Трансформация растительных клеток

Генетическая трансформация растительных клеток наблюдается в природных условиях. Образование растительных опухолей, например корончатых галлов, индуцируется бактериями Agrobacterium tumefacienc в результате внедрения в клетку Ту-плазмиды — кольцевой ДНК с молекулярной массой порядка 1000 kDa. В плазмиде Т, идентифицирован сайттДНК, конкретно ответственный за трансформацию растительной клетки. тДНК внедряется в се хромосому и изменяет многие стороны клеточного метаболизма. Раковые клетки приобретают способность к неконтролируемому росту даже на минимальной питательной среде, лишенной фитогормонов, которые они, в отличие от интактных клеток, синтезируют в достаточном количестве. Другим примером генетической трансформации в природных условиях является заболевание растений, связанное с разрастанием корней. Причиной этого является внедрение в растительную клетку R-плазмиды из бактерий Agrobacterium rhizogenes. В этой плазмиде также имеется фрагмент ДНК, способный встраиваться в хромосому растительной клетки, подобно транспозону. Приведенные примеры инициировали многих ученых формировать сообщества всевозможных микробных и растительных клеток с целью получения новых полезных свойств у последних. Спонтанное воздействие на геном растительных клеток не увенчалось серьезными успехами (за исключением некоторых вариантов ассоциации растений с цианобактериями). Гораздо перспективнее представляется генно-инженерная трансформация клеток растений. Для этого необходимо получить жизнеспособный протопласт, из которою затем возможно было бы образование сначала трансформированной клетки, а затем и растения-регенеранта. Для решения этой задачи следует:

• • выбрать растение, протопласты клеток которого способны к регенерации. В настоящее время таких растений не так много, однако их количество из года в год увеличивается;
• • сконструировать вектор для внесения чужеродного генетического материала в растительную клетку. Эта задача облегчается наличием природных Т, — и Rj-плазмид, которые спонтанно внедряются в растительную клетку. Кроме того, можно использовать растительные вирусы, а также химерные структуры, состоящие из бактериальных плазмид, соединенных с ДНК митохондрий или хлоропластов растения;
• • защитить вектор от разрушающего действия эндонуклеаз растительной клетки.

Введение

вектора в растительную клетку возможно при помощи липосом, причем для введения в протопласт растения наиболее эффективны липосомы, состоящие из фосфотидилсерина и холестерина.

Наиболее простым способом отбора трансформированных клеток является введение в плазмиду вместо онкогенов тДН К генов устойчивости к антибиотикам. Однако попытки введения в вектор генов устойчивости к антибиотикам оказались безуспешными, гак как они не экспрессировались в растительных клетках.

Проблема была решена, когда удалось найти промотор гена нопалин-синтазы и ввести его в Т.-плазмиду. Регуляторные системы гена — нопалин синтазы — способствовали экспрессии генов устойчивости к антибиотикам, и отбор трансформированных клеток оказался возможным на селективных средах, содержащих антибиотики.

Был рассмотрен метод трансформации растительных клеток при помощи микроорганизмов рода Agrobacterium. Существует еще ряд методов, например: свободное поглощение чужеродного генетического материала в процессе кокультивирования с растительными клетками, инъекция ДНК в растительные клетки и целые растения и др. В результате разработанных методов генетическая инженерия получила возможность надежной трансформации ряда растений, в том числе и сельскохозяйственных культур. Так, имеются хорошие перспективы получения азотфиксируюших растений (гл. 24). Гены, устойчивые к гербицидам, выделенные из бактерий и дрожжей, переносятся в растительные клетки. Это открывает возможность использования гербицидов для уничтожения сорняков без ущерба для сельскохозяйственных культур. При помощи генной инженерии получены растения с заранее программированными свойствами. Впервые трансгенные растения были получены в 1981 г. в ФРГ. Г. Шелл и соавторы в протопласт табака ввели Т.-плазмиду с геном октопинсинтстазы. Из протопластов затем было получено растение-регенерант, синтезирующее несвойственную для него аминокислоту октопин. Далее в результате совершенствования техники генной инженерии был получен ряд трансгенных растений — сельскохозяйственных культур, таких, как соя, картофель, табак, ячмень и др.