Структурная организация белков

Принято выделять четыре уровня структурной организации белков, которые обозначаются как первичная, вторичная, третичная и четвертичная структуры белков.

Первичная структура — последовательность соединения аминокислот в полипептидной цепи. В белковой молекуле при чередовании жестких (пептидная связь) и гибких (? -углеродный атом) участков формируется компактная укладка цепи в пространстве.

Впервые первичная структура изучена в 1954 году Сенджером для гормона инсулина. Изучение первичной структуры представляет сложный процесс и включает два основных этапа: изучение аминокислотного состава и изучение последовательности соединения аминокислот в полипептидной цепи.

• 1. Изучение аминокислотного состава белка осуществляется путём его гидролиза до аминокислот. Для разрыва прочных пептидных связей между аминокислотами используют кислотный, щелочной и ферментативный гидролиз белка. Кислотный гидролиз осуществляется кипячением раствора белка в течение 16−92 часов, при температуре 1100 с 6-нормальным раствором кислоты. Щелочной гидролиз производится кипячением раствора белка в течение 4 — 8 часов, при 1100 с 2−4 нормальным раствором NaOH. Ферментативный гидролиз происходит при участии ферментов протеиназ (пептидаз): трипсин, пепсин. В отличие от кислотного и ферментативного гидролиза ферментативный гидролиз (протеолиз) наиболее специфичен, при нём ферменты расщепляют только определённые связи в белках. Окончание процесса гидролиза оценивают по двум признакам: а) отсутствие положительной биуретовой реакции на пептидные связи и б) окончание прироста концентрации аминогрупп и карбоксильных групп в гидролизате. Динамику прироста аминогрупп и карбоксильных групп определяют методом формольного титрования, связывая формальдегидом аминогруппы аминокислот, освобождающихся при гидролизе белка. Образовавшиеся при гидролизе аминокислоты идентифицируют методом хроматографического анализа, основанном на разных физико-химических свойствах аминокислот.
• 2. Исследование последовательности аминокислот в составе белка, в свою очередь, проводится различными методами. Белки с высокой молекулярной массой предварительно подвергаются частичному ферментативному гидролизу до коротких пептидов. Затем в полученных коротких пептидах определяются последовательно более доступные для исследования концевые аминокислоты, находящиеся или на N-конце, или на С-конце пептида. С целью узнавания С — и Nконцевых аминокислот применяются ферментативные методы. Ферменты аминопептидазы отщепляют от пептида N — концевую аминокислоту, которая определяется хроматографически Ферменты карбоксипептидазы, отщепляют от белка С — концевую аминокислоту.

Кроме ферментативных используются химические методы распознавания концевых аминокислот.

А) методы исследования Nконцевых аминокислот заключаются в присоединении к Nконцевой аминокислоте какой — то «химической метки» связью, более прочной, чем пептидная связь. При последующем гидролизе Nконцевая аминокислота оказывается связанной с каким-либо химическим веществом. — меткой. С этой целью используют реактив Сенджера — динитрофторбензол С6Н5(NO2)2 °F. Этот метод неудобен, так как он предполагает одноразовое использование. В связи с этим чаще используют реактив Эдмана — фенилизотиоцианатнат С6Н5-N (S)=C. Одновременно с присоединением фенилизотиоцианата к Nконцевой аминокислоте происходит образование циклического продукта и ослабление связи N-концевой аминокислоты с полипептидной цепью. С помощью последующего мягкого гидролиза осуществляется отщепление меченой N-концевой аминокислоты с сохранением остальной части белковой молекулы. Вторая аминокислота с N-конца в результате становится концевой и распознается повторным применением реактива.

Б) Методы распознавания С — концевой аминокислоты.

Метод Акобори заключается в использовании фенилгидразина. Фенилгидразин разрывает пептидные связи в белке и присоединяется ко всем аминокислотам, кроме C-концевой. Последующий хроматографический анализ позволяет распознать С — концевую аминокислоту в составе белка.

Исследование первичной структуры имеет важное общебиологическое и медицинское значение:

• 1. первичная структура является определяющей для последующих структур белка.
• 2. знание первичной структуры белка необходимо для искусственного синтеза белков.
• 3. первичная структура определяет видовую специфичность, например, в белке инсулине, обычно в середине молекулы у различных видов животных и человека происходит замена, как правило, 3-х равноценных аминокислот.
• 4. изменения в первичной структуре могут приводить ко многим болезням, например, к серповидно клеточной анемии, при которой в гемоглобине в? — цепи в 6 положении глютаминовая кислот заменяется на валин. Эта замена на неравноценную аминокислоту приводит к нарушению функции гемоглобина и появлению серповидной формы эритроцитов.

Вторичная структура — регулярно повторяющаяся форма укладки полипептидной цепи в пространстве. Чаще всего в белках встречается 2 вида вторичной структуры:? — спираль и? — структура.

• ? — спираль в 1951 году изучена Л. Полингом с помощью рентгеноструктурного метода. Она представляет собой правозакрученную спиральную структуру, в одном витке которой укладывается 3,6 аминокислоты. Шаг спирали (расстояние между соседними витками) составляет 0,54 н.м.? — спираль фиксируется водородными связями, которые замыкаются между пептидными связями, образованными каждой 4-ой аминокислотой. Вторичная? — структура укладывается самопроизвольно и определяется первичной структурой белка. Доля участков, уложенных в спиральную структуру, в различных белках различна. Например, в гемоглобине, миоглобине преобладает? — структурная укладка, которая в 4 раза уменьшает размеры белковой молекулы.
• ? -структура имеет вид «гармошки» и стабилизируется водородными связями между удалёнными участками одной полипептидной цепи или между несколькими белковыми молекулами. Выделяют параллельные? — структуры, в которых N и С-концы соответствуют друг другу, и антипараллельные структуры. Примером белков, преимущественно содержащих? — структуры, являются иммуноглобулины.

Вторичную структуру изучают методами рентгеноструктурного анализа, исследованием поглощения белком ультрафиолетовых лучей (чем больше доля? — структур, тем больше поглощение).