Лабораторная диагностика различных вариантов миелодиспластического синдрома

Министерство Здравоохранения Республики Беларусь Учреждение образования Гомельский государственный медицинский университет Медико-диагностический факультет Кафедра внутренних болезней № 1 с курсом гематологии Допущена к защите:

Заведующий кафедрой Мистюкевич И.И.

Лабораторная диагностика различных вариантов миелодиспластического синдрома Дипломная работа Исполнитель:

Студентка группы Д-604 Лебедько О.С.

Научные руководители:

К.м.н., доцент Ходулева С.А.

Заведующий отделением клинико-диагностической лаборатории ГУ, РНПЦРМ и ЭЧ, Прокопович А.С.

Рецензент:

Ассистент кафедры внутренних болезней № 1с курсом гематологии, Суворов Д.И.

Гомель 2012

Реферат Дипломная работа содержит 57страниц, 7 таблиц, 14 рисунков, 25 источников.

Ключевые слова: миелодиспластический синдром, острый миелобластный лейкоз, рефрактерная анемия, рефрактерная анемия с кольцевыми сидеробластами, рефрактерная анемия с избытком бластов, рефрактерная анемия с избытком бластов в трансформации, хронический миеломоно-цитарный лейкоз, предраспологающие факторы, дисгранулопоэз, дизэритопоэз, дисмегакариоцитопоэз, костный мозг, периферическая кровь.

Объект исследования: пациенты с различными вариантами миелодиспластического синдрома.

Предмет исследования: результаты лабораторного исследования периферической крови и костного мозга.

Методы исследования: морфологические исследования крови и костного мозга, иммунофенотипирование, цитогенетические исследования, определение ферритина.

Цель исследования: определить ведущие клинико-лабораторные характеристики различных вариантов миелодиспластического синдрома с учетом морфологических, цитологических, цитогенетических исследований.

Задачи исследования:

1.Провести обзор литературы по вопросам этиопатогенеза, распространенности, клиники МДС.

2.Изучить современные методы диагностики различных вариантов МДС.

3.Оценить клинические симптомы и изменения лабораторных показателей при различных вариантах МДС.

4.Провести анализ МДС по Гомельской области.

5.Разработать диагностический алгоритм различных вариантов МДС на основании полученных данных.

Актуальность: МДС — это заболевание, носящее клоновый характер и возникающее в результате мутации полипотентной стволовой клетки, что обусловливает высокую степень риска трансформации в острый лейкоз. Из-за разнообразия клинических проявлений, трудностей в диагностике и лечении, МДС является одной из сложных нозологических форм в онкогематологии. Своевременная, достоверная диагностика конкретного варианта МДС позволит выбрать оптимальную специфическую терапию, улучшить качество жизни пациента и прогноз заболевания в целом.

Содержание Перечень условных обозначений Введение Глава 1. Обзор литературы

1.1 Эпидемиология миелодиспластического синдрома

1.2 Классификация миелодиспластического синдрома

1.3 Этиология и патогенез миелодиспластического синдрома

1.4 Клиническая картина миелодиспластического синдрома

1.5 Диагностика миелодиспластического синдрома

1.5.1 Морфологические исследования крови и костного мозга

1.5.2 Иммунофенотипирование

1.5.3 Цитогенетическое исследование

1.5.4 Определение ферритина Глава 2. Материалы и методы

2.1 Материалы исследования

2.2 Методы исследования Глава 3. Результаты собственных исследований

3.1 Общая характеристика пациентов с МДС

3.2 Лабораторная характеристика отдельных вариантов МДС Выводы Список использованной литературы Перечень условных обозначений МДС — миелодиспластический синдром ОМЛ — острый миелобластный лейкоз КМ — костным мозгом ПК — периферической крови ФАБ — франко-американо-британская классификация

RA — рефрактерная анемия

RARS — рефрактерная анемия с кольцевидными сидеробластами

RAEB — рефрактерная анемия с избытком бластов

RAEBt — рефрактерная анемия с избытком бластов, трансформирующихся в острый лейкоз

CMML — хронический миеломоноцитарный лейкоз

MIC — группа изучения морфологии, иммунологии, цитогенетики ВОЗ — Всемирной организации здравоохранения

IPSS — Международную Числовую Систему прогноза ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

IL-3 — интерлейкин-3

G-CSF — гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

GM-CSF — гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

TNF-Ј - фактора некроза опухоли

TGFЈ - трансформирующего ростового фактора

IL-1b — интерлейкина-1b

M-CSF — макрофагальный колониестимулирующий фактор

JMML — ювенильный миеломоноцитарный лейкоз

NF — нейрофиброматозом

TCR — Т-клеточного рецептора

ALIP — патологическая локализация незрелых клеток МАТ — моноклональные антитела

FITC — флюоресцеинизотиоционат

FISH — флюоресцентная гибридизация in situ

СФ — сывороточный ферритин

FBL ферритин-связывающие лимфоциты Введение Миелодиспластический синдром (МДС) — это гетерогенная группа приобретенных клональных заболеваний, развивающихся из плюрипотентной гемопоэтической стволовой клетки с вовлечением в патологический процесс клеток миелои В-лимфопоэза.

МДС — гемопоэтическое клоновое заболевание, основным проявлением которого является неэффективное кроветворение и риск трансформации в острый миелобластный лейкоз (ОМЛ). Под неэффективным гемопоэзом подразумевается несоответствие между нормоили гиперклеточным костным мозгом (КМ), с одной стороны, и одно-, двухили трехростковой цитопенией в периферической крови (ПК) — с другой.

Вероятность прогрессирования МДС в ОМЛ зависит от целого ряда факторов и может происходить в сроки от 5 месяцев до 6 лет. То есть течение МДС варьирует от индолентных вариантов, со стабильно сохраняющимся в течение длительного времени уровнем бластов в КМ, до быстро прогрессирующих форм. Это позволяет рассматривать МДС как предлейкозное состояние, при котором опухолевый клон может и не трансформироваться в явный ОМЛ. Хотя в последнем случае возможно, что больной не доживает до трансформации в ОМЛ, а умирает от осложнений цитопении.

МДС может возникать как de novo, так называемый первичный МДС, или развиваться после применения мутагенных агентов (химиои/или лучевая терапия) по поводу другого, обычно опухолевого, заболевания. Второй вариант носит название вторичный МДС В последние годы интерес к этой патологии значительно возрос, что связано с тенденцией к росту ее частоты, быстрым прогрессированием, высокой летальностью и отсутствием до настоящего времени эффективных схем терапии. Гетерогенность природы МДС обуславливает сложности в его диагностике.

На сегодняшний день актуальным является разработка унифицированных диагностических критериев конкретного варианта МДС с использованием морфологических, цитологических и цитогенетических методов. Своевременная, достоверная диагностика позволит выбрать оптимальную специфическую терапию, улучшить качество жизни пациента и прогноз заболевания в целом.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Эпидемиология миелодиспластического синдрома Средняя частота заболеваемости МДС во всем мире составляет 4,9 на 100 000 человек в год. Средний возраст больных составляет 75,4 года[1,4,8]. Распределение МДС по возрастным группам (%)[4,6]:

среди лиц моложе 20 лет — 0,3%

в группе 20−30 лет — 0,6%

30 — 40 лет — 1,6%

40−50 лет — 2,2%

50−60 лет -8,5%

60−70 лет — 25,9%

70- 80 лет — 41,6%

старше 80 лет — 18,7%.

У мужчин заболеваемость встречается в 1,4 раза чаще, чем у женщин (преимущественное увеличение заболеваемости МДС у мужчин в возрасте старше 80 лет)[1,18].

По данным литературы, начиная с 1996 года наметилась устойчивая тенденция к росту первичных миелодиспластических синдромов у взрослого населения РБ, в частности в Могилевской, Гомельской и Брестской областях частота этого заболевания повысилась в 1,5 — 2 раза[6,18].

По отдельным вариантам МДС распределение следующее (%)[6,8]: рефрактерная анемия — 49,3%

рефрактерная анемия с кольцевыми сидеробластами — 8,7%

рефрактерная анемия с избытком бластов — 26,5%

рефрактерная анемия с избытком бластов в трансформации — 7,2% хронический миеломоноцитарный лейкоз — 8,1%.

1.2 Классификация миелодиспластического синдрома В 1982 г. франко-американо-британской (ФАБ) рабочей группой была предложена классификация МДС, позволяющая по результатам исследования КМ и ПК разграничивать МДС от ОМЛ и выделять отдельные варианты МДС (табл.1). Поэтому верификация диагноза МДС основана прежде всего на выявлении морфологических признаков дисгранулопоэза, дизэритопоэза, дисмегакариоцитопоэза и количестве бластов в КМ и ПК. Другие особенности, такие как кольцевидные сидеробласты, палочки Ауэра и моноцитоз являются вспомогательными критериями для дифференцировки вариантов. Принципиальным для диагностики МДС по ФАБ-классификации является обнаружение диспластических изменений, по крайней мере, в клетках 2 из 3 гемопоэтических линиях [4,8,9].

Выделяют следующие варианты МДС [1,18]:

1.Рефрактерная анемия (RA) — характеризуется ретикулоцитопенией с количеством бластов в КМ 5% и менее. Прогноз благоприятен.

2.Рефрактерная анемия с кольцевидными сидеробластами (RARS) — подразумевает обнаружение кольцевидных сидеробластов более чем в 15% от общего числа эритробластов. Прогноз благоприятен.

3.Рефрактерная анемия с избытком бластов (RAEB) — характеризуется наличием бластов в КМ от 5 до 20% и ПК от 1 до 5%. Высока трансформация в лейкоз. Прогноз неблагоприятен.

4.Рефрактерная анемия с избытком бластов, трансформирующихся в острый лейкоз (RAEBt) — количество бластов в ПК и КМ более чем 5% и 20% соответственно. Все случаи трансформируются в острый лейкоз. Прогноз неблагоприятен.

5.Хронический миеломоноцитарный лейкоз (CMML) — характеризуется моноцитозом в ПК и КМ.

Таблица 1

FAB — классификация миелодиспластических синдромов.

В 1988 Группа изучения морфологии, иммунологии, цитогенетики (MIC) предложила рабочую классификацию для первичного (MDS) и вторичного (t-MDS) МДС и представила цитогенетический анализ диагностики данного заболевания. Дальнейшее развитие систематизации МДС нашло отражение в проекте классификации МДС Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), которая методологически отличается от FAB-классификации. В 2001 ВОЗ предложила окончательные новые схемы классификации опухолей гематопоэтической и лимфоидной тканей, где отдельно выделена классификация МДС (табл. 2) [8,9].

Таблица 2

Классификация миелодиспластических синдромов (ВОЗ 2008).

*- хромосомные аномалии, которые рассматривают как предполагаемое свидетельство наличия МДС при стойкой цитопении неопределенного происхождения и при отсутствии абсолютных морфологических критериев МДС:

1.несбалансированные аномалии: — 7 или del (7q); - 5 или del (5q); i (17q) или t (17p); - 13 или del (13q); del (11q); del (12p) или t (12p); del (9q); idic (X)(q13)

2.сбалансированные аномалии: t (11;16)(q23;p13.3); t (3;21)(q26.2;q22.1); t (1;3)(p36.3;q21.1); t (2;11)(p21;q23); inv (3)(q21q26.2); t (6;9)(p23;q34)

3.сложный кариотип (3 или более хромосомных аномалий) с вовлечением вышеупомянутых нарушений [8,9,18].

В 1997 году Greenberg с колегами представил Международную Числовую Систему прогноза (IPSS). Эта система предполагает разделение пациентов на группы риска, основанные на клинических, морфологических и цитогенетических особенностях (табл.3,4). Наиболее важными прогности-ческими факторами согласно IPSS являются — количество бластов в КМ, цитогенетические аномалии и количество ростков гемопоэза в цитопении (характеристика цитопении ростков гемопоэза: гемоглобин менее 100 г/л, абсолютное число нейтрофилов менее 1,5*109/л, количество тромбоцитов ПК менее 100*109/л) [1,4,8].

Таблица 3

Международная числовая система прогноза (IPSS) МДС.

Таблица 4

Характеристика категорий риска согласно IPSS МДС.

1.3 Этиология и патогенез миелодиспластического синдрома В настоящее время возникновение МДС рассматривается как результат кумулятивного воздействия внешних факторов на генетически предрасположенных лиц. Под генетической предрасположенностью подразумевается комплекс факторов, включающий, с одной стороны, естественный полиморфизм ДНК в генах, отвечающих за восстановление ДНК и метаболизм канцерогенов, и с другой — индивидуальные различия по уровню отдельных энзимов, вовлеченных в активацию или детоксикацию канцерогенов. Накопленные данные позволяют предположить связь образования МДС с радиацией, курением, пестицидами, органическими химикатами и тяжелыми металлами [1,8,11].

МДС может возникать как de novo, так называемый первичный МДС, или развиваться после применения мутагенных агентов (химиои/или лучевая терапия) по поводу другого, обычно опухолевого, заболевания. Второй вариант носит название вторичный МДС [4,18].

Существует ряд факторов, которые являются предраспологающими факторами риска развития миелодиспластического синдрома. К ним относятся:

1. Принадлежность к мужскому полу

2. Белый цвет кожи.

3. Возраст старше 60 лет.

4. Предшествующая химиотерапия или лучевая терапия.

5. Воздействие определенных химических веществ, включая табачный дым, пестициды растворители, например бензин.

6. Воздействие тяжелых металлов, таких как ртуть или свинец [4,8,11].

В анамнезе больных МДС встречаются указания на:

— курение — 29,0%,

— семейную отягощенность опухолевыми заболеваниями — 18,6%

— предшествующий контакт с канцерогенными веществами — 16,2%

— предшествующее лечение цитостатическими препаратами по поводу другого онкологического заболевания — 6,4% [1,4,8].

Наиболее отчетливо доказано увеличение риска заболевания среди людей, имеющих длительный профессиональный контакт с бензолом, летучими органическими растворителями (шоферы, работники обувной и кожевенной промышленности). Имеются сообщения о возникновении МДС в связи с приемом фенилбутазона (бутадиона), хлорамфеникола (левомицетина), цитостатических препаратов, в частности, при использовании мелфалана, азотиаприна и циклофосфана [1,8,11]. Одной из возможных причин заболевания может быть употребление недостаточно очищенной воды, так как водоемы загрязняются различными химическими соединениями, многие из которых опасны для здоровья человека. К числу последних относятся канцерогенные вещества (ароматические амины, N-нитрозосоединения, пестициды, гидразин и его производные), радиоактивные вещества, канцерогены природного происхождения (мышьякосодержащие соединения и соли цинка), одной из особенностей которых является способность оказывать специфическое патогенное действие, попадая в организм в чрезвычайно малых количествах [1,4,8,18].

Миелодиспластические синдромы характеризуются периферическими цитопениями несмотря на нормоили гиперцеллюлярный КМ, что расценивается как результат неэффективного гемопоэза [1,3,8]. Различные цитогенетические аномалии, обуславливающие быстрое увеличение неопластического клона вместе с повышением количества бластов и увеличением апоптоза, играют важную роль в патогенезе МДС [4,7].

Важную роль в процессе развития цитопений играет повышенный апоптоз. Увеличенная продукция гемопоэтических клеток при МДС сочетается с их усиленной гибелью вследствие апоптоза. У большинства больных МДС апоптозу подвержено более 75% гемопоэтических клеток трех ростков кроветворения и клеток стромы. Наличие клеток одновременно в процессе апоптоза и в S-периоде клеточного цикла является специфическим признаком МДС[7,18,20]. Усиление апоптоза отмечается в условиях изоляции гемопоэтических клеток от колониестимулирующих факторов. Основную роль в регуляции апоптоза играют стволовой клеточный фактор, интерлейкин-3(IL-3), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и эритропоэтин. Также причиной усиленной клеточной гибели может быть увеличение концентрации фактора некроза опухоли (TNF-Ј), трансформирующего ростового фактора (TGFЈ) и интерлейкина-1b (IL-1b), количества гемопоэтических клеток, экспрессирующих антиген CD-95(FAS/Apo-1), опосредующий апоптоз. Блокада TNF-Ј или FAS-ligand увеличивает пролиферацию гемопоэтических колоний и количество клеток периферической крови при МДС [2,3,7,20].

Начальной генетической ступенью многоуровневого патогенеза МДС является дефект стволовой клетки, который на самом первом этапе сопровождается неклоновой кариотипической нестабильностью. У некоторых пациентов выявляется анеуплоидия или структурные расстройства, такие как делеция, транслокация, изохромосомы и др. [17,20]. Патологический кариотип более общий и типичный при вторичном МДС, тогда как при первичном — встречаются более разнообразные цитогенетические аномалии. Одними из наиболее частых хромосомных аномалий, наблюдаемых при МДС, являются делеции хромосом. Подобное наблюдение ведет к гипотезе, что МДС может быть вызван инактивацией генов супрессоров опухоли [1,7,20]. 5q — хромосомная аномалия — наиболее частая при МДС, встречается более чем в 20% случаев. 5q-синдром характеризуется клиническими и морфологическими особенностями, включающими рефрактерную макроцитарную анемию с дизэритропоэзом, высокую распространенность у лиц женского пола, нормальное или повышенное количество тромбоцитов ПК, а также микроформами мегакариоцитов и относительно хорошим прогнозом [4,13]. Контрольные точки делеции лежат в пределах большой области 5q, но наиболее критическая область делеции — между 5q31 и 5q33. В данной области находятся гены, кодирующие гемопоэтические факторы роста и рецепторы, включая IL-3, IL-4, IL-5, макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), рецептор для M-CSF, GM-CSF [2,13]. Делеция гена PURA является наиболее частым нарушением при МДС, характеризующихся del (5)(q31). В аномалиях 5-й хромосомы при МДС также участвуют: коэнзим А, синтетаза 2, АСS2 в соединении с геном TEL при t (5;12) (q31;p13) или с NUP98 в t (5;11) (q35;p15.5) и др. [1,20].

Также частой аномалией является моносомия 7 и 7q, которые связаны с неблагоприятным прогнозом относительно продолжительности жизни и трансформации в ОЛ. Моносомия 7 характерна для JMML, который сопровождается нейрофиброматозом типа 1(NF 1) [17,18]. Мутации RAS-гена или инактивация гена NF1 являются критическими событиями в прогрессии МДС при моносомии 7.

Типичные хромосомные аномалии встречаются в следующих регионах: Зр-, 3q-, 5q-, 7q-, 12p-, -17, -18, 20q, 1−12, +8. Эти большие хромосомные изменения в обязательном порядке сопровождаются субмикроскопическими мутациями ДНК таких генов, как р53, FLT3 или RAS, метилированием специфических генов-промоутеров и, в некоторых случаях, реципрокными транслокациями и инверсиями, уже ассоциированными с ОМЛ. Каждая последующая стадия развития МДС сопровождается дальнейшими генетическими повреждениями [3,7,8,20].

Изучение генетических мутаций при МДС показало, что с лейкозным преобразованием в этой группе связана активация некоторых онкогенов и инактивация опухолевых супрессоров [1,4]. RAS гены, как известно, являются важным компонентом передачи сигналов для клеточной пролиферации через рецептор тирозинкиназы (RTKs) и активируются точечными мутациями в кодонах 12, 13 или 61. Среди RAS генов наиболее часты мутации N-RAS, которые встречаются в 10−15% случаев при МДС и обуславливают короткий период выживания и высокую вероятность трансформации в ОЛ [18,20]. FLT3 ген кодирует тот тип рецептора тирозинкиназы, который вовлечен в пролиферацию и дифференцировку гемопоэтических предшественников. Дупликация FLT3 гена обнаружена как соматическая мутация в 5% случаев МДС. Инактивация p53 гена обнаружена в 5−10% случаях МДС и играет важную роль в лейкозной прогрессии при данной патологии. При RAEB обнаружена мутация митохондриальной ДНК (G3242A) в CD34 + клетках. Эта генетическая аномалия связана с дефектом созревания, так как мутации митохондриальной тРНК нарушают синтез белка, вызывая таким образом дисфункцию митохондриальной дыхательной цепи, что вносит значительный вклад в неэффективный гемопоэз при МДС [7,17]. Однако, исследования мутаций митохондриальной ДНК при RARS не подтверждают главенствующую роль неустойчивости митохондриального генома в патогенезе МДС [7,8].

Одним из факторов в патогенезе заболевания является дефект микроокружения, подтвержением чего служат обнаруженные при МДС качественные и количественные изменения клеток стромы КМ с нарушением продукции цитокинов [1,4,8].

Кроме того большое значение в процессе онкогенеза при МДС имеют иммунологические нарушения, в частности снижение функции естественных киллеров, что приводит к утрате контроля над неопластическими изменениями гемопоэтических клеток. Для МДС характерно уменьшение уровня В-лимфоцитов, снижение способности моноцитов к фагоцитозу, а также адгезии и хемотаксиса фагоцитов, нарушение функции нейтрофилов [1,8,17].

На основании клинико-экспериментальных данных составлена приблизительная модель специфического многоступенчатого процесса развития идиопатического МДС, в которой биологическая природа заболевания объясняется совокупностью генетического повреждения стволовой клетки с такими эпигенетическими механизмами, как аберрантная продукция цитокинов, нарушенная адгезия стволовых клеток и поврежденное гемо-поэтическое микроокружение. В этой модели выделяют четыре патофизио-логические фазы [1,3,8].

1. В преМДС фазе процесс инициируется действием внешних факторов у генетически чувствительных лиц.

2. Ранняя фаза характеризуется иммунным ответом на повреждение кроветворных клеток. Существование аутоиммунного Т-клеточного ответа подтверждается выявлением Т-клеточного рецептора (TCR) Vb характера, который свидетельствует о персистенции Т-клеточной клональной популяции, и ассоциации МДС с Т-клеточным лейкозом из больших гранулярных лимфоцитов, развивающегося в результате олигоклональной или клональной экспансии Т-клеток. Как при апластической анемии, клональная Т-клеточная популяция вызывает аутоиммунную миелосупрессию, приводящую к цитопении при МДС. Персистирующая аутоиммунная атака обусловливает хроническую избыточную продукцию таких проапоптических цитокинов, как TNF-Ј, TGFЈ, IL-1b. Основным продуцентом TNF-Ј являются мононуклеарные клетки патологического клона, а IL-1(3) и TGFЈ- стромальные клетки.

Увеличение уровня TNF-Ј в костномозговом микроокружении индуцирует на CD-34 костномозговых клетках избыточную экспрессию FAS-антигена в результате активации каспаз (и, прежде всего, каспазы-3) и снижение Fap-1, что обусловливает избыточный апоптоз клеток КМ. Кроме того, высокая экспрессия TNF-Ј способствует повышенной продукции свободных радикалов и окислительному повреждению CD34 костномозговых клеток с формированием характерной диспластической морфологии клеток.

Преобладание внутримедуллярного апоптоза над пролиферацией клеток обусловливает неспособность КМ экспортировать достаточное количество клеток в ПК. Избыточному апоптозу также способствуют нарушенные адгезивные взаимоотношения между клоногенными гемопоэтическими стволовыми клетками и прилегающей костномозговой стромой или эндотелием. Дополнительным фактором, поддерживающим неэффективный гемопоэз при МДС, является и избыточны ангиогенез — результат продукции клональными клетками васкулярного эндотелиального ростового фактора (vessel endothelial grows factor, VEGF). Повышенная плотность сосудов может благоприятствовать прогрессии МДС путем поддержки нерегулируемого клеточного роста.

Нарушенная экспрессия онкопротеинов и, особенно, высокое соотношение проапоптических/антиапоптических онкопротеинов, например, Мус против bcl-2 или bax/bad против bcl-2/bcl-x и сверхэкспрессия р53 или низкая экспрессия bcl-2 также коррелируют с повышенным апоптозом. Избыточный апоптоз является удобным объяснением того, как клональная экспансия костномозговых клеток-предшественников может приводить к неэффективному гемопоэзу и костномозговой недостаточности.

3. При прогрессировании МДС в позднюю стадию апоптические сигналы (FAS, с-Мус) снижаются, а антиапоптические (bcl-2) — усиливаются.

4. Дальнейшая прогрессия МДС в ОМЛ связана с инактивацией генов-супрессоров опухоли р15 (гиперметилирование) и р53 (точечные мутации). В целом поздняя стадия МДС характеризуется снижением контроля за клеточным циклом и развитием МДС/ОМЛ [1,3,8].

Таким образом, несмотря на возможность предположения, что хромосомные аномалии в конечном счете приведут к открытию генетических поломок, основных в генезе МДС, прогресс в этой области происходит медленно [3,20]. Патогенез МДС является мультифакторным процессом, который вовлекает множество повреждений генома клеток костного мозга. Поиск генов, относящихся к патогенезу данного заболевания сложен, потому что хромосомные аномалии при МДС в основном характеризуются потерей генетического материала. В настоящее время не ясно, вовлекает ли потеря генетического материала полную утрату функции гена супрессора опухоли или работа гена супрессора опухоли осуществляется через некоторый другой дефект, который еще не был обнаружен. Поэтому, несмотря на то, что морфологический метод остается краеугольным камнем диагностики МДС, анализ цитогенетических и молекулярных аномалий при данном заболевании может представлять интерес для классификации болезни, определения прогноза и терапевтического направления, поскольку вносит вклад в понимание патогенетических механизмов [3,7,20].

1.4 Клиническая картина миелодиспластического синдрома Клиническая картина при различных формах МДС схожа и во многом определяется показателями периферической крови. Изменения периферической крови прямо зависят от степени нарушения созревания гемопоэтических клеток [1,4,8].

Анемия постоянный и обязательный признак. Уровень снижения гемоглобина может варьировать от умеренного до значительного. При медленном снижении гемоглобина организм успевает адаптироваться к гипоксии и количество жалоб у больных может быть минимальным [1,4]. Если анемия развивается быстро, больные предъявляют жалобы на общую слабость, утомляемость, сердцебиение, одышку. Может утяжеляться течение ишемии-ческой болезни сердца, появляются признаки сердечной недостаточности [4,8,].

Снижение количества зрелых гранулоцитов (нейтропения), а также их функциональная несостоятельность влекут за собой инфекционные осложнения. У 10% больных развиваются стоматиты, гингивиты, пневмонии, инфекция мочевыводящих путей, абсцессы различной локализации, сепсис. У 20% больных данной группы инфекционные осложнения становятся причиной смерти. Наиболее многочислены осложнения бактериальной природы, возбудителями которых являются Escherichia coli, Pseudomonas pyocyanea, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus и Streptococcus fecalis. Также достаточно часто тяжелые инфекционные осложнения вызываются Pneumocysti carinii, Cryptococcus neoformus, Candida albicans, Aspergillus fumigatus и цитомегаловирусом, что связано с функциональной неполноценностью Т-лимфоцитов при МДС [5,8,11].

Клинически значимая тромбоцитопения (приводящая к развитию геморрагического диатеза с петехиально-пятнистым типом кровоточивости) встречается у 15% больных МДС. У половины из них кровотечение или кровоизлияния становятся причиной смерти. В некоторых случаях МДС, как правило у больных рефрактерной анемией, может отмечаться тромбоцитоз [4,8]. Проявления гиперпластического синдрома в виде спленомегалии, гепатомегалии, лимфоаденопатии и специфического поражения кожи (лейкемиды) имеют место в основном у больных ХММЛ. Спленомегалия встречается у 17% таких больных, гепатомегалия у 13%, а лейкемиды у 10% [1,4,8].

При всех вариантах миелодиспластического синдрома возможно развитие аутоиммунного процесса: васкулита, полисерозита и др.

Такие признаки, как потеря веса, немотивированная лихорадка, болевой синдром могут быть манифестацией МДС.

1.5 Диагностика миелодиспластического синдрома Современная диагностика МДС включает следующие методы [1,4,5,8]:

1.Морфологические исследования крови и костного мозга.

2.Иммунофенотипирование.

3.Цитогенетическиое исследование.

4.Определение ферритина.

1.5.1 Морфологические исследования крови и костного мозга Изменение морфологических и количественных показателей в результатaх анализов периферической крови и костного мозга являются важным звеном в диагностике МДС; особенно выявление морфологических признаков дисгранулопоэза, дизэритопоэза, дисмегакариоцитопоэза, основными признаками которых являются следующие [10,13,16]:

Дизэритропоэз — диспластические изменения в клетках эритроидного ряда, включают в себя три основные группы изменений [19]:

1.клеточные аномалии с потерей индивидуальных признаков клетки,

2.структурные деформации

3.стромальные нарушения.

При всех вариантах МДС в большинстве случаев анемия нормохромная, нормоцитарная и норморегенераторная. В ПК определяются смешанный анизоцитоз, умеренный макроцитоз, пойкилоцитоз, овалоциты, фрагментированные эритроциты в виде слезных капель, «мишеневидные» (таргетные) клетки, базофильнопунктированные эритроциты, тельца Жоли, нормобласты и мегалобластоидные элементы (рис. 1.1)[10,21].

В КМ: эритроидная гиперплазия, наличие мегалобластоидных элементов, многоядерность эритрокариоцитов, ядерная фрагментация, межъядерные мостики, неправильные митотические фигуры, Шик-положительные эритрои нормобласты, кольцевидные сидеробласты [16,24].

В норме агрегаты ферритина встречаются менее чем в 50% нормобластов, и их количество обычно не превышает 4 гранул в клетке. Наличие 5 или более гранул рассматривается как патологический признак, а если они занимают более трети ядра, то описываются под термином «кольцевой» сидеробласт. Отложение ферритина в митохондриях является результатом сниженной активности аминолевулиновой кислоты и увеличенного захвата железа митохондриями и приводит к нарушению клеточного цикла, например вхождению клеток в S-фазу цикла. Кольцевые сидеробласты идентифицируются по окраске гранул железа Prussan-blue, встречаются при различных гематологических состояниях и являются результатом неэффективного гемопоэза [13,25].

Рисунок 1.1- Дисплазия эритроидного ростка в костном мозге: мегалобластоидность, асинхронность ядер, тельца Жоли.

К признакам дизгранулоцитопоэза в ПК относят выраженное нарушение созревания и дифференцировки нейтрофильных и эозинофильных гранулоцитов: снижение доли сегментоядерных нейтрофилов, снижение или полное отсутствием зернистости, дефект накопления миелопероксидазы и нафтол-ASD-хлорацетатэстеразы, выявление гипосегментации с пикнозом ядер по типу аномалии Пельгера, асинхронное созревание ядра и цитоплазмы [14,15,21].

В КМ обнаруживаются:

1) гранулоцитарная гиперплазия;

2) повышение бластных клеток двух типов: тип 1 — с выраженной базофилией цитоплазмы и отсутствием в ней грануляции, наличием в ядре отчетливо контурирующихся нуклеол, тип II — более крупного размера, содержащие в цитоплазме, по крайней мере, одну, но не более 5−6 гранул [15];

3) гипоили гипергрануляция первичных гранул и специфическая зернистость в цитоплазме всех стадий созревания;

4) наличие парамиелоидных клеток при отсутствии или снижении специфической зернистости в миелоцитах или метамиелоцитах, подобные клетки напоминают моноциты;

5) палочки Ауэра;

6) пельгероидность клеток;

7) базофилия цитоплазмы в зрелых элементах (тельца Деле);

8) наличие эозинофилов с круглым ядром и вариабельной зернистостью (рис. 1.2, 1.3) [14,15.19,24].

Рисунок 1.2−1.3: — Дисплазия гранулоцитарного ростка: 1- зрелый нейтрофил с округлой формой ядра, 2 — бисегментированный нейтрофил.

Дисмегакариоцитопоэз при МДС характеризуется угнетением этой клеточной линии и нетипичной локализацией в ячейках КМ, наличием плеоморфных микромегакариоцитов и повышенным количеством незрелых мегакариоцитов [10,14]. В ПК: наличие микромегакариоцитов с моноплоид-ным округлым плотным ядром и гигантских тромбоцитов со скудным грануломером.

В КМ обнаруживают микромегакариоциты с моноплоидным ядром и гигантские мегакариоциты с множеством раздельнолежащих маленьких круглых ядер (рис. 1.4)[14,16].

Рисунок 1.4 — Дисплазия мегакариоцитарного ростка в костном мозге: микромегакариоцит.

Диспластические признаки клеток моноцитарной линии в ПК включают: увеличение моноцитов с множеством долей (, гиперсегментация,) и наличие азурофильной зернистости в цитоплазме.

В КМ:

1) наличие монобластов и моноцитов, аналогичных в ПК;

2) гемофагоцитоз;

3) макрофаги, содержащие гранулы железа.

Характерные диспластические изменения обнаруживают и в гистологических препаратах КМ. Клеточность КМ вариабельна, так при RAEBt и CMML — КМ гиперклеточный за счет гранулоцитарного ростка, а при RA — гипоклеточный [1,8,19]. Выявляют нарушение костномозговой топографии всех ростков гемопоэза. Наиболее отчетливо оно выражено в мегакариоцитарном ростке в виде скопления микромегакариоцитов, нарушения синусоидальной ориентации и паратрабекулярной локализации диспластических и пикнотичных мегакариоцитов. Для миелоидного ростка характерным признаком является патологическая локализация незрелых клеток — ALIP (abnormal localization of immature myeloid precursors), впервые описанная G. Tricot с соавторами в 1984 г. Этот феномен представляет скопление миелобластов и промиелоцитов в центральной части костномозговых лакун, в то время как обычно они локализуются вдоль эндостальной мембраны. Скопление 5 или более клеток описывается как «агрегат», а 3−5 клеток — как «кластер». По мнению G. Tricot, о патологической локализации клеток можно судить только в том случае, если по крайней мере три агрегата или кластера присутствуют в каждой секции препарата [1,4,10].

Со стороны эритропоэза выявляются участки с блоком созревания, располагающиеся как в интра-, так и в паратрабекулярных областях. Картина повреждения микроокружения складывается из участков отека и экстравазации эритроцитов в результате повреждения синусоидов, васкулитов, фиброза, увеличения плазматических клеток, тучных клеток, лимфоцитов, макрофагов и нередко — гемофагоцитоза [8,10]. В некоторых случаях отмечают превалирование воспалительных изменений с содержанием высокого процента плазматических и тучных клеток, лимфоцитов, которое коррелирует с результатами изучения костномозговых аспиратов [13,21].

В соответствии с ФАБ-классификацией выделяют пять вариантов МДС, каждый из которых характеризуется определенными признаками в изменении морфологических и количественных показателей результатов анализов периферической крови и костного мозга.

1.Рефрактерная анемия (RА).

Среди всех вариантов МДС составляет 5−10%. Ведущим признаком является разной степени выраженности анемия с ретикулоцитопенией. Анемия гиперхромная макроцитарная или нормоцитарная. Степень анизоцитоза варьирует. Гранулоцитопения и (или) тромбоцитопения или не выявляются, или незначительные. В ПК могут выявляться агранулярные или гипогранулярные нейтрофилы, хотя и необязательно. Бласты отсутствуют или их менее 1%. В КМ выявляют гиперплазию эритроидного ростка и эритробласты с признаками мегалобластоидного кроветворения. КМ гиперклеточный. Количество бластов — менее 5%; кольцевые сидеробласты обнаруживаются редко, их количество составляет менее 15% от всех клеток эритроидного ряда. Морфологических признаков дисмегакариоцитопоэза может не быть, или выявляется повышенное содержание мегакариоцитов с признаками дисплазии. Признаки дисгранулоцитопоэза могут или обнару-живаться, или полностью отсутствовать. PAS-реакция в эритробластах в большинстве случаев варьирует от слабо выраженной до полного отсутствия, однако может быть и гранулярного характера [10,14,16,19].

2.Рефрактерная анемия с кольцевыми сидеробластами (RARS).

Среди всех вариантов МДС составляет 10−12%. В ПК выделяют две популяции эритроцитов: гиперхромные микроциты и нормохромные макроциты. Эритроциты с базофильной пунктацией. Отмечается выраженный пойкилоцитоз, нормобластоз. Бласты отсутствуют. КМ нормоили гиперклеточный, обычно со значительной эритроидной гиперплазией. Признаки дисплазии регистрируются только в эритроцитарном ростке. Содержание кольцевых сидеробластов составляет более 15%, миелобластов — менее 5% (рис. 1.5.). Могут встречатся макрофаги с гемосидерином. Положительная PAS-реакция диффузного или гранулярного характера встречается в большинстве эритробластов, хотя может быть и отрицательной. Трансформация РАКС в ОЛ ввиду стабильности патологического клона наблюдается крайне редко. В случае прогрессирования заболевания количество сидеробластов может достигать 80% клеток эритроидного ряда [14,16,24].

Описаны две формы РАКС: 1-я — с морфологическими признаками дизэритропоэза, 2-я — с дополнительными признаками дизгранулоцитопоэза и (или) дизмегакариоцитопоэза. Риск лейкозной трансформации в этих группах составляет 1,9% и 48%, а 5-летняя выживаемость больных — 69% и 19% соответственно. Это позволяет предположить, что первая форма РАКС не вляется клональным состоянием и, следовательно, не может рассматриваться в качестве истинного первичного МДС.

Рисунок 1.5 — Костный мозг больного рефрактерной сидеробластной анемией: кольцевые сидеробласты.

миелодиспластический синдром мутация кровь

3.Рефрактерная анемия с избытком бластов (RAEB).

Встречается в 40% случаев МДС. В ПК отмечаются: анизопойкилоцитоз с макроцитозом, атипичные тромбоциты, гипоили агрануляция гранулоцитов иногда с измененным хроматином или сегментацией ядра. Тромбоцитопения умеренная. В ПК выявляются бласты, но обычно их количество составляет менее 5%. В КМ обнаруживается дисплазия 2 или более клеточных линий. КМ гиперклеточный, реже нормоили гипоклеточный. Наиболее часто встречаются признаки дисгранулоцитопоэза: уменьшение размера клеток, псевдо-пельгеризация ядер, гиперсегментация, гипоили агрануляция в цитоплазме. Диспластические изменения обнаруживаются в эритроцитарном и мегакариоцитарных ростках. Количество бластов с положительной реакцией на миелопероксидазу находится в диапазоне 5−20% всех ядерных клеток. По сравнению с ОМЛ, бласты преимущественно меньшего размера, что, вероятно, отражает их низкий пролиферативный потенциал. PAS-реакция в эритробластах варьирует от слабо выраженной до хорошо гранулированной. Активность реакций на кислую фосфатазу и специфическую эстеразу слабо выраженная либо отсутствует. Сидеробласты встречаются редко, и количество их варьирует от случая к случаю [10,15,16].

4.Рефрактерная анемия с избытком бластов в трансформации (RAEBt).

Анемия гиперхромная макроцитарная. К этой форме относят варианты с количеством бластов в КМ от 21 до 30% и (или) наличием бластов с палочками Ауэра и (или) содержанием более 5% бластов в ПК. В тех случаях, когда количество бластов в КМ достигает 30%, критерием разграничения этого варианта МДС от ОМЛ является обнаружение бластов III типа, содержащих 20 азурофильных гранул. Случаи с содержанием бластов в КМ от 5 до 20% при условии выявления палочек Ауэра относят к РАИБ-Т ввиду высокого риска прогрессирования заболевания и низкой выживаемости больных этой группы [13,15,24].

5.Хронический миеломоноцитарный лейкоз (CMML).

В ПК: количество бластов составляет не более 5%, абсолютное количество моноцитов не менее 1×109 /л. Большинство моноцитов не отличаются от нормальных, но могут быть моноциты с грубой зернистостью, редко выражен полиморфизм ядер. Может иметь место умеренная базофилия, иногда эозинофилия. Отмечается нормоцитарная, реже макроцитарная анемия. Количество тромбоцитов — варьирует, может быть тромбоцитопения. Встречаются атипичные крупные тромбоциты. КМ гиперклеточный, реже нормоили гипоклеточный с пролиферацией гранулоцитарного ростка и признаками трехростковой дисплазии, степень выраженности которой варьирует от случая к случаю. Моноцитарные клетки разной степени зрелости. Число бластов может варьировать от 5 до 20% в результате повышенного содержания молодых форм моноцитарного ростка, а количество миелобластов в этом случае обычно не превышает 10% костномозговых клеток. Эритробласты с чертами мегалобластоидного кроветворения. Нередко выявляется повышенное содержание эозинофилов и плазматических клеток. При проведении цитохимических реакций в моноцитах обнаруживается интенсивная окраска на неспецифическую эстеразу, подавляемую NaF; активность реакций на кислую фосфатазу и специфическую эстеразу варьирует от слабовыраженной до полного отсутствия; активность реакции на миелопероксидазу различная, но в большинстве случаев слабая или полностью отсутствует. В эритробластах при проведении PAS-peакции выявляется слабоположительная окраска цитоплазмы. ХММЛ включен ФАБ-классификацией в группу МДС, хотя имеет признаки миелопролиферативного заболевания. В некоторых исследованиях предлагают деление ХММЛ на два варианта: пролиферативный и непролиферативный. Разграничительной чертой между ними служит число лейкоцитов — 12×109 /л [13,19].

Морфологические признаки дисплазии ростков кроветворения являются определяющим фактором в совокупности признаков МДС. Однако само по себе выявление дисплазии того или иного ростка гемопоэза еще не является основанием для диагностики МДС, так как встречается и при других патологических состояниях. Так, различной степени проявления дизэритро-поэза обнаруживаются в регенерирующем КМ, в том числе и после проведения цитостатической терапии, при недостаточности питания, миелопролифе-ративных заболеваниях и врожденной дизэритропоэтической анемии. Гипогранулярные нейтрофилы и клетки с пельгеровской аномалией встречаются при Ml, М2 и М4 вариантах de novo ОМЛ, нередко после цитостатической терапии. Дисплазия мегакариоцитов выявляется в ряде случаев ХМЛ. Миелодисплазия, как морфологическа находка, еще не является синонимом МДС, а обнаружение одноростковой дисплазии еще не служит критерием диагностики первичного МДС [1,4,8,24].

1.5.2 Иммунофенотипирование Изучение иммунофенотипа клеток костного мозга с помощью метода проточной цитофлюориметрии имеет важное значение в диагностике МДС для оценки нарушений клеточной дифференцировки, прогноза заболевания, для дифференциального диагноза с другими заболеваниями.

В основе проточной цитофлюориметрии лежит проведение фотометрических и флюоресцентных измерений отдельных клеток, пересекающих одна за другой вместе с потоком жидкости лазерный луч монохроматического света.

Монохроматические каналы используются для оценки размеров клеток и внутриклеточных структур; позволяют разделить анализируемую клеточную популяцию на отдельные субпопуляции [12,22].

Флюоресцентный канал применяется для изучения клеточных маркеров, для чего используются моноклональные антитела (МАТ), меченные различными флюорохромными красителями к мембранным и внутриклеточным компонентам клеток (белкам, ДНК, РНК). После окрашивания клеток МАТ происходит специфическое связывание последних с клеточными структурами и регистрация флюоресценции, индуцированной излучением лазера. Техника регистрации флюоресценции состоит в следующем. При облучении клеток длиной волны, возбуждающей флюорохром, происходит поглощение света. Затем флюорохром испускает свет, но уже меньшей интенсивности (большей длины волны), чем поглощенный. Вторичное излучение, имеющее строго определенную для каждого флюорохрома длину волны, проходя через оптическую систему прибора (линзы, фильтры, двухцветные зеркала) регистрируются высокочувствительными детекторами (фотоэлектронными умножителями), преобразующими его в электрические сигналы, поддающиеся компьютерной обработке. Регистрацию проводят под прямым углом, однако для монохроматического лазерного облучения это не является обязательным условием, т.к. испускаемый флюоресцентный свет всегда имеет большую длину волны, чем возбуждающий свет лазерного облучения. Проточные цитофлюориметры могут быть оборудованы одним, двумя или более лазерами. В случае использования двух или более лазеров в исследования могут быть включены флюорохромы, возбуждаемые на разных длинах волн (488 нм, 635 нм, 407 нм и др.). Наиболее часто в качестве красящей метки применяется флюоресцеинизотиоционат (FITC), который улавливается FL-1-детектором (зеленый спектр), фикоэритрин (PE) — FL-2-детектором (красный спектр), менее часто — цианин-5/фикоэритрин и пиридин хлорофилл (PerCp, Cy5/PE) — FL-3-детектором и аллофикоцианин (APC) — FL-4-детектором.

Иммуноцитофлюориметрический анализ клеток проводится по пяти основным параметрам:

— две характеристики светорассеяния клеток: FSC — показатель прямого светорассеяния и ортогональный SSC (90) — показатель бокового светорас-сеяния;

— три канала детекции специфического флюоресцентного сигналакрасителя на разной длине волны.

Иммунофенотипирование является адекватным методом для оценки качественных и количественных изменений гемопоэтических клеток при МДС, для анализа значения нарушений клеточной дифференцировки и оценки прогноза заболевания.

Наиболее частыми изменениями экспрессии поверхностных антигенов по данным иммунофенотипа оказываются экспрессия HLA-DR на клетках миелоидного ряда, наличие CD-34 на моноцитах, повышение интенсивности экспрессии CD-33 на миелоидных клетках, наличие лимфоидных антигенов на клетках моноцитарного ряда, наличие CD-34 на гранулоцитах, наличие лимфоидных антигенов на клетках миелоидного ряда [12,13].

С высокой достоверностью было показано увеличение при МДС процента гранулоцитарных клеток с низкой экспрессией CD16 и CD11b. По данным иммунофенотипирования встречаются: CD10-отрицательные нейтрофилы, линейные антигены немиелоидных линий на миелоидных клетках, в частности антиген CD22 или антиген CD7.

Антиген CD33, обычно исчезающий на зрелых нейтрофилах, у больных МДС обнаруживается на этих клетках, особенно при РАИБ и РАИБТ. Этот признак часто коррелирует с наличием клональных цитогенетических аномалий и высоким риском прогрессирования заболевания.

По данным некоторых авторов, увеличение экспрессии антигена CD13 указывает на возможность прогрессирования заболевания и трансформации его в ОМЛ. В ряде случаев на гранулоцитах может выявляться аберрантная экспрессия моноцитарного антигена CD14 [12,22].

Большой интерес представляет экспрессия антигена CD34. Показано, что бластные клетки при МДС — часто CD34±клетки. Однако отсутствует корреляция между количеством бластных клеток и CD34± клеток, что предполагает аномальную персистенцию экспрессии этого антигена на созревающих клетках. Увеличение числа клеток с таким фенотипом коррелирует с плохим прогнозом заболевания и высоким риском трансфор-мации заболевания в острый лейкоз [12,21].

1.5.3 Цитогенетическое исследование Цитогенетическое исследование позволяет не только четко определить клональное заболевание в случае аберрантного кариотипа, но также помогает в классификации заболевания и оценке прогностического значения аномалии.

Цитогенетические нарушения при миелодиспластическом синдроме выявляются в 30 — 50% случаев при первичном МДС и в 80% - при вторичном МДС. Некоторые хромосомные аномалии ассоциируются с определенными клиническими проявлениями. Например, потеря части длинного плеча 5 хромосомы связана с развитием макроцитарной анемии у пожилых женщин и с низким риском трансформации в острый миелолейкоз [11,20,21].

При стандартном цитогенетическом анализе исследуются хромосомы, зафиксированные на стадии метафазы митоза. Методика приготовления препаратов включает в себя:

1.

Введение

митостатиков (колхицин, колцемид), останавливающих митозы на стадии метафазы.

2.Гипотоническую обработку с целью разобщения хромосом набора.

3.Фиксацию смесью метанола и уксусной кислоты.

4.Нанесение приготовленной суспензии на предметные стекла путем раскапывания.

Перед добавлением митостатика желательно культивировать клетки 1−2 суток. При необходимости срочного анализа препарат можно приготовить прямым методом, т. е. исключив культивирование.

Готовые препараты высушивают 2−7 дней. Затем проводят дифференциальное окрашивание, после которого каждая хромосома приобретает индивидуальный рисунок поперечной исчерченности, позволяющий идентифицировать не только хромосомы, но и отдельные их участки. Систематизация хромосом в каждой отдельной метафазной пластинке дает кариотип клетки [11,13].