Современные методы молекулярной биологии

ПЦР. В настоящее время метод амплификации нуклеиновых кислот полимеразной цепной реакцией (ПЦР) широко используется в практической медицине. Основным достоинством метода ПЦР является чрезвычайно высокая чувствительность анализа — до 1 копии геномной ДНК возбудителя инфекции в исследуемой пробе до 100 копий генома в исследуемой пробе.

Возможности, заложенные в методе ПЦР, позволяют достигать максимальной специфичности анализа, т. е. способности выявлять ДНК конкретного инфекционного агента в присутствии ДНК других микроорганизмов и ДНК организма-хозяина. К настоящему времени метод автоматизирован и позволяет, при необходимости, получать результаты анализа в течение одного рабочего дня.

ПЦР в настоящее время используется для: ранней диагностики инфекционных заболеваний у серонегативных пациентов, когда лечение наиболее эффективно; выявления персистирующих, латентных и рецидивирующих форм инфекций; контроля эффективности лечения; диагностики оппортунистических инфекций, часто протекающих на фоне иммунодефицита, вследствие чего постановка диагноза только по результатам серологических исследований затруднена из-за имеющихся несоответствий между параметрами иммунного ответа и протёкания заболевания; разрешения сомнительных результатов серологических исследований; эпидемиологических исследований; выявления наиболее патогенных штаммов инфекционных агентов; исследования инфекционности пулированных образцов крови и ее продуктов, применяемых в терапии.

Инфекционный агент: Вирус гепатита В, Вирус гепатита С, Цитомегаловирус, Вирус простого герпеса, Вирус Эпштейна-Барра. Герпес-вирус типа 6 (HHV-6), Хламидии (trachomatis). Уреа-плазмы (urealiticum), Микоплазмы (hominis), Трихомонас (vaginalis), Гонококки (Gonorrhoeae neisseria), Гарднерелла (vaginalis), Листерии (monocytogenes), Микобактерий (tuberculosis), ВИЧ, выявление мутации в гене CKR-5 и др.

Ход исследования:

На первой стадии при температуре 94 °C (или выше) происходит денатурация двойной цепи исследуемой ДНК (стадия денатурации).

На второй стадии используют праймеры, строго специфичные к определенным участкам цепей исследуемой ДНК они связываются с этими участками ДНК (стадия отжига). На третьей стадии при температуре 70−72°С с участием термофильной ДНК-полимеразы происходит синтез новых цепей ДНК. Инициация синтеза ДНК происходит в местах связывания праймеров с исследуемой ДНК, матрицей для синтеза служат исходные цепи ДНК (стадия полимеризации).

Таким образом, за цикл, включающий три стадии, происходит удвоение каждой из двух цепей ДНК. При проведении 20 таких циклов теоретически происходит увеличение количества исходной ДНК в миллион и более раз. Образовавшийся специфический продукт ПЦР (ампликон) в подавляющем большинстве случаев детектируют методом электрофореза в агарозном или полиакриламидном гелях, сравнивая с контрольными образцами.

Для ПЦР-анализа РНК-содержаших инфекционных агентов предварительно проводят стадию обратной транскрипции — получения ДНK, комплементарной вирусной РНК-матрице, для чего используют специфические праймеры к РНК и фермент — РНК-зависимую ДНК-полимеразу (обратную транскриптазу). Далее ПЦР-анализ проводят по схеме, описанной выше.

Для ПЦР анализа используют разнообразный клинический материал: кровь, сыворотку крови, форменные элементы крови, мочу, слюну, соскобы и мазки со слизистых, ликвор, слезную жидкость, содержимое везикул, биоптаты органов и тканей. Для исключения контаминации забор проб производят только одноразовым инструментарием (шприцы, соответствующие зонды, пробоотборники и пр.). Взятый материал помещают в одноразовые пробирки (например, типа «Эппендорф») Для более эффективного использования результатов ПЦР-анализа врачами-клиницистами при постановке, подтверждении диагноза или контроле за лечением нами предложена следующая, система полуколичественной оценки результатов анализа: + - 50−500 копий геномов на пробу; ++ - 500−5000 копий геномов на пробу; +++ - 5000−50 000 копий геномов на пробу; ++++ - более 50 000 копий геномов на пробу;

Иммуноблоттинг Качественный метод, позволяющий выявлять антигены и антитела в исследуемой пробе.

Для выявления антител:

Исследуемую сыворотку больного инкубируют с известными антигенами нанесенными на нитроцеллюлозную мембрану, затем добавляют меченную диагностическую сыворотку против иммуноглобулинов человека.

Для выявления антигена:

С помощью электрофореза разделяют белки в исследуемой пробе от больного, затем их переносят на нитроцеллюлозную мембрану и добавляют меченную диагностическую сыворотку против известных антигенов Иммуноблоттинг широко применяется для подтверждения твердофазного иммуноферментного анализа.

Характеристика некоторых реакции иммунитета (РИ).