Нитрификация. 
Основы микробиологии

Аммиак, образующийся в почве, навозе и воде при разложении органических веществ, довольно быстро окисляется до азотистой, а затем азотной кислоты. Такой процесс называют нитрификацией.

До середины XIX в., точнее, до работ Л. Пастера явление образования нитратов объясняли как химическую реакцию окисления аммиака атмосферным кислородом, причем предполагалось, что почва в этом процессе играет роль катализатора. Л. Пастер предположил, что образование нитратов — микробиологический процесс. Первые экспериментальные доказательства его гипотезы были получены Т. Шлезингом и А. Мюнцем в 1879 г. Исследователи пропускали сточные воды через длинную колонку с песком и СаС0₃. При фильтрации аммиак постепенно исчезал и появлялись нитраты. Нагревание колонки или внесение антисептиков прекращало окисление аммиака.

Однако выделить культуры возбудителей нитрификации не удалось ни упомянутым исследователям, ни микробиологам, продолжавшим изучение нитрификации. Лишь в 1890—1892 гг. С. Н. Виноградский, применив особую методику, изолировал чистые культуры нитрификаторов. Ученый предположил, что нитрифицирующие бактерии не растут на обычных питательных средах, содержащих органические вещества, это объяснило неудачи его предшественников.

Действительно, нитрификаторы оказались хемолитоавтотрофами, т. е. бактериями, использующими энергию окисления аммиака или азотистой кислоты для синтеза органических веществ из С0₂ (хемосинтез). Поэтому их клетки очень чувствительны к присутствию в среде органических соединений. Нитрифицирующие бактерии удалось выделить на минеральных питательных средах.

С. Н. Виноградский установил, что существуют две группы нитрификаторов: одна осуществляет окисление аммиака до азотистой кислоты (NH^;-«N0₂) — первая фаза нитрификации, другая — окисление азотистой кислоты до азотной (NO2->N03) — вторая фаза нитрификации.

Представителей обеих групп относят к семейству Nitrobacteriaceae. Это одноклеточные грамотрицательные бактерии. Среди нитрифицирующих бактерий есть палочковидные клетки, эллиптические, сферические, извитые и дольчатые, плеоморфные. Размеры клеток колеблются от 0,3 до 1 мкм в ширину и от 1 до 3 мкм в длину. Существуют подвижные и неподвижные формы с полярным, субполярным и перитрихальным жгутикованием.

Размножаются бактерии-нитрификаторы в основном делением, за исключением Nitrobacter, для которого характерно почкование. Почти у всех нитрификаторов хорошо развита система внутрицитоплазматических мембран, значительно различающихся по форме и расположению в клетках отдельных видов. Мембраны цитоплазмы подобны мембранам фотосинтезирующих пурпурных бактерий.

Бактерии первой фазы нитрификации представлены родами: Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosolobus и Nitrosovibrio. Наиболее детально к настоящему времени изучен Nitrosomonas еигораеа (рис. 42, А). Он представляет собой короткие овальные палочки размером 0,8—1×1—2 мкм. В жидкой культуре клетки Nitrosomonas проходят ряд стадий развития. Две основные из них представлены подвижной формой и неподвижными зооглеями. Подвижная форма обладает субполярным жгутиком или пучком жгутиков.

Описаны представители и других родов бактерий, вызывающих первую фазу нитрификации.

Вторую фазу нитрификации осуществляют представители родов Nitrobacter; Nitrospira и Nitrococcus. Наибольшее число исследований проведено с Nitrobacter winogradskyi (рис. 42, Б), однако описаны и другие виды (например, Nitrobacter agilis). Клетки нитробактера имеют удлиненную, клиновидную или грушевидную форму, более узкий конец часто загнут в клювик, размеры клеток — 0,6—0,8×1—2 мкм. При почковании дочерняя клетка обычно подвижна, так как имеет один полярный жгутик. Известно чередование в цикле развития подвижной и неподвижной стадий.

Описаны и другие виды бактерий, вызывающие вторую фазу нитрификации.

Нитрифицирующие бактерии культивируют на простых минеральных средах, содержащих аммиак или нитриты (окисляемые субстраты) и диоксид углерода (основной источник углерода). Источником азота для этих организмов служат аммиак, гидроксил амин и нитриты.

Нитрифицирующие бактерии развиваются при pH 6,0—8,6, оптимум реакции среды составляет pH 7,5—8,0. При значениях ниже pH 6 и выше pH 9,2 бактерии не развиваются. Оптимальная температура для развития нитрификаторов 25—30 °С. Изучение отношения различных штаммов Nitrosomonas еигораеа к температуре показало, что некоторые из них имеют оптимум развития при 26 °C или около 40 °C, другие способны довольно быстро расти при 4 °C.

Рис. 42. Нитрифицирующие бактерии:

А — Nitrosomonas еигораеа; Б — Nitrobacter winogradskyi

Нитрификаторы — облигатные аэробы^[1]. Используя кислород воздуха, они окисляют аммиак до азотистой кислоты (первая фаза нитрификации):

а затем азотистую кислоту до азотной (вторая фаза нитрификации):

Следовательно, аммиак — продукт жизнедеятельности аммонифицирующих бактерий — использует для получения энергии Nitrosomonas, а нитриты, образующиеся в процессе жизнедеятельности последних, служат источником энергии для Nitrobacter.

Согласно современным представлениям процесс нитрификации осуществляется на цитоплазматической и внутрицитоплазматических мембранах и проходит в несколько этапов. Первым продуктом окисления аммиака становится гидроксиламин, затем превращающийся в нитроксил (NOH) или пероксонитрит (ONOOH), последний, в свою очередь, преобразуется в дальнейшем в нитрит, а нитрит в нитрат. Весь процесс нитрификации иллюстрирует следующая схема:

Нитроксил, как и гидроксиламин, по-видимому, может димеризоваться в гипонитрит или превращаться в закись азота N₂0 — побочный продукт нитрификации. Кроме первой реакции (образования гидроксиламина из аммония), все последующие превращения сопровождаются синтезом макроэргических связей в виде АТФ.

Нитрификаторы осуществляют фиксацию С0₂ через восстановительный пентозофосфагный цикл (цикл Кальвина). В результате последующих реакций образуются не только углеводы, но и другие важные для бактерий соединения — белки, нуклеиновые кислоты, жиры и т. д.

Долгое время нитрифицирующих бактерий относили к облигатным хемолитоавтотрофам. Позднее были получены данные о способности этих бактерий использовать некоторые органические вещества. Так, отмечено стимулирующее действие на рост Nitrobacter нитрита, дрожжевого автолизата, пиридоксина, глутаминовой кислоты и серина. Предполагают, что некоторые нитрифицирующие бактерии обладают способностью переключаться с автотрофного на гетеротрофное питание. Однако нитрификаторы не растут на обычных питательных средах, так как большое количество легкоусвояемых органических веществ, содержащихся в таких средах, задерживает их развитие. Однако в природе такие бактерии хорошо развиваются в черноземах, навозе, компостах, т. е. в местах, где содержится много органического вещества.

Указанное противоречие оказывается несущественным, если сравнивать количество легкоокисляемого углерода в почве с теми концентрациями органического вещества, которые нитрификаторы должны выдерживать в культурах. Так, органическое вещество почв представлено главным образом гуминовыми веществами, на которые приходится в черноземе 71—91% общего углерода, а легко усвояемые водорастворимые органические вещества составляют не более 0,1% общего углерода. Следовательно, нитрификаторы не встречают в почве больших количеств легкоусвояемого органического вещества.

Накопление нитратов происходит с неодинаковой интенсивностью на разных почвах. Чем богаче почва, тем больше соединений азотной кислоты она может накапливать. Существует метод определения доступного растениям азота в почве по показаниям ее нитрификационной способности. Следовательно, интенсивность нитрификации можно использовать для характеристики агрономических свойств почвы.

Вместе с тем при нитрификации происходит лишь перевод одного питательного для растений вещества — аммиака в другую форму — азотную кислоту. Нитраты, однако, обладают некоторыми нежелательными свойствами. В то время как ион аммония поглощается почвой, соли азотной кислоты легко вымываются из нее. Кроме того, нитраты восстанавливаются в результате денитрификации до N₂, что также обедняет азотный запас почвы. Все перечисленное существенно снижает коэффициент использования нитратов растениями.

В растительном организме соли азотной кислоты перед включением в синтез должны быть восстановлены, на что тратится энергия. Аммоний же используется непосредственно. В связи с этим ученые поставили вопрос о возможности искусственного снижения интенсивности нитрификации при помощи специфических ингибиторов, подавляющих активность бактерий-нитрификаторов и безвредных для других организмов. Уже предложены многочисленные промышленные препараты ингибиторов нитрификации (2-хлор-6-(трихлорметил)-пиридин, нитропирин и др.), синтезированные на пиридиновой основе. Ингибиторы нитрификации подавляют только первую фазу нитрификации и не действуют на вторую, а также на гетеротрофную нитрификацию. При применении ингибиторов нитрификации (нитропирин) эффективность азотных удобрений повышается с 50 до 80%.

Гетеротрофная нитрификация.

Способны осуществлять нитрификацию и некоторые гетеротрофные микроорганизмы. К ним относятся бактерии из родов Pseudomonas, Arthrobacter, Corynebacterium, Nocardia и отдельные виды грибов из родов Fusarium, Aspergillus, Penicillium, Cladosporium. Установлено, что Arthrobacter sp. в присутствии органических субстратов вызывает окисление аммиака с образованием гидроксиламина, а затем нитрита и нитрата. Некоторые бактерии вызывают нитрификацию таких азотсодержащих органических веществ, как амиды, амины, гидроксамовые кислоты, нитросоединения (алифатические и ароматические), оксимы и др. Однако считают, что гетеротрофная нитрификация не служит источником энергии для перечисленных организмов.

Гетеротрофная нитрификация встречается в естественных условиях (почвах, водоемах и других субстратах). Она может приобретать главенствующее значение, особенно в атипичных условиях (например, при высоком содержании органических Си N-соединений в щелочной почве и т. п.). Гетеротрофные микроорганизмы не только способствуют окислению азота в таких условиях, но и вызывают образование и накопление токсичных веществ, соединений канцерогенного и мутагенного, а также химиотерапевтического действия. В связи с тем что некоторые из перечисленных соединений вредны для человека и животных даже в относительно низких концентрациях, тщательно изучают возможность их образования в природе.

• [1] В последние годы обнаружена способность бактерий к анаэробному окислениюаммиака. Этот процесс, получивший название «анаммокс» (Апаттох), играет важнуюроль при очистке сточных вод. Осуществляющие его бактерии относятся к группе план-ктомицетов. СПримеч. ред.)