Получение вакцин. 
Определение и классификация вакцин

Наиболее просты в изготовлении живые вакцины, так как технология в основном сводится к выращиванию аттенуированного вакцинного штамма с соблюдением условий, обеспечивающих получение чистых культур штамма, исключение возможностей загрязнения другими микроорганизмами (микоплазы, онковирусы) с последующей стабилизацией и стандартизацией конечного препарата. Вакцинные штаммы бактерий выращивают на жидких питательных средах (гидролизаты казеина или другие белково-углеводные среды) в аппаратах — ферментаторах емкостью от 0,1 м³ до 1−2 м3. Полученная чистая культура вакцинного штамма подвергается лиофильному высушиванию с добавлением протекторов.

Вирусные и риккетсиозные живые вакцины получают выращиванием вакцинного штамма в эмбрионах кур или перепелов, свободных от вирусов лейкоза, либо в культурах клеток, лишенных микоплазм. Используют или первично-трипсинизированные клетки животных или перевиваемые диплоидные клетки человека. Живые аттенуированные штаммы бактерий и вирусов, применяемые для приготовления живых вакцин, получены, как правило, из природных штаммов путем их селекции или пассажей через биологические системы (организм животных, эмбрионы кур, культуры клеток, питательные среды).

В связи с успехами генетики и генетической инженерии появились возможности целенаправленного конструирования вакцинных штаммов. Получены рекомбинантные штаммы вируса гриппа, а также штаммы вируса вакцины со встроенными генами протективных антигенов вируса гепатита В.

Инактивированные корпускулярные бактериальные вакцины или цельновирионные инактивированные вакцины получают соответственно из культур бактерий и вирусов, выращенных на тех же средах накопления, что и в случаях получения живых вакцин, и затем подвергнутых инактивации нагреванием (гретые вакцины), формалином (формолвакцины), ультрафиолетовым излучением (УФ-вакцины), ионизирующим излучением (радиовакцины), спиртом (спиртовые вакцины). Инактивированные вакцины ввиду недостаточно высокой иммуногенности и повышенной реактогенности не нашли широкого применения.

Производство молекулярных вакцин — более сложный технологический процесс, т. к. требует извлечения из выращенной микробной массы протективных антигенов или антигенных комплексов, очистки и концентрирования антигенов, введения в препараты адъювантов. Выделение и очистка антигенов с помощью традиционных методов (экстракции трихлоруксусной кислотой, кислотного или щелочного гидролиза, ферментативного гидролиза, высаливания нейтральными солями, осаждения спиртом или ацетоном) сочетаются с применением современных методов (скоростного ультрацентрифугирования, мембранной ультрафильтрации, хроматографического разделения, аффинной хроматографии, в т. ч. на моноклональных антителах). С помощью этих приемов удается получать антигены высокой степени очистки и концентрирования.

К очищенным антигенам, стандартизированным по числу антигенных единиц, с целью повышения иммуногенности добавляют адъюванты, чаще всего сорбенты-гели (гидрат окиси алюминия и др.).

Новые подходы к вакцинации

Получение антигенов и антител в трансгенных растениях

Существуют способы производства вирусных и бактериальных антигенов с помощью трансгенных растений [39, 40]. Поверхностный антиген вируса гепатита В, энтеротоксин кишечной палочки и гликопротеин вируса бешенства, выработанные трансгенными растениями, индуцируют синтез антител IgG с адекватной антигенной специфичностью после перорального введения мышам. Например, у мышей, которых покормили картофельными клубнями с одним или несколькими чужеродными антигенами, появлялись мукозные IgA и сывороточные IgG, специфичные в отношении данных антигенов. У свиней, накормленных трансгенным картофелем с экспрессией защитного белка, специфичного для вируса инфекционного гастроэнтерита, отмечалось существенное сокращение заболеваемости и смертности при контакте с этой инфекцией. Такой подход обладает потенциальными преимуществами, такими как низкая стоимость и возможность проведения вакцинации простым принятием в пищу той части трансгенного растения, которой человек отдаст предпочтение.

Помимо вакцинных антигенов, в растениях удалось синтезировать специфические антитела («фитоте-ла»). Антитело против Streptococcus mutans, участвующего в развитии кариеса зубов, вводилось в специально обработанную полость рта у добровольцев, тем самым обеспечивалась защита от реколонизации этим микробом на 4 месяца [41]. К настоящему времени получено много таких антител [42].

Чрескожная иммунизация

Чрескожная иммунизация подразумевает нанесение антигена вместе с адъювантным токсином (часто это холерный токсин) на интактную кожу, предварительно вымытую для облегчения пенетрации [43]. У мышей активные вещества проникают в эпидермис, где они входят в контакт с клетками Лангерганса (разновидность дендритных клеток) и захватываются ими. Затем эти клетки мигрируют через дерму по афферентным лимфатическим сосудам и попадают в регионарные лимфатические узлы, на этом пути дендритные клетки созревают и приобретают способность эффективно представлять антигены иммунной системе. В лимфатическом узле они контактируют с Т-клетками и активируют их, таким образом запуская мощную реакцию с участием антител в ответ на такие антигены, как дифтерийный анатоксин.

Производство вакцин

Пептиды, субъединицы и адъюванты

Применение пептидов, которые являются лишь частями антигенов, имеет многие преимущества, но не лишена недостатков [1]. К преимуществам относится наше знание о химическом составе продукта, кроме того, такой продукт стабилен, безопасен и содержит только важные эпитопы, реагирующие в Т-и В-лимфоцитами. Слабые стороны данного подхода связаны со следующими обстоятельствами: трудность воспроизведения конформаиии антигенных полимеров, которая характерна для многих вирусов; некоторые эпитопы В-клеток, распознаваемые нейтрализующими антителами, на самом деле, иногда состоят из несвязанных друг с другом фрагментов; пептиды легко подвергаются протеолизу. Может потребоваться несколько введений, обычно с адъювантом. Конъюгация пептидного эпитопа с белком-носителем, например, с анатоксином, может улучшить выработку антител. Первая простая пептидная вакцина, составленная из последовательностей протеинов малярийного плазмодия, дала разочаровывающие результаты у маленьких детей в странах, где малярия эндемична [44]. Эпитопы цитотоксических Т-клеток (которые обычно являются нонамерами) могут связываться с молекулами класса I системы МНС, располагающимися на поверхности дендритных клеток. Ввиду того, что дендритные клетки могут, помимо прочего, экс-прессировать костимулирующие молекулы, эти клетки могут непосредственно взаимодействовать с Т-клетками типа CD-8+ и активировать их. Данный механизм применяется в настоящее время в иммунотерапии рака, как описано ниже.

Субъединичные вакцины нередко вырабатываются с применением рекомбинантной ДНК. Иммуногенность может быть усилена, и иммунная реакция направлена на индуцирование как клеточно-опосредованного, так и гуморального реагирования, с помощью агрегатов (вырабатываемых в разных условиях), таких как иммуностимулирующие комплексы, вирусоподобные частицы, носители с антигенным покрытием и антигены в липидной капсуле [45−48]. В настоящее время испытываются и агрегаты соединенных пептидов. Так, проводятся клинические испытания вакцины против ревматизма, представляющей собой полимерный препарат соединенных пептидов из стрептококков группы, А [49]. Испытывается и полимер из плазмодийных пептидов, в который добавлен липопептид для стимуляции взаимодействия между клетками, тем самым намереваются вызвать мощную иммунную реакцию против малярии [50].

Вакцины самых простых типов нередко вводятся с адъювантными веществами для усиления иммуногенности. В качестве адъювантных веществ чаще всего применяются квасцы, которые замедляют высвобождение антигена, например, при вакцинации против гепатита В, и стимулируют образование антител. Список других веществ, используемых с этой целью, очень широк. Некоторые из них в настоящее время проходят клинические испытания [51]. В ходе первой фазы клинических испытаний вакцины против малярии показано, что квасцы и QS21 значительно увеличивали выработку антител [52].

Живые вакцины как векторы антигенов других вакцин

Высок интерес к применению вакцин, в состав которых входят ослабленные вирусы или бактерии, выступающие в качестве носителей (векторов) иных антигенов [53]. В 1982 году была впервые описана методика встраивания ДНК, кодирующей антиген другого возбудителя, в вирус вакцины [54, 55]. При инфицировании химерным вирусом вакцины, в клеточных культурах, а также в организме подопытного животного происходила экспрессия чужеродной ДНК, и при этом животное получало защиту от инфекции, вызываемой микробом-источником данной ДНК.

Экспериментально в качестве векторов используется более 20 различных ДНК-вирусов, РНК-вирусов и бактерий. Наиболее часто используются вирусы вакцины, особенно значительно ослабленный штамм Анкара, а также вирусы fowlpox и саnаryрох, которые инфицируют клетки человека, но не размножаются в них [56, 57]. Примерно 10% большого генома поксвирусов может быть заменено чужеродной ДНК, следовательно, эти векторы могут послужить для создания поливалентной вакцины. Аденовирус и Sal. typhi могут быть использованы в качестве векторов, если целью является реакция со стороны слизистых [58].

Данный подход получил новое измерение, благодаря тому, что удалось встроить ДНК, кодирующую интерлейкин-2, в химерный поксвирусный вектор [59, 60]. Цитокины, применяемые таким способом, позволяют направлять иммунную реакцию преимущественно в сторону гуморальной или в сторону клеточной иммунной реакции. Однако, у этого подхода, вероятно, имеются недостатки. Инфицирова-ние вирусом mousepox (вирус ectromelia) с экспрессией интелейкина-4 приводило к высокой смертности среди мышей, генетически устойчивых к вирусу ectromelia. Даже если эти мыши были предварительно иммунизированы, у них сохранялась значительная смертность от инфицирования вирусом ectromelia с экспрессией интерлейкина-4.

ДНК-иммунизация

Интересно, что ДНК, которая кодирует чужеродные антигены, может быть встроена с подходящим промотером в бактериальный плазмид. Внутримышечное введение этого комплекса подопытной мыши вызывает у нее иммунную реакцию против антигена, кодируемого данной ДНК. Кстати, реакция эта очень сильна, так как бактериальная ДНК, в от личие от ДНК позвоночных, оценивается позвоночными как чужеродная, благодаря высокому содержанию в ней неметилированных фрагментов CpG [62, 63], а именно, фрагмент GACGTT распознается мышью, a GTCGTT — человеком. Такие фрагменты, распознанные белком млекопитающего (колоколобразный рецептор 9) [64], который экс-прессируется различными клетками врожденной иммунной системы, стимулируют образование, активацию и созревание дендритных клеток. Эти клетки, в свою очередь, индуцируют, преимущественно, Тh1-реакцию, благодаря которой сдерживается немало внутриклеточных бактериальных инфекций. Препараты с фрагментами CpG эффективны и при нанесении на слизистую. В настоящее время активно проводятся клинические испытания подобных вакцин [62].

Еще один вариант технологии состоит в том, что берется небольшое число плазмид, помещается на крошечные частички-носители, которые выстреливаются «генетической пушкой», пробивающей кожу. Некоторые из таких частиц проникают прямо в дендритные (Лангергансовы) клетки, очевидно, обходя колоколообразные рецепторы типа 9 и индуцируют у мышей реакцию с уклоном в сторону активации Т-хелперов типа 2 (Th2), что ведет к активации образования антител. А вот у обезьян, если сначала запустить иммунную реакцию с помощью ДНК, введенной посредством генетической пушки, а потом усилить эту реакцию введением живого химерного вектора, то в итоге получится сильная Тh1 реакция [56, 57].

Данный подход имеет множество потенциальных преимуществ, таких как: низкая стоимость, стабильность и отсутствие инфекционных свойств (хотя иммунная реакция напоминает таковую при естественной инфекции), а также тот факт, что присутствие антител против антигена, экспрессируемого ДНК, не ослабляет иммунного ответа. Среди возможных недостатков — интеграция вводимой ДНК в геном организма-хозяина, что может привести к трансформации или туморогенезу, а также к образованию антител против ДНК. Однако, такие неблагоприятные события еще не отмечались.

Препараты, в которых антиген находится в сорбированном состоянии, называют сорбированными или адсорбированными (дифтерийный, столбнячный, ботулинический сорбированные анатоксины). Сорбент играет роль носителя и адъюванта. В качестве носителя в синтетических вакцинах предложены всевозможные полимеры.

Интенсивно разрабатывается генно-инженерный способ получения протективных белковых антигенов бактерий и вирусов. В качестве продуцентов используют обычно эшерихии, дрожжи, псевдомонады со встроенными в них генами протективных антигенов. Получены рекомбинантные штаммы бактерий, продуцирующие антигены возбудителей гриппа, коклюша, кори, герпеса, гепатита В, бешенства, ящура, ВИЧ-инфекции и др.

Получение протективных антигенов генно-инженерным способом целесообразно в том случае, когда выращивание микробов связано с большими трудностями или опасностями, или когда трудно извлекать антиген из микробной клетки. Принцип и технология получения вакцин на основе генно-инженерного способа сводятся к выращиванию рекомбинантного штамма, выделению и очистке протективного антигена, конструированию конечного препарата.

Препараты вакцин, предназначенные для иммунизации людей, проверяют на безвредность, реактогенность и иммуногенность. Безвредность включает проверку на лабораторных животных и других биологических системах токсичности, пирогенности, стерильности, аллергенности, тератогенности, мутагенности препарата.

Реактогенность, т. е. побочные местные и общие реакции на введение вакцины, оценивают на животных и при прививках людей. Иммуногенность проверяют на лабораторных животных и выражают в иммунизирующих единицах, т. е. в дозах антигена, защищающих 50% иммунизированных животных, зараженных определенным числом инфицирующих доз патогенного микроба или токсина. В противоэпидемической практике эффект вакцинации оценивают по соотношению инфекционной заболеваемости в привитых и непривитых коллективах. Контроль вакцин осуществляют на производстве в отделах бактериологического контроля и в Государственном научно-исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасовича по разработанной и утвержденной МЗ СССР нормативно-технической документации.