Медицинская биотехнология и генная инженерия. 
Микробиологические основы антимикробной профилактики и терапии

Достижения научнотехнического прогресса способствовали развитию новых биологических технологий создания диагностических, лечебных и профилактических препаратов, решению проблем сбалансированности питания, экологических проблем. Основные принципы биотехнологииферментация, культивирование микроорганизмов, растительных и животных клеток, генная и клеточная инженерия. Генная инженериясердцевина современной биотехнологии.

На основе достижений генетики разработаны высокоточные методы диагностики и идентификации микроорганизмовопределение плазмидного профиля, рестрикционный анализ, ДНКгибридизация, полимеразная цепная реакция (ПЦР), секвенирование и мн.др. Методы основаны на использовании ряда специфических ферментоврестриктаз (ферментов, расщепляющих ДНК в специфических участках), лигаз или синтетаз (обеспечивают соединение двух молекул), в частности ДНКлигаз (получение рекомбинантных молекул ДНК), полимераз (ДНКзависимая ДНКполимераза обеспечивает ПЦРмногократное реплицирование специфического участка нуклеотидной последовательности).

Плазмиды (Fплазмиды) и вирусы (бактериофаги) используют в генной инженерии в качестве векторов для переноса генетического материала (генов). Метод клонирования заключается в том, что выделенный фрагмент (ген) вводится в состав плазмиды или другой самореплицирующейся системы и накапливается в размножающихся клетках. Практический вариант использования: микроорганизмыпродуценты биологически активных веществ (в том числе вакцин). Гибридомную технологию используют для получения моноклональных антител (МКА).

Кроме клонирования для получения генов используют секвенирование и химический синтез. С помощью генноинженерных методов получают вакцины, антигены, диагностикумы, гормоны, иммуномодуляторы. Одним из крупных разделов биотехнологии является производство антибиотиков и различных химиотерапевтических препаратов антибактериального действия.

Методы воздействия на микроорганизмы по виду использованного фактора можно разделить на физические и химические, по характеру воздействияна неизбирательные (обеззараживаниедезинфекция, стерилизация) и избирательные (химиотерапевтические).

Физические методы.

• 1. Термическая обработкапрокаливание, кипячение, пастеризация, автоклавирование.
• 2. Облучениеультрафиолетовое, гаммаи рентгеновское, микроволновое.
• 3. Фильтрование (оптимальнобактериологические фильтры с диаметром пор около 200 нм).

Химические методы.

• 1. Неспецифического действиядезинфектанты (обработка помещений и др., антисектикиобработка живых тканей). Среди нихпрепараты йода и хлора, спирты, альдегиды, кислоты и щелочи, соли тяжелых металлов, катионные детергенты, фенолы, окислители, природные препаратыдеготь, ихтиол, хлорофиллипт.
• 2. Избирательно подавляющие жизнедеятельность микроорганизмовантибиотики и химиотерапевтические препараты.

Эре антибиотикотерапии предшествовал период разработки антимикробных химиопрепаратов. Некоторые вехи: в 1891 г. Д. А. Романовский сформулировал основные принципы химиотерапии инфекционных болезней, предложил хинин для лечения малярии, П. Эрлих в 1906 г. предложил принцип химической вариации. Синтезированы производные мышьяка сальварсан и неосальварсан, предложен химиотерапевтический индекс. Круг химиопрепаратов постепенно расширялся. В 1932 г. открыты подходы к созданию сульфаниламидных препаратов. Однако поистинне революционное значение имело открытие антибиотиков.

Одним из универсальных механизмов антогонизма микроорганизмов является синтез антибиотиков, которые тормозят рост и размножение микроорганизмов (бактериостатическое действие) или убивают их (бактерицидное действие). Антибиотикивещества, которые могут быть получены из микроорганизмов, растений, животных тканей и синтетическим путем, обладающие выраженной биологической активностью в отношении микроорганизмов.

Таких веществ известно несколько тысяч, однако реально используют значительно меньше. Существует ряд требований к антибиотикам, существенно ограничивающих их терапевтическое применение:

• — эффективность в низких концентрациях;
• — стабильность в организме и в различных условиях хранения;
• — низкая токсичность или ее отсутствие;
• — выраженный бактериостатический и (или) бактерицидный эффект;
• — отсутствие выраженных побочных эффектов;
• — отсутствие иммунодепрессивного воздействия.

Первыми открытыми антибиотиками были пенициллин (Флеминг) и стрептомицин (Ваксман).

Антибиотики могут быть разделены по происхождению, направленности и спектру действия, по механизму действия.

По происхождению антибиотики могут быть:

• — бактериального (полимиксин, грамицидин);
• — актиномицетного (стрептомицин, левомицетин, эритромицин);
• — грибкового (пенициллин);
• — растительного (рафанин, фитонциды);
• — животного происхождения (интерфероны, лизоцим).

Больше всего известно антибиотиков актиномицетного происхождения. Актиномицетыпреимущественно почвенные микроорганизмы. В условиях большого количества и разнообразия почвенных микроорганизмов их антогонизм, в том числе с помощью выработки антибиотиководин из механизмов их выживания.

По спектру действия антибиотики разделяют на:

• — действующие преимущественно на грамположительную микрофлорупенициллин, эритромицин;
• — действующие преимущественно на грамотрицательную микрофлоруполимиксин;
• — широкого спектра действия (на грам-плюс и грам-минус флору) — стрептомицин, неомицин;
• — противогрибковыенистатин, амфотеррицин, леварин, низорал;
• — противотуберкулезныестрептомицин, канамицин;
• — противоопухолевыерифампицин;
• — противовирусныеинтерферон, зовиракс, ацикловир.

Антибиотики разделяют по механизму действия:

• — ингибиторы синтеза пептикогликана клеточной стенки (пенициллин, цефалоспорин, ванкомицин, ристомицин). Действуют на имеющих клеточную стенку растущие бактерии, не действуют на Lформы, покоящиеся формы бактерий;
• — ингибиторы синтеза белка (стрептомицин, левомицетин, тетрациклин);
• — ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот, пуринов и аминокислот (налидиксовая кислота, рифампицин);
• — ингибиторы синтеза мембраны и цитоплазматической мембраны грибов (нистатин, полимиксин).

Побочное действие антибиотиков.

Для макроорганизма:

• — токсическое действие;
• — дисбактериозы;
• — аллергические реакции;
• — иммунодепрессивное действие;
• — эндотоксический шок.

Для микроорганизмов :

• — формирование атипичных форм микробов;
• — формирование антибиотикорезистентных и антибиотикозависимых форм микроорганизмов.

Биохимические и генетические механизмы лекарственной устойчивости микроорганизмов.

Существует два типа лекарственной устойчивостиестественная (природная) и приобретенная (в результате мутаций, обмена Rплазмидами др.).

Естественная лекарственная устойчивость является видовым признаком, чаще связана с недоступностью антибиотика к его мишени, т. е. невозможностью осуществления его механизма действия. В природных условиях, особенно в почве, микроорганизмы находятся в конкурентной борьбе за субстраты. Антибиотикиодин из селективных факторов отбора. Микроорганизмыпродуценты антибиотиков защищены от синтезируемых антибиотиков генетическими механизмами (генетически детерминированная устойчивость, кодируемая в хромосоме или обусловленная наличием Rплазмид). Микроорганизмы в условиях совместного обитания вынуждены вырабатывать устойчивость к антибиотикам.

Резистентность к антибиотикам у микробов может быть связана с негенетическими факторами (низкая метаболическая активность, переход в Lформу).

Основную роль в лекарственной устойчивости принадлежит Rплазмидам, способным передаваться в другие бактерии и формировать своеобразный генофонд лекарственной устойчивости микроорганизмов. Резистентность современных стафилококков к пенициллину доходит до 100%.

На биохимическом уровне в формировании резистентности могут участвовать различные механизмы.

• 1. Разрушение молекулы антибиотика (пенициллины и другие беталактамные антибиотики разрушаются ферментом беталактамазой).
• 2. Модификация структуры молекулы антибиотика, приводящая к утрате биологической активности (так действуют изоферменты).
• 3. Изменение структуры мишеней, чувствительных к антибиотику (белков 70S рибомосустойчивость к тетрациклинам, стрептомицину, макролидам, гиразк хинолонам, рнкполимеразк рифампицину, пенициллинсвязывающих белковтранспептидазк беталактамам).
• 4. Образование бактериями «обходного» пути метаболизма.
• 5. Формирование механизмов активного выведения антибиотика из клетки.

Из-за формирования антибиотикоустойчивых популяций микроорганизмов с целью эффективного лечения необходимо предварительно определять чувствительность данного антибиотика к выделенной культуре возбудителя.

Основными методами определения антибиотикочувствительности бактерий in vitro является метод серийных разведений, диффузии в агар (бумажных дисков), определение способности к продукции беталактамазы, in vivoна модели безмикробных животных, определение концентрации антибиотиков в крови и моче.

Метод диффузии в агар с применением стандартных дисков, пропитанных различными антибиотиками в определенных концентрациях (зависят от терапевтической дозы и соотвествуют рекомендациям ВОЗ). Основан на использовании стандартных питательных сред, дисков и методов. Оценка результатов связана с существованием зависимости между размером зоны подавления роста исследуемых культур вокруг дисков и значениями минимальных подавляющих концентраций (МПК)соответствующих антибиотиков (чувствительностью микроорганизмов). Имеются специальные таблицы для оценки результатов, в соответствии с которыми культуры определяют как чувствительные, умеренно устойчивые и устойчивые (резистентные) к тестируемому антибиотику.

Метод серийных разведений антибиотиков позволяет более точно определить МПК, однако из-за громоздкости применяется реже.

Беталактамазный тест (определение способности к образованию беталактамаз) чаще определяют методом дисков с нитроцефином — цефалоспорином, изменяющим окраску дисков при гидролизе. Положительный тест свидетельствует о резистентности бактерий ко всем беталактамазачувствительным пенициллинам.

Существует ряд причин, обусловливающих различную чувствительность микроорганизмов к антибиотикам in vitro и in vivo.

На антимикробную активность in vitro влияют многие факторы, в том числе :

• — рН среды;
• — компоненты среды;
• — концентрация микроорганизмов;
• — условия и время культивирования.

На антимикробную активность препаратов in vivo также влияют различные факторы, из которых необходимо отметить:

• — фармакодинамику препарата в организме (скорость всасывания, выведения, расщепления и т. д.);
• — локализацию микробов в организме (особенно внутриклеточную локализацию).