Введение. 
Характеристика и порядок проведения биотестирования

В настоящее время одним из наиболее широко применяемых методов контроля токсичности загрязнения окружающей среды является биотестирование. Этот метод основан на контроле у лабораторно-полученного биообъекта наиболее чувствительного к определенным классам загрязнителям — тест-объекта аппаратурно регистрируемой или количественно измеряемой реакции — тест-реакции.

В настоящее время, имеется значительный опыт применения самых различных биологических объектов для определения степени загрязнения окружающей среды. Микроорганизмы наиболее удобны в качестве тест-объекта в виду возможности их культивирования в стандартных условиях и популяционной реакции, обеспечивающую статистическую достоверность исследования токсикантов. При этом тест-объект должен быть хорошо изученным.

В последнее время наиболее перспективными организмами для индикации считаются микроорганизмы. Они обладают высокой чувствительностью, высокой скоростью размножения, простотой культивирования и используются в приборах и системах, предназначенных для быстрой и точной оценки состояния окружающей среды.

Биотестирование

Биотестирование — вид биологического контроля объектов окружающей среды, основанный на измерении тест-реакции тест-организма к вредному фактору, предполагающий проведения лабораторных экспериментов с живым существами. Тест-организм — специально выращенный в контролируемых условиях организм, наиболее чувствительный для данного вида биологического контроля. Тест-реакция — количественно измеряемое изменение физико-химических свойств организмов (популяций) при воздействии вредного фактора.

Любой биологический эксперимент должен проводиться при соблюдении следующих принципов:

• 1. постоянство условий;
• 2. многократной повторяемости (при сохранении результатов);
• 3. логичности;
• 4. наличия описания, позволяющего специалисту воспроизвести эксперимент (при этом его результат должен сохраняться).

Эти принципы необходимо соблюдать при лабораторных опытах, натурных наблюдений и проектировании аппаратуры.

По длительности воздействия вредных веществ на организмы различают: тесты на выявления токсичности острой (длительность менее 96 ч) и хронической (более 96 ч). В последних тестах учитывается эффект адаптации живых организмов к вредным факторам. При тестировании качества биоцидных товаров часто применяют тест-организмы, относящиеся к разным типам биотических элементов экосистемы.

В современных биотестах прослеживается переход от модельных организмов к модельным экосистемам, которые по степени глобальности делятся на макрокосмы (например, отгороженные участки моря), мезокосмы (как правило, почвенные сообщества) и микрокосмы (несколько взаимосвязанных видов организмов низших уровней). Такой подход позволяет моделировать сложные ситуации и строить прогнозы их разрешения высокой достоверностью. С другой стороны, контроль состояния модельных экосистем требует применения комплекса технических средств, способных оперативно отслеживать динамику показателей состояния, что представляет собой достаточно сложную проблему.

Для уменьшения влияния биологической изменчивости при проведении биотестирования, опыты проводят с большими группами генетически одинаковых организмов, выращенных в стандартных условиях. Это необходимо для выявления статистически значимых различий между реакциями на контрольную и опытную среду.

Следует учесть, что живые организмы очень чувствительны к веществам, содержащимся не только в воде, но и в воздухе. Окружающая среда лаборатории не должна содержать вредных веществ. Опыты должны приводиться при определенной температуре и влажности. В частности, следует обратить особое внимание на:

• · летучие вещества примышленного (пары кислот, соединения тяжелых металлов, летучие углеводороды), сельскохозяйственного (антибиотики, пестициды, токсины плесеней), бытового и санитарно-гигиенического (инсектициды, дезинфицирующие вещества) происхождения;
• · наличие ультрафиолетовых ламп или излучения с ультрафиолетовой составляющей спектра.

Биотестирование основано на достижениях биотехнологии. Биотехнологией называется промышленное использование биологических процессов на основе получения высокоэффективных форм микроорганизмов. Культур клеток, тканей растений и животных с заданными свойствами.

Для биотестирования необходимы организмы, реагирующие на низкие концентрации загрязнителя и способные сохранять хемочувствительность при изменении (в требуемом диапазоне) других факторов окружающей среды, например температуры и кислотности. Как правило, наиболее чутко реагируют на вредные вещества организмы, живущие в пресной и проточной водах.

Выбранная тест-культура должна соответствовать следующим формам:

• · биологическая значимость — тест-объект должен быть типичным представителем природной экосистемы;
• · абсолютная безвредность используемого микроорганизма;
• · хорошая изученность биохимии, физиология микроорганизма;
• · высокая чувствительность к исследуемой группе веществ;
• · доступность культивирования для любой практической лаборатории;
• · низкая стоимость получения.

Следует учитывать, что многие внешне похожие микроорганизмы могут обладать разной чувствительностью к вредным веществам и требовать разных условий содержания. Поэтому вид требуется правильно определить по характерным признакам (идентифицировать), определение может быть визуальным или с помощью аппаратурных средств.

Для выращивания любого организма необходимо соблюдать следующие правила:

• 1. регулярно проводить подкормку.
• 2. удалять продукты жизнедеятельность.

Так как согласно В. И. Вернадскому, организмы не могут развиваться в среде своих отходов.

3. Тест-объекты

биотестирование токсичность популяция Вид организма, для которого известны методы идентификации. Методики выращивания и биофизические свойства, называется штаммом.

Выращивание тест-объектов включает следующие стадии:

• · отбор штамма генетически чистого вида;
• · размножение при дозированном стандартном кормлении;
• · очистку от побочных продуктов.

Бактерии являются удобным тест-объектом по следующим причинам:

• · многочисленность популяции бактерий (от 10 в 9 степени клеток в 1 мл) повышает статистическую достоверность получаемых результатов;
• · бактерии являются элементом любой экосистемы;
• · на популяции бактерий можно проследить влияние вредного фактора на нескольких поколениях за очень короткий срок;
• · благодаря небольшим размерам клеток (единицы микрометров) микробная популяция имеет большую поверхность контакта с окружающей средой.

Генетическая информация бактерий заключается в капсулах с ДНК и рассеяна по всей цитоплазме. Поэтому их относят к прокариотам. Питание и выращивание продуктов обмена у бактерий происходит через полупроницаемую оболочку клетки.

Бактерии выращивают на питательных бульонах, содержащих полный набор микроэлементов и аминокислот. К наиболее распространенной питательной бактериальной среде относится ГРМ-бульон. Производимый из гидролизата рыбной муки.

Бактерии выращивают для получения ферментов, фармацевтических препаратов, добавок в молочные биопрдукты.

Бактерии обладают высокой скоростью размножения — популяция при благоприятных условиях удваивается каждые 30 мин. Поэтому большое значение при их выращивании имеет стерильность выращивания, при которой не допускается попадания в питательную среду других видов бактерий.

Бактерии — тип микроскопических, в большинстве одноклеточных, организмов, обладающих клеточной стенкой. У бактерий есть примитивное ядро, лишенное заметных хромосом и оболочки. Есть бактерии, содержащие зеленый пигмент-хлорофилл. Большинство бактерий имеют палочковидную или круглую форму. Впервые бактерии увидел голландский натуралист А. Левенгук (1683) через свой микроскоп.

Одни и те же виды бактерий можно найти почти повсеместно, на всех матерках. В 1 г почвы содержатся сотни тысяч или миллионы бактерий, в 1 мл воды-десятки или сотни.

Бактерии активно участвуют в круговороте веществ в природе.

Среди этих организмов немало болезнетворных, вызывающих болезни у человека, животных и растений.

В состав клеток бактерий входят те же элементы и микроэлементы, что и в состав клеток высших растений и животных. Для жизнедеятельности бактериям нужны азот, минеральные соли, углерод, витамины. Некоторые бактерии способны усваивать азот из атмосферы. К таким азотфиксирующим микроорганизмам относятся азотобактер, клубеньковые бактерии, которые используются для изготовления бактериальных удобрений.

Некоторые из бактерий используются в пищевой промышленности (например, для приготовления молочнокислых продуктов), в медицине для восстановления нормальной микрофлоры толстой кишки путем применения препаратов, содержащих лиофильно высушенные бактериальные клетки и бактериальные споры (бифидобактерии, лактобактерии, кишечные палочки), а также в биотехнологии для получения биологически активных соединений. Наибольшее распространение имеют сапрофитные бактерии. Они питаются мертвыми органическими остатками, участвуют в минерализации органических веществ — аммонификации, нитрификации, а также в фиксации азота (клостридии, азотобактеры, микобактерии, сине-зеленые водоросли и др.). Сапрофиты участвуют в круговороте углерода, кислорода, азота, фосфора, серы, железа, некоторые из них расщепляют целлюлозу, кератин, окисляют и образуют углеводороды — метан, пропан и др. Ставится вопрос о применении некоторых сапрофитов для очистки сточных вод, разрушения (биодеградации) различных отходов. Широкое применение находят сапрофиты в биотехнологии для получения различных биологически активных соединений (интерферонов, интерлейкинов, инсулина и др.).Относительно небольшую часть бактерий разделяют на патогенные и условно-патогенные. Патогенные бактерии являются возбудителями инфекционных болезней человека и животных. Условно-патогенными микроорганизмами являются представители нормальной микрофлоры человека. При ослаблении резистентности организма условно-патогенные бактерии вызывают гнойно-воспалительные процессы.

Часто в качестве тест-объекта используют инфузории Paramecium caudatum.

Инфузории Paramecium caudatum представляют царство животных, но обладают микроскопическими размерами и построены в виде одной клетки. Несмотря на простоту организации, сочетают в себе признаки отдельной клетки и целостного организма. Инфузории по своим биохимическим параметрам очень близки к высшим животным и человеку, что делает возможной экстраполяцию данных, полученных в биотестировании c инфузориями на человека. Они во многих случаях оказываются значительно чувствительнее, чем традиционно используемые лабораторные животные.

Туфелька — обитатель стоячих водоемов с большим количеством разлагающегося органического материала.

Paramecium caudatum имеет постоянную удлиненную форму с тупым передним и заостренным задним концами. Размеры инфузории — 200×40 мкм. Вся клетка покрыта тонкой и гибкой ячеистой пелликулой. Реснички покрывают всю поверхность туфельки, располагаясь продольными диагональными рядами. Оптимальная температура для данной инфузории 30 — 32 °C. Лучшее значение pH среды 6.3−7.5.

Размножаются инфузории 2−3 раза в сутки.

Преимущества Paramecium caudatum в качестве тест-объекта следующее: неприхотлива в культивировании; сочетает в себе как черты сильно усложненной клетки, так и особенности самостоятельного организма со сложными формами поведения, по чувствительности к ядрам не уступает, а часто и превосходит другие тест-объекты.

Инфузории выращиваются в нестерильных условиях при комнатной температуре в посуде из химического стекла, например в стеклянных колбах, стаканах, чашках Петри и других.

В качестве корма используют бактерии, дрожжи и их смесь, выращенные стерильно на твердых средах. При отсутствии условий для выращивания стерильного корма, можно использовать воздушносухие пекарские дрожжи.

К общим положениям по выращиванию культуры относится обязательное требование идентичности среды выращивания и среды, которая будет использована для процедур отмывания культуры от продуктов метаболизма, получения рабочей взвеси, разведения водных проб и прочих процедур с культурой. Микроорганизмы культивируются на среде Лозина-Лозинского, для приготовления которой используются дистиллированная вода, набор солей: NaCl, KCl, CaCl2, MgSO4, NaHCO3.

Культуру отмывают от продуктов метаболизма и старого корма, добавляют сухие дрожжи в количестве 50 мг на 50 мл и помещают в чашку Петри. Для поддержания культуры отмывание и кормление осуществляется 1 раз в неделю. При отмывании используют нормальную физиологическую реакцию инфузорий собираться в верхних слоях жидкости. Использование сосудов с узким длинным горлом позволяет сконцентрировать инфузории в верхней зоне и слить их в другой сосуд с минимальным количеством загрязненной культуральной среды. Концентрат разбавляют чистой средой ЛозинаЛозинского до объема 50 мл.

Определение концентрации взвеси инфузорий Концентрацию клеток необходимо контролировать в процессе выращивания культуры, при подготовке рабочей взвеси клеток и для определения величины тест-реакции.

Исходную взвесь инфузорий взболтать, отобрать с помощью пипетки 1.0см3 взвеси. К этому объему добавить 9,0 см³ 1%-ного раствора NaCl. Таким путем достигается обездвиживание инфузорий. Не дожидаясь полного обездвиживания инфузорий (примерно через 2−5 мин) из разбавленной взвеси отбирают 0,5−1,0 см³ и распределяют этот объем в виде 6−10 крупных капель на сухом стекле (например, в чашке Петри).С помощью микроскопа (лупы)подсчитывают инфузории во всех каплях. Полученный результат пересчитывают на 1 см³ исходной взвеси.