неспаренных оснований у E. coli с формированием и застройкой коротких брешей. Коррекция гетеродуплексов при бактериальной трансформации, ее генетический контроль (система Hex), влияние на результаты генетического картирования. Коррекция и высокая отрицательная интерференция.

Конверсия гена у эукариот. Тетрадный анализ межаллельных скрещиваний. Типы тетрад. Полярность конверсии, ее причины. Коконверсия. Протяженность участка конверсии. Вопрос о связи мейотической конверсии с реципрокной рекомбинацией фланговых маркеров. Митотическая аллельная генная конверсия. Эктопическая мейотическая и митотическая конверсия. Переключение локусов MAT у гомоталличных дрожжей. Генетический контроль конверсии гена у экариот на примерах дрожжей и человека. Эукариотические гомологи бактериальных белков MutL и MutS — семейства белков PMS, MHL, MHS и др., их функции в рекомбинации и других клеточных процессах. Сложность систем коррекции неспаренных оснований у эукариот, основанная на участии разнообразных гомологов батериальных белков MutL и MutS.

Роли конверсии в эволюции и в онтогенезе. Соотношение между процессами кроссинговера и конверсии в различных генетических системах. Конверсионные процессы, осуществляющиеся независимо от кроссинговера.

Рекомбинационные процессы, не нуждающиеся в гомологии для синапсиса Сайт-специфическая рекомбинация. Распространение сайт-специфических рекомбинационных систем у прокариот и эукариот, их функции. Сайт-специфические топоизомеразы типа I как ключевые белки сайт-специфической рекомбинации у бактериофагов, бактерий и дрожжей. Два семейства сайт-специфических топоизомераз I — интегразы и резолвазы.

Сайт-специфическая рекомбинация при интеграции и эксцизии фага l. Схема Кемпбела. Различия между генетическими картами вегетативного фага и профага. Структура сайтов attP и attB. Система Int. Int-белок как представитель семейства интеграз. Белок IHF E.coli. Интасома. Молекулярная модель интеграции и эксцизии фага l. Антипараллельное выстраивание att-сайтов при синапсисе. Природа синапсиса при сайт-специфической рекомбинации.

Сайт-специфические инверсии ДНК у бактериофагов и бактерий (система Din) и у дрожжей. Ключевые белки рекомбинации — инвертазы как представители семейства резолваз. Рекомбинационные энхансеры для сайт-специфических инверсий. Белок Fis E.coli. Инвертасома. Молекулярная модель рекомбинации, осуществляемой резолвазами. Роль сайт-специфических инверсий в регуляции экспрессии генов.

Транспозиции подвижных генетических элементов. Транспозиции у прокариот. Подвижные генетические элементы: IS-элементы, транспозоны (Tn), фаг Мu. Структура подвижных элементов. Функции, контролируемые различными подвижными элементами. Транспозаза. Участие белков клетки-хозяина в транспозиции. Вопрос о специфичности интеграции подвижного элемента в ДНК-мишень. Общность реакций, составляющих процессы транспозиции у разных типов подвижных элементов прокариот и эукариот.

Генетическая организация простых транспозонов семейства Tn3. Гены tnpA и tnpR, их продукты. Репликативная транспозиция, два этапа процесса. Молекулярная модель Шапиро. Генетический контроль и молекулярный механизм нерепликативной транспозиции у сложных транспозонов Tn5, Tn9 и Tn10. Генетический контроль и механизмы транспозиции у фага Mu. Транспозосома.

Конъюгативные транспозоны грамположительных и грамотрицательных бактерий, их классификация. Генетический контроль и механизмы транспозиции. Биологическое значение.

Подвижные генетические элементы эукариот (дрожжи, растения, дрозофила, млекопитающие). Классификация эукариотических подвижных элементов. Элементы со структурой прокариотического типа. Ретротранспозоны типа I у дрожжей, растений и животных, их структура, генетический контроль и механизм транспозиции, классификация. Ретротранспозоны типа II: особенности строения, распространение, механизм транспозиции.

Генетические эффекты, вызываемые подвижными элементами у прокариот и эукариот: изменения экспрессии генов, генные мутации, хромосомные перестройки, гибридный дисгенезиз. Участие подвижных элементов в организации структуры хромосом. Роль в онтогенезе живых организмов и в эволюции генетического материала. Подвижные элементы как инструмент генетических исследований.

Незаконная рекомбинация. Круг явлений, относимых к незаконной рекомбинации. Негомологичная рекомбинация у бактерий, катализируемая ДНК-гиразой. Молекулярная модель (Икеда). Негомологичная рекомбинации с участием ДНК-зависимой протеинкиназы у позвоночных. Роль в репарации двунитевых разрывов, интеграции экзогенной ДНК в хромосомы и в перестройках иммуноглобулиновых последовательностей ДНК.

Запрограммированные рекомбинационные перестройки генетического материала в онтогенезе Состыковка разобщенных частей генов с помощью сайт-специфической рекомбинации в процессе споруляции у Bacillus subtilis и при формировании гетероцист у нитчатых цианобактерий. Перестройка генетического материала при образовании макронуклеуса у ресничных инфузорий. Диминуция хроматина у ряда представителей беспозвоночных.

Сайт-специфическая рекомбинация у позвоночных, участвующая в перестройках иммуноглобулиновых последовательностей ДНК. Структура молекул иммуноглобулинов. Организация и структура последовательностей ДНК, участвующих в формировании генов, кодирующих иммуноглобулины. Роль продуктов генов RAG1 и RAG2. Механизм сайт-специфической рекомбинации при состыковке кодирующих сегментов генов иммуноглобулинов. Участие других генетических процесов в формировании генов иммуноглобулинов: гомологичная рекомбинация (эктопический митотический кроссинговер, эктопическая митотическая конверсия), незаконная рекомбинация, гипермутагенез, альтернативный сплайсинг. Приуроченность этих процессов к определенным стадиям дифференцировки B-лимфоцитов.

Трансформация — процесс поглощения клеткой организма свободной молекулы ДНК из среды и встраивания её в геном, что приводит к появлению у такой клетки новых для неё наследуемых признаков, характерных для организма-донора ДНК. Иногда под трансформацией понимают любые процессы горизонтального переноса генов, в том числе трансдукцию, конъюгацию и т. д.

Трансформация прокариот В любой популяции лишь часть бактерий способна к поглощению из среды молекул ДНК. Состояние клеток, при котором это возможно, называют состоянием компетентности. Обычно максимальное число компетентных клеток наблюдается в конце фазы логарифмического роста.

В состоянии компетентности бактерии вырабатывают особый низкомолекулярный белок (фактор компетентности), активизирующий синтез аутолизина, эндонуклеазы I и ДНК-связывающего белка. Аутолизин частично разрушает клеточную стенку, что позволяет ДНК пройти через неё, а также снижает устойчивость бактерий к осмотическому шоку. В состоянии компетентности также снижается общая интенсивность метаболизма. Возможно искусственное приведение клеток в состояние компетентности. Для этого применяют среды с высоким содержанием ионов кальция, цезия, рубидия, электропорацию или заменяют клетки реципиента протопластами без клеточных стенок.

Эффективность трансформации определяется количеством колоний, выросших на чашке Петри после добавления к клеткам 1 мкг суперскрученной плазмидной ДНК и рассева клеток на питательную среду. Современные методы позволяют добиваться эффективности 106—109.

Поглощаемая ДНК должна быть двухнитевой (эффективность трансформации однонитевой ДНК на порядки ниже, однако несколько возрастает в кислой среде), её длина — не менее 450 пар оснований. Оптимальное pH для прохождения процесса — около 7. Для некоторых бактерий (Neisseria gonorrhoeae, Hemophilus) поглощаемая ДНК должна содержать определённые последовательности.

ДНК необратимо адсорбируются на ДНК-связывающем белке, после чего одна из нитей разрезается эндонуклеазой на фрагменты длиной 2—4 тыс. пар оснований и проникает в клетку, вторая полностью разрушается. В случае, если эти фрагменты имеют высокую степень гомологии с какими-либо участками бактериальной хромосомы, возможна замена этих участков на них. Поэтому эффективность трансформации зависит от эволюционного расстояния между донором и реципиентом. Общее время процесса не превышает нескольких минут. Впоследствии, при делении, в одну дочернюю клетку попадает ДНК, построенная на основе исходной нити ДНК, в другую — на основе нити с включённым чужеродным фрагментом (выщепление)

Трансформация эукариотических клеток с использованием синтетических полимерных катионов

Доставка чужеродных нуклеиновых кислот внутрь интактных клеток, или трансформация, лежит в основе многих методов генной инженерии. Транспортировка функциональных генов в ткани может сделать возможной коррекцию генной недостаточности и мутаций, следствием которых являются тяжелые наследственные патологии или раковые опухоли. В настоящее время разработан целый ряд приемов для введения ДНК в клетки, среди которых наиболее распространены преципитация фосфатом кальция или диэтиламиноэтил-декстраном (ДЕАЕ-декстраном), электропорация, микроинъекция, встраивание ДНК в реконструированную оболочку вирусов или липосомы (искусственные мембранные липидные везикулы).

Несмотря на разнообразие этих методов, поиск новых путей трансформации прои эукариотических клеток продолжается. С одной стороны, это вызвано необходимостью повышения эффективности трансформации, с другой — перечисленные выше методы применимы лишь для ограниченного числа клеточных линий и неэффективны при попытках введения в клетки РНК. Наконец, большинство этих подходов не может быть использовано для генетической трансформации in vivo.

В качестве переносчиков ДНК используются ретровирусные векторы, векторы на основе ДНК-содержащих вирусов и ВИЧ, липосомы на основе катионных липидов, полимерные ДНК-связывающие катионы. Использование синтетических полимеров в качестве переносчиков ДНК имеет ряд преимуществ: удобство хранения и очистки, простота тестирования токсичности и безопасности и, что особенно важно для генной терапии, снижение риска патогенетических и иммунологических осложнений.

При смешивании растворов линейных поликатионов и ДНК формируются интерполиэлектролитные комплексы (ИПЭК) за счет образования кооперативной системы межцепных электростатических связей. При этом поликатионные цепи окружают молекулу ДНК, образуя сферы или тороиды, в зависимости от типа полимера. Включение в ИПЭК приводит к компактизации ДНК, повышению ее устойчивости к действию нуклеаз, способствует усилению ее взаимодействия с клеточной мембраной и повышению трансформирующей активности по отношению как к прокариотическим, так и эукариотическим клеткам. Соединяя молекулы поликатиона с лигандами, способными к специфическому связыванию с клеточной мембраной, можно обеспечить проникновение ИПЭК в клетку по рецепторному пути, а в организме — адресную доставку к клеткам-мишеням.

Системы доставки ДНК для применения в генной терапии должны обеспечивать проникновение ДНК в нужный орган, ткань, или в конкретную группу клеток, а затем — в клеточное ядро. Антисмысловые олигонуклеотиды, а именно они чаще всего используются в генной терапии, должны найти ту мРНК или участок хромосомной ДНК, против которой они направлены. Введенный ген должен войти в состав конструкции, способной его экспрессировать.

Однако это довольно сложная проблема. При введении нуклеиновой кислоты или олигонуклеотида в организм они не попадут преимущественно к нужной ткани или нужному органу, а та их часть, которая окажется в нужном месте, лишь в незначительной мере сможет пройти сквозь гидрофобную клеточную мембрану. Кроме того, в ходе эволюции были выработаны механизмы защиты клеток организма от вторжения факторов внешней среды, в том числе и чужеродной ДНК. Оказавшись внутри клетки, чужеродная ДНК может локализоваться не там, где это необходимо и, более того, может оказаться в лизосомах, где будет разрушена под действием нуклеаз.

Проникновение в клетку и внутриклеточный транспорт ИПЭК происходит, возможно, за счет образования и последовательного разрушения эндосом. На каждом из этапов этого процесса существенная часть материала теряется. Скудное высвобождение векторов из эндосом в цитоплазму и неэффективный перенос их в ядро приводят к низкой эффективности трансгенной экспрессии.

Рестрикционная карта плазмиды pBR 322:

цифрами указана нумерация нуклеотидов;

тонкие черточки — единичные сайты, узнаваемые рестриктазами;

толстые серые стрелки сверху — направление транскрипции;

Pbla — промотор гена Ampr — устойчивость к ампициллину;

Ptetпромотор гена Tetrустойчивость к тетрациклину;

TТ1 — Rho-независимый терминатор транскрипции (положение 3140−3160); ТТ2 — положение 3080−3110; ROP — белок, способствующий образованию дуплексов между РНК 1 и РНК 2 (негативный регулятор копийности); РНК 1 — контрольная РНК (контролирует копийность плазмиды); РНК 2 — «праймерная» РНК (служит затравкой для репликации); толстые черные стрелки — направление транскрипции РНК 1 и РНК 2

Векторы на основе фага М13

Можно выделить три пути повышения эффективности переноса ДНК в эукариотические клетки с помощью синтетических поликатионов. Во-первых, это повышение специфичности трансфекции за счет лигандов, соединенных с молекулой поликатиона и обеспечивающих избирательное взаимодействие комплексов с клетками определенного фенотипа. Во-вторых — повышение эффективности трансформации за счет подбора генов или олигонуклеотидов, внедряемых в клетку. В-третьих — повышение частоты трансфекции, которое достигается за счет применения лигандов, более эффективно взаимодействующих с клеточной мембраной, и веществ, дестабилизирующих мембрану. Кроме того, возможен синтез новых поликатионов.

В лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии НИИ гриппа РАМН в Санкт-Петербурге проводится изучение средств доставки ДНК и вирусных частиц в клетки. В этой работе используется набор полимерных носителей, синтезированный сотрудниками Института высокомолекулярных соединений РАН. В качестве экспрессионных векторов использовались плазмиды: pUC 18, содержащая цитомегаловирусный промотор и ген b-галактозидазы, и pBR 322, содержащая цитомегаловирусный промотор и ген зеленого флуоресцирующего белка водорослей.

В результате проведенных исследований было выяснено, что наибольшую трансфекционную активность имеют ИПЭК поли-(2-(диметиламино)этил)метакрилата (PDMAEMA) с низкими молекулярными массами. Дальнейшие исследования позволят разработать новые подходы к решению актуальных проблем в вирусологии, молекулярной и клеточной биологии, генной инженерии, генной терапии.

Трансдукция (от лат. transductio — перемещение) — процесс переноса бактериальной ДНК из одной клетки в другую бактериофагом. Общая трансдукция используется в генетике бактерий для картирования генома и конструирования штаммов. К трансдукции способны как умеренные фаги, так и вирулентные, последние, однако, уничтожают популяцию бактерий, поэтому трансдукция с их помощью не имеет большого значения ни в природе, ни при проведении исследований.

Общая (неспецифическая) трансдукция Осуществляется фагом P1, существующим в бактериальной клетке в виде плазмиды, фагами P22 и Mu, встраивающимися в любой участок бактериальной хромосомы. После индуцирования профага с вероятностью в 10?5 на одну клетку возможна ошибочная упаковка фрагмента ДНК бактерии в капсид фага, ДНК самого фага в нём в этом случае нет. Длина этого фрагмента равна длине нормальной фаговой ДНК, его происхождение может быть любым: случайный участок хромосомы, плазмида, другие умеренные фаги.

Попадая в другую бактериальную клетку, фрагмент ДНК может включаться в её геном, обычно путём гомологичной рекомбинации. Перенесённые фагом плазмиды способны замыкаться в кольцо и реплицироваться уже в новой клетке. В ряде случае фрагмент ДНК не встраивается в хромосому реципиента, не реплицируется, но сохраняется в клетке и транскрибируется. Это явление носит название абортивной трансдукции.

Специфическая трансдукция Наиболее хорошо изучена специфическая трансдукция на примере фага л. Этот фаг встраивается только в один участок (att-сайт) хромосомы E. coli с определённой последовательностью нуклеотидов (гомологичной att-участку в ДНК фага). Во время индукции его исключение может пройти с ошибкой (вероятность 10?3—10?5 на клетку): вырезается фрагмент тех же размеров что и ДНК фага, но с началом не в том месте. При этом часть генов фага теряется, а часть генов E. coli захватывается им. Вероятность переноса гена в этом случае падает при увеличении расстояния от него до att-сайта.

Для каждого специфически встраивающегося в хромосому умеренного фага характерен свой att-сайт и, соответственно, расположенные рядом с ним гены, которые он способен передавать. Ряд фагов может встраиваться в любое место на хромосоме и переносить любые гены по механизму специфической трансдукции. Кроме того, в хромосоме обычно есть последовательности, частично гомологичные att-участку ДНК фага. При повреждении полностью гомологичного att-сайта можно добиться включения фага в хромосому по этим последовательностям и передачу в ходе специфической трансдукции генов, соседних уже с ними.

Когда умеренный фаг, несущий бактериальные гены, встраивается в хромосому новой бактерии-хозяина, она содержит уже два одинаковых гена — собственный и принесённый извне. Поскольку фаг лишён части собственных генов, часто он не может индуцироваться и размножиться. Однако при заражении этой же клетки «вспомогательным» фагом того же вида, индуцирование дефектного фага становится возможным. Из хромосомы выходят и реплицируются как ДНК нормального «вспомогательного» фага, так и ДНК дефектного, вместе с переносимыми им бактериальными генами. Поэтому около 50% образующихся фаговых частиц несут бактериальную ДНК. Это явление носит название трансдукции с высокой частотой (HFT от англ. high frequency transduction).

Конъюгамция (от лат. conjugatio — соединение), парасексуальный процесс — однонаправленный перенос части генетического материала (плазмид, бактериальной хромосомы) при непосредственном контакте двух бактериальных клеток. Открыт в 1946 году Дж. Ледербергом и Э. Тайтемом. Имеет большое значение в природе, поскольку способствует обмену полезными признаками при отсутствии истинного полового процесса. Из всех процессов горизонтального переноса генов конъюгация позволяет передавать наибольшее количество генетической информации.

Механизм Для успешного установления контакта двух клеток в клетке-доноре должна присутствовать конъюгативная (половая, трансмиссивная) плазмида. Первой из них была открыта F-плазмида: эписома (способная встраиваться в бактериальную хромосому), длиной около 100 тыс. пар оснований. Плазмида несёт гены, кодирующие ряд функций. Одна из них — образование половых пилей, отвечающих за приклепление к клетке-реципиенту.

Конъюгативные плазмиды также кодируют белки, противодействующие прикреплению пилей других бактерий к клеточной стенке данной. Поэтому клетки, уже содержащие трансмиссивные плазмиды, на несколько порядков реже выступают в роли реципиентов при конъюгации.

Плазмидой кодируется эндонуклеаза, разрезающая одну из нитей её ДНК в определённой точке (oriT). Затем разрезанная цепь раскручивается и 5'-концом переносится в клетку-реципиент. Выдвигалось предположение, что ДНК передаётся по каналам в половых пилях, но к настоящему времени показано, что перенос идёт через поры в клеточной стенке. В первом сегменте поступающей в клетку реципиента нити ДНК расположены антирестрикционные гены. Эти гены должны транскрибироваться в реципиенте сразу же после своего поступления туда, чтобы обеспечить накопление белков, блокирующих процесс разрушения ДНК рестриктазами. Наконец, переданная цепь замыкается в кольцо и на её основе восстанавливается двунитевая структура ДНК плазмиды. Весь процесс длится несколько минут.

Конъюгативная плазмида может встраиваться в хромосому путём гомологичной рекомбинации с участием IS-элементов. Конъюгация при этом идёт по тому же механизу, однако реципиенту передаётся не только плазмида, но и хромосомный материала донора. В этом случае процесс затягивается на часы, часто происходит разрыв передаваемой нити ДНК. Путём искусственного прекращения передачи ДНК в разное время и наблюдения за тем, какие гены были при этом переданы, была получена карта хромосомы кишечной палочки (E. coli) и показано её кольцевое строение.

При выщеплении из хромосомы плазмида может захватывать её фрагмент и переносить его с собой в другую клетку (аналогия с трансдукцией). Данный процесс носит название сексдукции.

Некоторые мелкие плазмиды, называемые мобилизуемыми, могут быть перенесены при конъюгации с помощью аппарата переноса «хелперной» трансмиссивной плазмиды. Для этого они должны содержать последовательности, аналогичные oriT конъюгативной плазмиды и распознаваемые её эндонуклеазами.

3. Микрофлора преджелудков и ее участие в пищеварении В преджелудках жвачных развиваются в основном анаэробные микроорганизмы: простейшие (инфузории) и бактерии. В каждую из этих групп входит большое число видов. Видовой состав зависит от того, какой корм превалирует в рационе. При смене рациона меняется и популяция микроорганизмов. Поэтому для жвачных важное значение имеет постепенный переход от одного рациона к другому.

В содержимом рубца имеется большое количество видов бактерий; общее их количество может достигать 10 в 1 г. Рост и размножение одних микроорганизмов сопровождаются автолизом и отмиранием других, поэтому в рубце всегда присутствуют живые, разрушающиеся и мертвые микроорганизмы. В преджелудках содержатся кокки, стрептококки, молочнокислые, целлюлозолитические и другие бактерии, которые попадают в рубец с кормом и водой и благодаря оптимальным условиям активно размножаются. Самые важные микроорганизмы рубца — целлюлозолитические. Эти бактерии расщепляют и переваривают клетчатку, что имеет большое значение для питания жвачных.

Амилолитические бактерии, в основном стрептококки, представлены в рубце многочисленной группой. Они находятся в рубце при даче различных рационов, их количество особенно возрастает при использовании зерновых, крахмалистых и сахаристых кормов.

Молочнокислые бактерии в преджелудках играют важную роль при сбраживании простых углеводов (глюкоза, мальтоза, галактоза, лактоза и сахароза). Молочнокислые бактерии имеют большое значение в молочном кормлении.

Между всеми видами микроорганизмов существует симбиотическая связь: активное размножение одних видов может стимулировать или тормозить размножение других. Так, развитие стрептококков сдерживает рост молочнокислых бактерий, и наоборот, активное размножение молочнокислых бактерий создает неблагоприятную среду для жизнедеятельности стрептококков.

Простейшие рубца относятся к подтипу инфузорий, классу ресничных инфузорий, состоящему из десятка родов и множества (около 100) видов. Они попадают в преджелудки, как и многие другие микроорганизмы, с кормом и очень быстро размножаются (до 4−5 поколений в день). В 1 г содержимого рубца находится до 1 млн инфузорий, размеры их колеблются от 20 до 200 мкм. Инфузории играют важную биологическую роль в рубцовом пищеварении. Они подвергают корм механической обработке, используют для своего питания трудноперевариваемую клетчатку и благодаря активному движению создают своеобразную микроциркуляцию среды. Внутри инфузорий можно увидеть мельчайшие частицы корма, съеденного животным. Инфузории разрыхляют, измельчают корм, в результате чего увеличивается его поверхность, он становится более доступным для действия бактериальных ферментов. Инфузории, переваривая белки, крахмал, сахара и частично клетчатку, накапливают в своем теле полисахариды. Белок их тела имеет высокую биологическую ценность. Однако значение инфузорий для рубцового пищеварения изучено еще недостаточно, так как их трудно изучать вне организма.

Значение микроорганизмов не ограничивается только расщеплением корма в преджелудке. В процессе жизнедеятельности микроорганизмы синтезируют белки своего тела. Продвигаясь вместе с кормовой массой по пищеварительному тракту, они перевариваются и используются организмом животного, доставляя ему более полноценный белок по сравнению с тем, который был получен с кормом. За счет микроорганизмов жвачные получают за сутки около 100 г полноценного белка. Это очень важный биотехнологический процесс. Микробный белок — это белок животного происхождения, он является полноценным, так как содержит незаменимые аминокислоты.

Клетчатка — сложный полисахарид. Она составляет основную массу корма у сельскохозяйственных животных. В растительных кормах ее содержится до 40−50%. В пищеварительных соках животных нет ферментов, переваривающих клетчатку, однако в преджелудках жвачных расщепляется 60−70% перевариваемой клетчатки под действием целлюлозолитических бактерий.

Клетчатка имеет большое физиологическое значение для жвачных не только как источник энергии, но и как фактор, обеспечивающий нормальную моторику преджелудков. Ферменты бактерий расщепляют клетчатку (сложный полисахарид) до более простых форм: вначале до дисахарида целлюбиозы, а затем до моносахарида глюкозы. Продукты расщепления клетчатки в рубце подвергаются различным видам брожений. [5]

В рубце жвачных крахмал легко сбраживается с образованием летучих и нелетучих жирных кислот. Расщепляют крахмал бактерии и инфузории. Последние переваривают крахмал, захватывая его зерна. Бактерии воздействуют на крахмал с поверхности. Бактерии и инфузории, расщепляя крахмал, накапливают внутриклеточный полисахарид гликоген, а также амилопектин, который медленно и длительно сбраживается, что способствует сохранению постоянства биохимических условий в рубце и предупреждает возникновение интенсивного брожения при поступлении свежего корма. Простые сахара (дисахариды и моносахариды) всегда содержатся в траве и других кормах, а также образуются в рубце как промежуточный продукт ферментации при расщеплении клетчатки и гемицеллюлозы. При сбраживании сахаров появляются молочная, уксусная, пропионовая и масляная кислоты. Интенсивность бродильных процессов очень велика, за сутки в рубце образуется до 4 л летучих жирных кислот (ЛЖК). Летучие жирные кислоты, образующиеся в рубце, почти полностью всасываются в преджелудках. В свободном состоянии они усваиваются лучше, чем их соли. Всосавшиеся ЛЖК используются организмом жвачных в качестве главного источника энергии и как исходные компоненты в различных ассимиляторных процессах: они служат одним из источников образования жира.

В рубце жвачных под действием протеолитических ферментов микроорганизмов растительные белки корма расщепляются до пептидов, аминокислот, а затем до аммиака. Микроорганизмы рубца могут использовать не только белок, но и не белковые азотистые вещества. Из аммиака и продуктов расщепления углеводов корма микроорганизмы синтезируют более полноценный белок своего тела, в состав которого входят многие независимые аминокислоты.

В процессе жизнедеятельности микроорганизмы рубца синтезируют и витамины группы В: рибофлавин, тиамин, никотиновую, фолиевую, пантотеновую кислоты, биотин, пиридоксин, цианокобаламин, а также жирорастворимый витамин К (филлохинон). Поэтому взрослые жвачные при сбалансированном кормлении не нуждаются в добавлении этих витаминов в рацион, но молодняк, у которого рубец еще не функционирует, должен получать их с кормом. Установлена следующая закономерность синтеза витаминов. Если увеличивают количество витаминов в корме, то объем синтеза их в рубце уменьшается. Синтез витаминов зависит также от наличия необходимых предшественников, например кобальта для синтеза цианокобаламина. [3]

Число простейших в рубце меньше по сравнению с числом бактерий. Если в эксперименте из рубца удаляются простейшие, то их функцию берут на себя бактерии. В рубце жвачных обычно встречаются две большие группы простейших — энтодиниоморфы и голотрихии, утилизирующие крахмал и растворимые сахара. Простейшие обладают ферментативной активностью и способствуют стабилизации рубцовой среды. Они прикрепляются к крупным частицам корма, что препятствует их выходу из рубца с жидкой фазой. Средняя продолжительность пребывания инфузорий в рубце — 10 ч. Степень адгезии является благоприятным фактором для их жизнедеятельности. Некоторые представители рода Epidinium выделяют ферменты, лизирующие межклеточное вещество, вследствие чего растительные ткани распадаются и пищевой субстрат фрагментируется. После этого они, как и энтодиниоморфы, заглатывают и внутриклеточно утилизируют крупные частицы субстрата. Большое количество голотрихий может также скапливаться на слизистой оболочке преджелудков.

4. Виды инфекции Инфемкция — заражение живых организмов микроорганизмами — бактериями, грибами, простейшими, — или вирусами. Термин означает различные виды взаимодействия чужеродных микроорганизмов с организмом животного.

ЭКЗОГЕННАЯ ИНФЕКЦИЯ (от греч exo — снаружи, вне иgenes — рождающий, рождённый), инфекция, вызванная возбудителем, поступившим в организм из окружающей среды.

ЭНДОГЕННАЯ ИНФЕКЦИЯ — инфекция, обусловленная активацией уже находящегося в организме облигатно-патогенного микроба (напр., микобактерий туберкулеза) или микробами — нормальными обитателями тела человека. Обычно наступает в результате снижения естественного или (и) приобретенного иммунитета, а также в результате пассивного заноса большой дозы микроба в стерильные области тела человека. методы микробиологической диагностики такие же, как при экзогенных инфекциях. Кроме установления возбудителя, важно определить, в т. ч. иммунологическими методиками, поврежденное звено иммунной системы и факторы, вызвавшие его повреждение. Следует отличать от метастатической инфекции. Самозаражение организма бактериями, поступающими не из внешнего мира, но живущими в норме на коже и слизистых данного организма, а также такими, к-рые могли остаться в скрытом, латентном состоянии в различных органах и тканях после какого-нибудь ранее перенесенного инфекционного заболевания, например, дифтерии или брюшного тифа. Известны случаи остеомиэлитов, наступивших даже через несколько лет после перенесенного брюшного тифа. А. возможна чаще всего в тех случаях, когда имеется нарушение целости или расстройство кровообращения и питания в тех органах и тканях, в которых вегетируют бактерии, гл. обр., в эпителии слизистых оболочек и кожи. Во время эпидемий у совершенно здоровых лиц, соприкасающихся с больными, нередко обнаруживаются вполне жизнеспособные и вирулентные микроорганизмы, возбудители данной эпидемии, в полости рта, носоглотки, в жел.-киш. тракте, в дыхательных путях и проч СМЕШАННАЯ ИНФЕКЦИЯ, заболевания, вызываемые не одним, а несколькими видами микроорганизмов; если одна инфекция следует за другой, то говорят о вторичной инфекции. В практических целях вторичные инфекции могут быть включены в группу смешанных. Количество отдельных видов смешанной инфекции чрезвычайно велико, но практическое значение имеют преимущественно наиболее часто встречающиеся формы. Количество заболеваний при отдельных формах смешанной инфекции стоит в связи со свойствам микроорганизмов, входящих в состав возбудителей, с особенностями поражаемого макроорганизма, с социально-бытовыми условиями и с эпидемическим состоянием данной местности. Инфицирование организма одновременно и последовательно различными микроорганизмами в зависимости от их особенностей или не изменяет их вирулентности или, наоборот, в значительной степени может вносить изменения как в сторону усиления, так и в сторону ослабления. К сожалению сочетаний, дающих ослабление вирулентности возбудителей, в них входящих, имеется немного (малярия и прогрессивный паралич, возвратный тиф и прогрессивный паралич). Чаще комбинация возбудителей не изменяет их вирулентности или повышает ее (дифтерия и стрептококковая инфекция, грипп и скарлатина, корь и tbc, коклюш и tbc и т. д.).— Из особенностей макроорганизма, оказывающих влияние на заболеваемость теми или другими формами смешанной инфекции, наибольшую роль играют возраст, конституция и наличие патологических состояний.