Технологическое оборудование промышленного назначения

Для культивирования различных биологических объектов, в том числе микроорганизмов и культур клеток, в зависимости от поставленных задач используют различное технологическое оборудование. Это могут быть качалки и роллеры — при лабораторных исследованиях, биореакторы и ферментеры — при промышленных производствах.

В лабораторных условиях часто используют качалки и роллерные установки, вращение которых предотвращает седиментацию (осаждение) клеток и обеспечивает достаточную концентрацию растворенного кислорода. В большинстве случаев скорость вращения составляет 50—120 об/мин для круговых качалок и 1—20 об/мин — для роллерных установок. Несмотря на различные способы перемешивания клеточных культур, отличия в продуктивности и росте клеток незначительны.

Промышленное выращивание клеток растений осуществляют в биореакторах или ферментерах. Их подразделяют на две группы: по конструкции и по принципу перемешивания культуральной жидкости (рис. 6.2).

В биореакторах, относящихся к первой группе, перемешивание клеток происходит путем аэрирования воздухом. Это барботажный тип биореактора, при котором процесс перемешивания суспензии осуществляется поднимающимися пузырьками воздуха. В случае барботажных биореакторов обычно получают хорошие ростовые характеристики для большого числа клеточных культур. Однако сложность поддержания суспензии в гомогенном состоянии при высоких концентрациях биомассы клеток сужает сферу их применения.

Несколько больших значений максимальной концентрации клеточной биомассы можно достичь при применении эрлифтных биореакторов, в которых создаются направленные циркуляционные потоки. В эрлифтных биореакторах перемешивание суспензии осуществляется за счет применения специальной конструкции, создающей градиент плотности (как правило, это конструкция с внутренним цилиндром).

Вторая группа биореакторов представляет собой аппараты с применением механических перемешивающих устройств. Биореакторы этого типа позволяют изучать растительные клеточные популяции в очень широком диапазоне концентраций биомассы клеток. Вместе с тем стрессовое воздействие перемешивающего устройства на клеточную популяцию часто ограничивает их применение.

Выращивание растительных клеточных культур и микроорганизмов в биореакторах можно проводить в режимах периодического и проточного (непрерывного) культивирования.

Рис. 6.2. Упрощенные схемы биореакторов различных типов (по Б. Глику и Дж. Пастернаку, 2002):

А — реактор с механическим перемешиванием; Б — барботажная колонна; В — эрлифтный реактор с внутренней циркуляцией; Г — эрлифтный реактор с внешней циркуляцией. Стрелки указывают направление потока культуральной среды Периодическое культивирование — это аналог выращивания клеточных культур в колбах на качалке. Периодическую культуру можно рассматривать как замкнутую систему, которая в своем развитии проходит четыре фазы — начальную, экспоненциальную, стационарную и отмирания. Условия существования культуры во всех этих фазах различны.

Проточное (непрерывное) культивирование характеризуется постоянным добавлением в биореактор свежей питательной среды и постоянным отбором либо суспензии (открытое проточное культивирование), либо отработанной среды (закрытое проточное культивирование). Непрерывная культура представляет собой открытую систему, стремящуюся к установлению динамического равновесия. Для организмов создаются неизменные условия среды. Проточное культивирование конструктивно более сложно и поддается автоматическому регулированию, так как связано с введением в схему биореактора дополнительных устройств (перистальтических насосов, разделительных устройств и др.).

В периодической культуре условия все время меняются: плотность культуры возрастает, а концентрация субстрата уменьшается. Однако очень часто требуется, чтобы клетки могли долгое время находиться в фазе экспоненциального роста при постоянной концентрации субстрата в неизменных прочих условиях. Этого можно достичь, если в сосуд, содержащий культуру клеток, непрерывно вводить новый питательный раствор и одновременно удалять из него соответствующее количество клеточной суспензии.

Применение проточных сред при культивировании тканей обеспечивает динамичность и большее постоянство условий их питания. Преимущество проточной питательной среды над непроточными твердой и жидкой средами наблюдалось при выращивании незрелых зародышей. Сложность методического и технического обеспечения проточности питательных сред в процессе выращивания, очевидно, является причиной того, что эти среды еще не нашли широкого применения. Однако моделирование условий питания при проточности питательной среды стоит ближе к нативным условиям. Это преимущество, по-видимому, будет учитываться при дальнейшем совершенствовании условий питания в культуре ткани.

В практике микробиологических исследований широко применяют две разновидности открытого проточного культивирования: хемостатный и турбидостатный методы.

Хемостатный метод культивирования клеток базируется на использовании биореактора, в который с постоянной скоростью подается питательная среда и одновременно с той же скоростью (например, слив по уровню) отбирается клеточная суспензия. При этом объем выращиваемой суспензии остается постоянным. Хемостат состоит из сосуда-культиватора, в который из особого резервуара поступает с постоянной скоростью питательный раствор. Благодаря аэрации и механическому перемешиванию, в культиваторе создаются оптимальные условия для снабжения клеток кислородом и более быстрого и равномерного распределения питательных веществ, поступающих с новыми порциями раствора. Рост культуры в хемостате контролируется концентрацией субстратов. На таком ограничении скорости роста концентрацией одного из необходимых субстратов основана стабильность системы.

Турбидостатный метод предусматривает измерение концентрации клеточной биомассы в биореакторе и ее автоматическое поддержание на постоянном уровне путем изменения скорости протока. Работа турбидостата основана на поддержании постоянной плотности суспензии, или постоянной мутности. Датчик мутности регулирует через управляющую систему поступление питательного раствора. В сосуде для культивирования все питательные вещества содержатся в избытке, и скорость роста культуры приближается к максимальной. Турбидостат используют при скоростях протока, близких к максимальной удельной скорости роста, тогда как хемостат иногда становится неустойчивым и может произойти полное вымывание культуры из биореактора. Работа с турбидостатами технически сложнее, чем с хемостатами.

Хемостатный метод культивирования позволяет выделять фактор (чаще всего концентрацию ростлимитирующего компонента питательной среды), определяющий физиолого-биохимическое состояние клеточной популяции. Так, было показано, что удельная скорость роста популяции клеток Acer pseudoplatanus L. может контролироваться концентрацией нитрата в питательной среде согласно соотношению, определенному Ж. Л. Моно для бактерий.

В то же время в условиях хемостатного выращивания не всегда удается поддерживать в течение продолжительного времени стационарное состояние культур растительных клеток. Например, культура клеток табака, выросшая в условиях хемостата на стандартной питательной среде для периодического выращивания, после одной-двух недель темнела и лизировалась. Только после увеличения концентрации всех компонентов в среде удалось получить (в условиях хемостата) стабильное состояние культуры клеток в течение 73 суток. Следовательно, для поддержания стабильно пролиферирующей культуры необходимо обеспечивать достаточно высокую концентрацию компонентов питательной среды.

Наряду с лимитирующей концентрацией субстрата, на развитие суспензионной культуры растительных клеток, растущей в условиях хемостата, значительное влияние оказывает и скорость протока суспензии. Ее увеличение выше максимальной удельной скорости роста клеток приводит к вымыванию культуры из биореакторов. Поэтому данный метод непригоден для изучения медленно растущих (медленно делящихся) клеточных популяций.

Новые возможности изучения физиолого-биохимического состояния клеточной популяции появляются при использовании «закрытого протока», когда не происходит удаления клеточной биомассы. При этом питательная среда добавляется в биореактор постоянно, и с той же скоростью из него удаляется бесклеточная культуральная жидкость. Данный режим выращивания растительных клеток правильнее было бы называть закрытым по биомассе протоком, однако обычно употребляют термин «закрытый проток», несмотря на его формальную нелогичность.

В заключение отметим преимущества и недостатки периодических и полупериодических процессов ферментации.

Преимущества:

• — малая стоимость аппарата и системы управления;
• — гибкость, т. е. возможность наработки в одном биореакторе разных продуктов;

• — время культивирования можно произвольно менять;
• — процесс менее подвержен инфицированию, мутациям клеток вследствие отсутствия протока и притока из-за относительно малого времени ферментации;
• — процесс удобен для получения малых количеств продукта;
• — условия культивирования можно поддерживать в оптимуме как в фазе роста биомассы, так и в фазе биосинтеза продукта, причем оптимальные условия для биомассы и продукта могут быть различны;
• — процесс удобен для реализации биосинтеза вторичных метаболитов.

Недостатки:

• — необходимость приготовления посевного материала;
• — велико непродуктивное время ферментации;
• — в связи с частой стерилизацией быстрее изнашиваются измерительные приборы, особенно датчики величины pH;
• — производительность по биомассе и продукту часто ниже, чем при непрерывном процессе.