Техника проведения анализа

Нанесение пробы. Анализируемую жидкую пробу наносят на линию старта с помощью капилляра, микрошприца, микропипетки, осторожно касаясь слоя сорбента (диаметр пятна на линии старта — обычно от одного до нескольких миллиметров). Если на линию старта наносят несколько проб, то расстояние между пятнами образцов на линии старта не должно быть меньше 2 см. По возможности используют концентрированные растворы. Пятна сушат на воздухе, после чего проводят хроматографирование.

Развитие хроматограмы (хроматографирование). Процесс проводят в закрытых хроматографических камерах, насыщенных парами растворителя, используемого в качестве ПФ, например, в стеклянном сосуде, покрытом сверху крышкой. В зависимости от направления движения ПФ различают восходящую, нисходящую и горизонтальную хроматографию.

— В варианте восходящей хроматографии ПФ наливают на дно камеры (в качестве последней можно использовать стеклянный химический стакан подходящего размера со стеклянной крышкой), хроматографическую пластинку помещают вертикально или наклонно в камеру так, чтобы слой ПФ на дне камеры смачивал нижнюю часть пластинки (ниже линии старта на ~1,5- 2 см). ПФ перемещается за счет действия капиллярных сил снизу вверх (против силы тяжести) сравнительно медленно.

В варианте нисходящей хроматографии ПФ подается сверху и перемещается вниз вдоль слоя сорбента пластинки. Сила тяжести ускоряет движение ПФ. Такой вариант реализуют при анализе смесей, содержащих компоненты, медленно перемещающиеся с ПФ.

В варианте горизонтальной хроматографии пластинку помещают горизонтально. Можно использовать прямоугольные или круглые пластинки. При применении круглых пластинок (круговой вариант горизонтальной хроматографии) стартовую линию обозначают в виде окружности подходящего радиуса (~1,5−2 см), на которую наносят пробы. В центре круглой пластинки вырезают отверстие, в которое вставляют фитиль для подачи ПФ. Последняя перемещается вдоль слоя сорбента от центра круга к его периферии. Хроматографирование проводят в закрытой камере — эксикаторе или в чашке Петри. При круговом варианте можно одновременно анализировать до нескольких десятков проб.

Расшифровка хроматограмм. Если пятна на хроматограмме окрашены, после высушивания пластинок определяют расстояние от линии старта до центра каждого пятна и вычисляют коэффициенты подвижности. Если же в состав анализируемой пробы входят бесцветные вещества, дающие неокрашенные, т. е. визуально не идентифицируемые пятна на хроматограмме, необходимо провести детектирование этих пятен, для чего хроматограммы проявляют. Рассмотрим некоторые наиболее распространенные методы детектирования.

Облучение ультрафиолетовым светом. Используется для обнаружения флуоресцирующих соединений (пятна светятся при облучении пластинки УФ-светом) или нефлуоресцирующих веществ, но с применением сорбента с флуоресцирующим индикатором (сорбент светится, пятна не светятся). Таким образом детектируют, например, алкалоиды, антибиотики, витамины и другие лекарственные вещества.

Термическая обработка. Высушенную после хроматографирования пластинку осторожно нагревают (до ~200 °C), избегая потемнения слоя самого сорбента (например, тогда, когда тонкий слой сорбента содержит крахмал). При этом пятна проявляются обычно в виде коричневых зон (за счет частичного термолиза органических компонентов).

Химическая обработка. Хроматограммы проявляют, обрабатывая их реагентами, которые образуют окрашенные соединения с разделяемыми компонентами смесей. Для этих целей применяют различные реагенты: пары йода, аммиака, брома, диоксида серы, сероводород, специально приготовленные растворы, которыми обрабатывают пластинки. Применяют как универсальные, так и селективные реагенты (понятие «универсальные» достаточно условно).

Универсальными реагентами могут служить, например, концентрированная серная кислота (при нагревании наблюдается потемнение пятен органических соединений), кислый водный раствор перманганата калия (зоны наблюдаются в виде коричневых пятен на фиолетовом фоне сорбента), раствор фосфорно-молибденовой кислоты при нагревании (появляются синие пятна на желтом фоне) и т. д.

Селективные реагенты:

• — реактив Драгендорфа; -реактив Циммермана;
• — водный аммиачный раствор сульфата меди (10% по, 2% - по аммиаку);
• — смесь нингидрина с этанолом и уксусной кислотой.

Реактив Драгендорфа представляет собой раствор основного нитрата висмута, иодида калия и уксусной кислоты в воде. Используется для определения аминов, алкалоидов, стероидов.

Реактив Циммермана готовят, обрабатывая раствором щелочи 2% этанольный раствор динитробензола с последующим нагреванием смеси при ~70−100 °C. Применяют для обнаружения стероидов.

С помощью нингидрина детектируют пятна аминов, аминокислот, белков и других соединений.

Применяют и некоторые другие способы детектирования пятен. Например, измеряют их радиоактивность, если некоторые из разделяемых компонентов радиоактивны, либо вводят специально добавки радиоактивных изотопов элементов, входящих в состав разделяемых составляющих смеси.

После детектирования пятен на хроматограмме проводят их идентификацию, т. е. определяют, какому соединению соответствует то или иное пятно. Для этого чаще всего используют эталонные пятна «свидетелей». Иногда пятна идентифицируют по величине коэффициентов подвижности сравнивая их с известными для данных условий величинами. Однако такая идентификация по величине часто носит предварительный характер.

Окраску флуоресцирующих пятен также используют в целях идентификации, поскольку различные соединения флуоресцируют излучением различной длины волны (разного цвета).

При химическом детектировании пятен селективные реагенты дают окрашенные пятна с соединениями определенной природы, что также используется в целях идентификации.

С помощью ТСХ можно не только открывать, но и количественно определять содержание компонентов в смесях. Для этого либо анализируют сами пятна на хроматограмме, либо извлекают разделенные компоненты из хроматограммы тем или иным способом (экстракцией, элюированием подходящими растворителями).

При анализе пятен предполагают существование определенной связи между площадью пятна и содержанием данного вещества (например, наличие пропорциональной или линейной зависимости), которую устанавливают методом построения градуировочного графика, измеряя площади пятен «свидетелей» — эталона с известным содержанием анализируемого компонента.

Иногда сравнивают интенсивность окраски пятен, полагая, что интенсивность окраски пятна пропорциональна количеству данного окрашенного компонента. Для измерения интенсивности окраски применяют различные приемы.

При извлечении разделенных компонентов из хроматограммы получают раствор, содержащий данный компонент. Последний затем определяют тем или иным аналитическим методом.