Валидация методов анализа в фармацевтической практике

Лекарственные средства представляют собой сложные химические вещества как неорганической, так и органической природы, и для контроля их качества используют весь комплекс аналитических методов анализа.

Сборником обязательных общегосударственных стандартов и положений, нормирующих качество лекарственных средств, является Государственная Фармакопея (ГФ). Последнее издание Государственной Фармакопеи (ГФ XII, вып.1, 2008 г.) включает не только классические химические методы определения подлинности препаратов, чистоты и их количественного содержания (гравиметрия, титриметрия), но в ней также широко представлены современные инструментальные методы анализа [8].

Аналитический контроль лекарственных средств или определенных ингредиентов в препарате необходим, чтобы гарантировать их безопасность и эффективность на протяжении всего срока годности, включая хранение, распределение и использование.

Аналитические методы начинают применяться на стадии разработки и испытания препаратов, технологий производства и продолжают использоваться при серийном выпуске лекарственных средств. В идеале такой контроль должен проводиться в соответствии со спецификациями, разработанными и валидированными во время разработки препарата. Это гарантирует, что спецификации качества применимы как к фармацевтической продукции, использованной для установления биологических характеристик действующих веществ, так и для дозированных лекарственных форм, предназначенных для продажи. После завершения биомедицинской экспертизы продукта качество всех последующих серий будет оцениваться только на основании этих спецификаций.

Для того чтобы аналитическая методика заняла достойное место в системе обеспечения качества, соответствовала своему назначению, то есть гарантировала достоверные и точные результаты анализа, предусмотрена процедура валидации аналитических методик.

Валидация — это процесс экспериментального подтверждения того, что аналитическая методика обеспечивает получение необходимой и достоверной информации об объекте анализа и пригодна для практического использования [12].

Необходимость валидации всех аналитических методик не вызывает сомнений — это один из элементов валидации всего процесса производства лекарств. Кроме этого, с практической точки зрения, валидация аналитических методик дает ряд существенных «вторичных» полезных эффектов.

Во-первых, при проведении валидации в процессе разработки новых методик можно своевременно выявить их недостатки и на ранних стадиях существенно улучшить методику.

Во-вторых, при грамотно и качественно выполненной работе появляется уверенность и в методике, и в качестве анализируемого препарата.

В третьих, в процессе валидации обязательно принимают практическое участие различные аналитические лаборатории. Практика валидационных экспериментов дает понимание сути методики и осознание необходимости строгого соблюдения ее параметров. В результате, при последующей эксплуатации валидированной методики значительно снижается вероятность ошибок.

Нормативная база для проведения валидации Решением правительства РФ отечественные производители лекарственных средств должны полностью перейти на международный стандарт GMP. Стандарт GMP — это набор норм, правил и указаний в отношении производства, хранения и испытания фармацевтических ингредиентов, пищи и медицинских устройств.

Переход на стандарт GMP не только обеспечит население России качественными лекарствами, но и позволит отечественным инновационным препаратам выйти на международный рынок и конкурировать с лучшей зарубежной продукцией [9].

Впервые требования GMP были сформулированы в США в 1963 году. В настоящее время около 140 государств присоединились к системе удостоверения (сертификации) качества медикаментов в международной торговле, основанной на стандартах GMP .

Итак, мировая история GMP насчитывает уже более 40 лет, поэтому международная документальная база по одному из ее разделов — валидации методик хорошо развита. В первую очередь это нормативные документы: статья фармакопеи США «Validation of Compendial Methods» и документы Международной Конференции по Гармонизации (ICH). Они содержат, во-первых, четкое определение цели валидации методик, объект применения процедуры: «…методы испытаний, используемые для оценки соответствия фармацевтических продуктов определенным техническим требованиям (спецификациям)…» [16].

Валидационные параметры Во всех нормативных документах по валидации методологическая часть начинается с определения параметров валидации.

Для валидации методик используются следующие параметры:

• · Правильность (accuracy). Правильность методики — это близость получаемых с использованием данной методики результатов к истинному значению. Правильность методики может быть определена посредством выполнения анализа образцов материала, приготовленных с количественной точностью. При возможности такие образцы должны содержать все компоненты материала, включая анализируемые. Также должны быть приготовлены образцы, содержащие анализируемое вещество в количестве примерно на 10% выше и ниже ожидаемого содержания. Правильность может быть также определена путем сравнения результатов с таковыми, полученными при использовании альтернативной методики, которая была провалидирована ранее.
• · Специальные приемы проверки и повышения правильности

Помимо общего подхода к проверке правильности результатов анализа, основанного на их сравнении с независимыми данными при помощи статистических тестов, существует ряд специальных приемов, которые позволяют выявить, а во многих случаях и существенно снизить систематическую погрешность. Рассмотрим некоторые из них [11].

1. Варьирование размера пробы.

Этот прием основан на том, что для анализа используют серию проб различного размера (например, несколько аликвот разного объема) и исследуют зависимость найденного содержания от размера пробы.

2. Релятивизация.

Релятивизация — проведение отдельных аналитических операций в как можно более идентичных и строго контролируемых условиях с тем, чтобы возможные систематические погрешности взаимно скомпенсировать.

Например, если показания весов содержат систематическую погрешность, то следует на одних и тех же весах в течение как можно более короткого промежутка времени взвесить сначала стаканчик с навеской, затем пустой стаканчик и найти массу навески по разности.

По той же причине для отбора аликвот растворов следует пользоваться одной и той же мерной посудой.

3. Рандомизация.

В отличие от релятивизации здесь, наоборот, необходимо варьировать условия анализа случайным образом в достаточно широких пределах.

Например, если каждая пипетка содержит свою систематическую погрешность объема, то для выполнения серии параллельных анализов образца можно отобрать каждую аликвоту новой пипеткой.

При этом погрешность объема, применительно к каждой отдельной пипетке являющаяся систематической, по отношению ко всему множеству пипеток становится случайной, а среднее значение объема оказывается ближе к истинному, чем полученное при использовании только одной пипетки.

Таким образом, рандомизация — это способ превращения систематической погрешности в случайную. Рандомизацию обязательно используют, например, в ходе аттестации вновь разработанных стандартных образцов: порции СО рассылают по разным лабораториям и анализируют различными методами на протяжении достаточно длительного времени [12].

• · Точность (precision). Точность методики — это степень согласованности между отдельными результатами испытаний. Она измеряется отклонением отдельных результатов от среднего значения и обычно выражается как стандартное отклонение или как коэффициент вариации (относительное стандартное отклонение), при условии использования полной методики для повторного анализа отдельных идентичных образцов, отобранных из одной и той же однородной серии материала.
• · Сходимость (внутрилабораторная вариация). Это точность методики при ее выполнении одним и тем же аналитиком при одних и тех же условиях (те же реактивы, оборудование, задание каких-либо параметров и лаборатория) и в течение короткого промежутка времени. Сходимость методики оценивается проведением полных определений на отдельных идентичных образцах, отобранных из одной и той же однородной серии материала, и таким образом обеспечивает измерение точности методики в нормальных рабочих условиях.
• · Воспроизводимость (reproducibility). Это точность методики, когда она проводится в различных условиях (обычно в разных лабораториях) на отдельных, предположительно идентичных образцах, отобранных из одной и той же однородной серии материала. Сравнение результатов, полученных разными аналитиками, при использовании разного оборудования или при проведении анализа в разное время, также может предоставить ценную информацию.

Решающую роль в улучшении воспроизводимости результатов анализа играет строгий контроль условий эксперимента.

Очевидно, что при выполнении серии анализов одного и того же образца в одной и той же лаборатории и на одном и том же приборе воспроизводимость будет выше, чем при работе с тем же образцом в разных лабораториях, на разных приборах. Поэтому любые численные характеристики воспроизводимости имеют смысл только тогда, когда указано, к каким условиям анализа они относятся.

Принято различать три основных типа таких условий, отличающихся по степени строгости их контроля [17].

• 1. Работа в максимально строго контролируемых условиях. Это означает выполнение серии анализов в одной и той же лаборатории, на одной и той же аппаратуре, одним и тем же человеком и, что немаловажно, в течение как можно более короткого промежутка времени (максимум в течение одного дня). Воспроизводимость, рассчитанная применительно к таким условиям, носит специальное название сходимость.
• 2. Выполнение серии анализов в одной лаборатории, на одном оборудовании, но, возможно, разными операторами и в разные дни. В этом случае воспроизводимость называется внутрилабораторной (по современной терминологии — промежуточной прецизионностью).
• 3. Выполнение серии анализов в разных лабораториях, на разном оборудовании, разными людьми и в разное время, т. е. варьирование условий выполнения методики в максимально широких пределах. Такая воспроизводимость называется межлабораторной [18].
• · Надежность (robustness или ruggedness). Надежность — это способность методики давать результаты анализа с приемлемой правильностью и точностью при изменении условий. Она является мерой степени влияния изменений условий работы или окружающей среды на получаемые результаты анализа отдельных, предположительно идентичных образцов из одной и той же однородной серии материала.
• · Линейность и диапазон (linearity и range). Линейность аналитической методики — это ее способность давать результаты, которые прямо пропорциональны концентрации анализируемого вещества в образцах. Диапазон методики выражается как высшая и низшая концентрации, в пределах которых продемонстрировано, что анализируемое вещество определяется с приемлемой точностью, правильностью и линейностью. Эти характеристики определяются посредством применения данной методики для выполнения анализа серии образцов, имеющих концентрации анализируемого вещества, перекрывающие требуемый диапазон [15].
• · Избирательность (selectivity). Избирательность или специфичность методики — это ее способность измерять анализируемое вещество так, чтобы быть свободной от влияния других компонентов анализируемого образца. Избирательность (или ее отсутствие) может быть выражена как отклонение результатов, полученных при применении методики для определения анализируемого вещества в присутствии ожидаемого количества других компонентов, по сравнению с результатами, полученными для этого же анализируемого вещества без добавления других веществ. Когда другие компоненты известны и доступны, избирательность может быть определена путем сравнения результатов испытания определяемого вещества в образце с добавлением и без добавления потенциально мешающих веществ.
• · Чувствительность (sensitivity). Чувствительность — это способность методики испытания регистрировать небольшие изменения концентрации. Чувствительность есть наклон калибровочной кривой.
• · Предел обнаружения (limit of detection). Предел обнаружения — это наименьшее содержание, при котором анализируемое вещество может быть обнаружено, но не обязательно определено количественно при использовании данной методики при требуемых экспериментальных условиях.
• · Предел количественного определения (limit of quantitation). Предел количественного определения — это наименьшая концентрация анализируемого вещества в образце, которая может быть определена с подходящей правильностью и точностью при применении требуемой методики. Он измеряется путем анализа образцов, содержащих уменьшающиеся количества анализируемого вещества и определением наименьшего уровня содержания, при котором может быть достигнута приемлемая степень правильности и точности. Во многих случаях предел количественного определения приблизительно в два раза выше предела обнаружения [9].

Ревалидацию (повторную валидацию) методик проводят при:

• — изменении технологии получения объекта анализа;
• — изменении состава лекарственного средства (объекта анализа);
• — изменении ранее утвержденной методики анализа.

Материалы валидации отдельных аналитических методик, включаемых в проект нормативного документа, целесообразно представлять в виде объединенного отчета о валидации. Итоговый протокол валидации аналитической методики должен содержать:

• — ее полное описание, достаточное для воспроизведения и отражающее все условия, необходимые для выполнения анализа;
• — результаты статистической обработки данных, полученных экспериментально при разработке или проверке валидируемой методики;
• — иллюстративные материалы, такие как копии хроматограмм, полученных методами ВЭЖХ или ГХ; копии электронных и ИК-спектров; фотографии или рисунки хроматограмм, полученных методами тонкослойной или бумажной хроматографии; рисунки кривых титрования;
• — заключение о пригодности валидируемой методики для включения в нормативный документ (ФСП, ФС и т. п.).