Лабораторные методы исследования системы гемостаза, диссеминированного внутрисосудистого свёртывания крови

Система гемостаза — это биологическая система, обеспечивающая, с одной стороны, сохранение жидкого состояния циркулирующей крови, с другой, — предупреждающая и купирующая кровотечения.

В осуществлении гемостаза принимают участие:

• * стенки кровеносных сосудов;
• * клетки крови, в первую очередь тромбоциты;
• * плазменная свертывающая и противосвертывающая системы;
• * фибринолитическая система.

Сосудистая стенка (эндотелий и субэндотелиальный слой) вместе с тромбоцитами осуществляют первичный сосудисто-тромбоцитарный гемостаз. Вторичный гемостаз включает активацию свертывающих плазменных факторов.

Роль сосудистой стенки в осуществлении гемостаза.

В ответ на повреждение тканей микрососуды спазмируются, что приводит к временному запустеванию капилляров и венул и кровотечение из них в первые 20—30 с не возникает. Таким образом, вазоспастическая реакция мелких сосудов является своего рода первой защитной реакцией, развивающейся при повреждении тканей. Вазоспастическая реакция обусловлена сокращением гладкомышечных клеток сосудов, развивающимся под влиянием активных веществ, вырабатываемых тромбоцитами (серотонин, тромбоксан А.,) и эндотелием (эндотелины).

Роль эндотелия в осуществлении гемостаза Эндотелий обладает сосудосуживающей и сосудорасширяющей способностями, а также антитромботическим потенциалом и способностью продуцировать вещества, которые усиливают агрегацию тромбоцитов и свертывание крови. В нормальных условиях эндотелий неповрежденных кровеносных сосудов предупреждает образование тромбов. Тромборезистентность (антикоагулянтная активность) эндотелия обусловлена: гемостаз кровотечение диссеминированный внутрисосудистый.

• * синтезом простагландина 1 или простациклина, образующегося из арахидоновой кислоты; простациклин обладает мощным антиагрегантным и сосудорасширяющим эффектом;
• * синтезом и экспрессией на цитоплазматической мембране эндотелиоцитов гликопротеина тромбомодулина, активно влияющего на тромбин. На тромбомодулине адсорбируется тромбин, после чего свойства тромбина значительно изменяются. Он теряет свою прокоагулянтную активность (способность активировать тромбоциты, факторы V и VIII и расщеплять фибриноген), но приобретает способность активизировать первичные антикоагулянты протеины С и S. Комплекс тромбомодулин + тромбин подвергается эндоцитозу и деградации в эндотелиоцитах. Тромбомодулин ингибирует также протромбиназу путем связывания фактора Ха;
• * синтезом тканевого активатора плазминогена, который стимулирует фибринолиз;
• * синтезом «ингибитора пути тканевого фактора» (ИПТФ). Он находится в гранулах эндотелиоцитов и освобождается из них при воздействии на эндотелий тромбина. ИПТФ ингибирует активность фактора Ха, затем комплекс ИПТФ + Ха взаимодействует с комплексом Villa + тканевый фактор, в результате чего подавляется каталитическая активность последнего;
• * синтезом урокиназы, обладающей тромболитической активностью;
• * синтезом антикоагулянта протеина S, который обладает самостоятельной антикоагулянтной активностью (ингибирует комплексы 1Ха—Villa и Ха—Va), а также выполняет роль кофактора, стимулирующего активность антикоагулянта протеина С;
• * экспрессией на поверхности эндотелиоцитов рецепторов для активированного антикоагулянта протеина С;
• * синтезом эндотелием из линолевой кислоты 13-гидроксиоктадекадиеновой кислоты, которая ингибирует адгезию и агрегацию тромбоцитов, а также активность тромбоксана;
• · продукцией азота оксида, который является не только вазодилататором, но и активным антиагрегантом. Антиагрегантный эффект азота оксида обусловлен активацией гуанилатциклазы тромбоцитов и угнетением рецепторов GP Ilb-IIIa;
• * фиксацией на поверхности эндотелия комплекса гепарин-антитромбин-3;
• * наличием на поверхности эндотелия отрицательно заряженных гликозаминогликанов, которые усиливают противотромботический потенциал;
• * элиминацией из крови активированных факторов свертывания.

Таким образом, неповрежденный эндотелий обладает антикоагулянтной, антитромботической активностью и обеспечивает свободный ток крови по кровеносным сосудам.

Под влиянием различных патологических факторов происходит повреждение сосудов и антитромботический эндотелиальный потенциал меняется на тромбогенный. Такими повреждающими эндотелий факторами являются экзои эндотоксины (в первую очередь бактериальные); атеросклеротический процесс; иммунные комплексы; антиэндотелиальные и антифосфолипидные антитела; медиаторы воспаления (провоспалительные простагландины, интерлейкины, фактор некроза опухоли, лейкотриены и др.); высокая активность клеточных и плазменных протеолитических ферментов (эластазы, трипсина и др.); диабетическая ангиопатия. Диагностика болезней системы крови Прокоагулянтная активность эндотелия (тромбогенный потенциал) обеспечивается:

• * продукцией фактора фон Виллебранда и тромбоксана AJ, которые стимулируют адгезию и агрегацию тромбоцитов;
• * продукцией цитокинов — фактора некроза опухоли-б и интерлейкина-1, обладающих прокоагулянтной активностью;
• * способностью синтезировать факторы, участвующие в свертывании крови (факторы V и XI, фибриноген) и активировать фактор XII;
• * экспрессией на поверхности эндотелиоцитов тканевого фактора, что резко ускоряет зависимую от фактора Vila активацию факторов IX и X, и, следовательно, образование протромбокиназы;
• * продукцией ингибиторов активатора плазминогена 1-го и 2го типов, что обусловливает угнетение фибринолиза;
• * наличием на поверхности эндотелиоцитов участков связывания для факторов IX, 1Ха, X, Ха, XII, калликреина и тромбина;
• * синтезом эндотелиоцитами эндотелина-1, который не только вызывает вазоконстрикцию, но также повышает адгезию и агрегацию тромбоцитов.

Роль эндотелия в осуществлении вазоспастических реакций Возникающая при повреждении мелких сосудов вазоконстрикторная реакция направлена на ограничение кровопотери. Она развивается под влиянием ряда биологически активных веществ, продуцируемых эндотелием и тромбоцитами. Эндотелий синтезирует вазоконстрикторные вещества — эндотелин-1 и ангиотензин-П (в эндотелиоцитах происходит превращение ангиотензина-I в ангиотензин-П).

В настоящее время известны три типа эндотелинов — эндотелии-1,2, 3. Все они оказывают влияние на сосудистый тонус, клеточную пролиферацию и синтез гормонов. Эндотелии-1 синтезируется эндотелиальными клетками. Эндотелии образуется из предшественника big-эндотелина (большого эндотелина) под влиянием эндотелинконвертирующего фермента, который локализуется в гранулах Вайбеля-Паладе эндотелиоцитов, а также на поверхности гладкомышечных клеток сосудов. Расщепление big-эндотелина происходит в эндотелиоцитах и, в меньшей степени, на поверхности клеток гладкой мускулатуры сосудов. Образование эндотелина-1 стимулируется ангиотензином-И, аргинин-вазопрессином, липопротеинами низкой плотности, трансформирующим фактором роста, щелочным фактором роста фибробластов, инсулиноподобным фактором роста-1. Синтез эндотелина-1 ингибируется азота оксидом, простациклином, PgE, атриопептидом. Существуют три типа рецепторов для эндотелинов — А, В и С. Эндотелиновый рецептор, А локализуется на гладкомышечных клетках, кардиомиоцитах, а также в ткани мозга и легких, и высокоаффинно взаимодействует с эндотелином-1. Эндотелиновый рецептор ВФизиологические основы гемостаза 5 располагается преимущественно на эндотелиоцитах и с одинаковой чувствительностью связывается со всеми тремя видами эндотелинов. В настоящее время установлено наличие двух подтипов В-рецепторов — В, и В. Эндотелиновые рецепторы В, локализуются преимущественно в эндотелиальных клетках сосудов и участвуют в процессах вазодилатации. Эндотелиновые рецепторы В присутствуют в гладкой мускулатуре сосудов и при их возбуждении развивается вазоконстрикторный эффект. Эндотелиновый рецептор типа С до сих пор остается малоизученным. Существует предположение, что действие эндотелина-3 опосредуется именно через эндотелиновый рецептор С-типа. Эндотелии-1 является мощным сосудосуживающим фактором. Вазоконстрикция, обусловленная эндотелином-1, опосредуется через эндотелиновый рецептор А. При этом наблюдается следующая последовательность: эндотелии-1 —> эндотелиновый рецептор, А на гладкомышечных клетках сосудов -> активация G-протеина -> активация фосфолипазы С. длительное повышение концентрации кальция в гладкомышечных клетках сосудов —> вазоконстрикция.

Период полувыведения эндотелина-1 составляет около 4—7 мин.

При взаимодействии эндотелина-1 с В-рецепторами развивается различный эффект в зависимости от подтипов В-рецепторов. Возбуждение В-эндотелиновых рецепторов вызывает вазодилатацию благодаря высвобождению эндотелием вазодилататоров: азота оксида, простациклина (PgI), адреномедуллина; при возбуждении В-эндотелиновых рецепторов развивается вазоконстрикция.

Эндотелин-2 продуцируется преимущественно в почках и кишечнике, в небольшом количестве — в миокарде, плаценте, матке, взаимодействует с Б-р ецепторами и также оказывает вазоконстрикторный эффект, но менее выраженный по сравнению с эндотелином-1. Эндотелин-3, подобно эндотелину-1, циркулирует в плазме крови, источник его синтеза не известен. Эндотелин-3 обнаруживается в большом количестве в головном мозге и играет большую роль в развитии и пролиферации нейронов и астроцитов. Эндотелин-3 обнаруживается также в желудочно-кишечном тракте, легких и почках. Свои эффекты эндотелин-3 реализует через Эндотелиновые В-рецепторы, при этом происходит активация фосфатидилинозитол-специфичной фосфолипазы С с последующим увеличением содержания в гладкомышечных клетках сосудов азота оксида и циклического гуанозинмонофосфата, что приводит к вазодилатации. Таким образом, в семействе эндотелинов именно эндотелии-1 играет ведущую роль в осуществлении сосудистого спазма.

Роль субэндотелия в осуществлении гемостаза Под монослоем эндотелиальных клеток располагается субэндотелий, состоящий из базальной мембраны, эластичной соединительнойДиагностика болезней системы крови ткани и коллагеповых волокон. В субэндотелиальном слое содержится ряд веществ, которые секретируются эндотелиальными клетками: эластин, ламилин, витронектин, ингибиторы протеаз, фибронектин, мукополисахариды, протеазы, фактор фон Виллебранда.

Субэндотелиальный слой играет огромную роль в осуществлении гемостаза. При повреждении эндотелия субэндотелиальный слой обнажается, происходит изменение формы тромбоцитов и начинается их адгезия. Она опосредована взаимодействием тромбоцитов с фактором фон Виллебранда, коллагеном и другими веществами, содержащимися в субэндотелии. Адгезированные тромбоциты активируются, секретируют содержимое своих гранул, что способствует агрегации, образованию тромбоцитарного тромба и активации системы свертывания крови.

Участие тромбоцитов в гемостазе Тромбоциты принимают участие в гемостазе, осуществляя следующие важнейшие функции :

• * ангиотрофическую — обеспечивают жизнеспособность и репарацию эндотелиальных клеток и поддерживают нормальную структуру и функцию стенок сосудов микроциркуляторного русла;
• * ангиоспастическую — поддерживают спазм поврежденных сосудов, секретируя вазоспастические вещества — серотонин, катехоламины, в-тромбомодулины, содержащиеся в б-гранулах тромбоцитов;
• * адгезивно-агрегационную — обладают способностью к адгезии к субэндотелию и к агрегации т. е. соединению друг с другом активированных тромбоцитов; в результате этих процессов в поврежденном сосуде образуется тромбоцитарная пробка;
• * коагуляционную — тромбоцитарные факторы принимают участие в процессе свертывания крови и в регуляции фибринолиза;
• * репаративную — тромбоциты в процессе адгезии выделяют ростовые факторы, которые стимулируют размножение и миграцию гладкомышечных клеток и эндотелиоцитов, что активирует процессы репарации в месте повреждения сосуда.

Активированные тромбоциты взаимодействуют со структурами поврежденного сосуда (в первую очередь с эндотелиоцитами), плазменными свертывающими белками, циркулирующими клетками крови, и, таким образом, оказывают выраженное влияние на гемостаз и играют большую роль в развитии тромбозов. Влияние тромбоцитов на систему гемостаза реализуется через адгезивно-агрегационную функцию и выделение биологически активных веществ. Адгезия и агрегация тромбоцитов в месте повреждения сосуда способствует не только гемостазу, но и процессам «заживления» поврежденного сосуда, так как тромбоциты выделяют ростовые факторы, стимулирующие миграцию и пролиферацию эндотелиальных и гладкомышечных клеток.

Адгезия тромбоцитов В нормальных условиях в неповрежденных сосудах тромбоциты не адгезируют (не прилипают) к эндотелию. В определенной мере это обусловлено продукцией эндотелием 13-гидроксиоктадекадиеновой кислоты (13-ГОДК), которая угнетает адгезию и агрегацию тромбоцитов, а также продукцию тромбоксана).

13-ГОДК располагается не только на поверхности эндотелия, но проникает также в базальную мембрану, находящуюся под эндотелием. При повреждении сосуда нарушается целостность эндотелия, обнажается субэндотелий, и тромбоциты прилипают к нему за несколько секунд. Адгезивная реакция тромбоцитов опосредуется взаимодействием их соответствующих гликопротеиновых рецепторов с лигандами (коллагеном, фибронектином, тромбоспондином, витронектином, ламинином, тканевым фактором, которые становятся доступными для тромбоцитов при повреждении сосуда), а также с фактором фон Виллебранда. Выраженность тромбоцитарных реакций зависит от тяжести и глубины повреждения сосудистой стенки. При небольшой степени повреждения сосуда, когда имеется только десквамация эпителия с обнажением базальной мембраны, тромбоциты прилипают к базальной мембране, распластываются на ней, но при этом не выделяют веществ, стимулирующих агрегаци. Выраженность адгезии тромбоцитов на этой стадии повреждения сосуда еще не велика, что объясняется наличием в базальной мембране определенного количества 13-ГОДК. При более тяжелом повреждении сосуда (например, при разрыве атеросклеротической бляшки) происходит обнажение более глубоких сосудистых структур. При этом тромбоциты не только прилипают к поврежденной поверхности, но и выделяют факторы, способствующие агрегации тромбоцитов и активации плазменных факторов свертывания.

Различие в особенностях тромбоцитарных реакций, вероятно, зависят от того, с каким компонентом сосудистой стенки взаимодействуют тромбоциты. Например, и гладкомышечные, и эндотелиальные клетки синтезируют коллаген, но различные его типы. Коллаген I и 111-го типов синтезируется гладкомышечными клетками, но располагается в более глубоких слоях сосудистой стенки и способствует адгезии и агрегации тромбоцитов. Коллаген IV и V-ro типов синтезируется эндотелиальными клетками, локализуется непосредственно под эндотелием, способствует адгезии тромбоцитов, но их агрегацию вызывает лишь в специфических условиях.

Главным кофактором адгезии тромбоцитов к различным видам коллагена и субэндотелию является фактор фон Виллебранда — мультимерный гликопротеин, входящий в состав комплекса антигемофильного фактора VIII плазмы. Фактор фон Виллебранда является связующим звеном между специфическими гликопротеиновыми тромбоцитарными рецепторами GPIb/IX и тканями субэндотелия. При взаимодействии GPIb/IX-рецепторов и фактора фон Виллебранда происходит активация GPIIb/111а-рецепторов, которые связываются с циркулирующим в крови фибриногеном. Под влиянием GPIIb/IIIa-рецепторов между тромбоцитами формируются фибриновые мостики и происходит локальное скопление тромбоцитов. Этот процесс называется когезией (cohesion) или сцеплением тромбоцитов. В результате указанных процессов — адгезии и когезии — в месте поврежденного эпителиального покрова сосудистой стенки на субэндотелии образуется монослой тромбоцитов.

Агрегация тромбоцитов В результате адгезии происходит активация тромбоцитов и выход содержимого их гранул в плазму. Из лизосом выделяются эндогликозидазы и ферменты, расщепляющие гепарин; из плотных гранул-кальций, серотонин, аденозиндифосфат; из б-гранул — фактор фон Виллебранда, гепариннейтрализующий протеин (4-й фактор), фибронектин, тромбоспондин, а также фактор роста фибробластов и миоцитов. Под влиянием этих биологически активных веществ, а также адреналина, тромбина, коллагена происходит агрегация тромбоцитов.

Агрегации тромбоцитов предшествует изменение их формы, обусловленное изменением направления микротубулярной системы и сокращением микрофиламентов внутри тромбоцитов, в результате чего образуются псевдоподии. Наиболее важную роль в агрегации тромбоцитов играют аденозиндифосфат, тромбин и простагландин тромбоксан. Аденозиндифосфат высвобождается из плотных гранул в ответ на стимуляцию коллагеном, адреналином или тромбоксаном. Аденозиндифосфат взаимодействует со специфическими рецепторами и вызывает необратимую агрегацию тромбоцитов. Индуцированная аденозиндифосфатом агрегация тромбоцитов зависит от специфических рецепторов GPIIb/IIIa. Под влиянием аденозиндифосфата происходит конформация рецепторов GPIIb/IIIa на поверхности тромбоцитов с последующим связыванием фибриногена. Тромбин вызывает агрегацию тромбоцитов тремя путями. Во-первых, тромбин стимулирует выделение аденозиндифосфата, который вызывает необратимую агрегацию тромбоцитов. Во-вторых, тромбин активирует фосфолипазу тромбоцитарных мембран, инициируя, таким образом, синтез тромбоксана. В-третьих, тромбин может индуцировать агрегацию тромбоцитов непосредственно, независимо от вышеназванных двух механизмов. Тромбоксан является метаболитом арахидоновой кислоты, образуется под влиянием ферментов циклооксигеназы и тромбоксансинтетазы и индуцирует агрегацию тромбоцитов как непосредственно, так и в качестве синергиста аденозиндифосфата, тромбина и коллагена. Наряду с агрегационным эффектом тромбоксан оказывает выраженный сосудосуживающий эффект, что также способствует гемостазу. В эндотелиоцитах из арахидоновой кислоты под влиянием ферментов циклооксигеназы и простациклинсинтетазы образуется простагландин простациклин, который ингибирует агрегацию тромбоцитов и оказывает дилатирующий эффект. Соотношение тромбоксана, продуцируемого тромбоцитами, и простациклина, синтезируемого эндотелиоцитами, определяет гемостатическую реакцию в месте повреждения сосуда.

Свертывающие факторы крови и пути их активации.

Активация свертывающих факторов крови обеспечивает вторичный (плазменный) гемостаз, входе которого образуются нити тромбина, скрепляющие агрегаты тромбоцитов, образовавшиеся в ходе первичного гемостаза. В результате вторичного гемостаза формируется полноценный тромб, обеспечивающий остановку кровотечения и предупреждение повторных кровотечений.

Ингибиторы свертывания крови (антикоагулянтная система) Наряду с системой свертывания крови существует антикоагулянтная система, представленная различными ингибиторами свертывания крови. Свертывающая система крови и антикоагулянтная система в норме находятся в хорошо сбалансированных отношениях. В задачи антикоагулянтной системы входит препятствовать активации факторов свертывания, предупреждать возникновение массивного внутрисосудистого тромбоза, ограничить свертывающую реакцию местом повреждения. Все образующиеся в организме антикоагулянтные вещества можно подразделить на 2 группы:

• * первичные антикоагулянты — вещества, синтезируемые постоянно, независимо от свертывания и фибринолиза крови, и с постоянной скоростью выделяемые в кровоток;
• * вторичные антикоагулянты — вещества, образующиеся из факторов свертывания крови и других белков в результате гемокоагуляции и фибринолиза.

Первичные антикоагулянты.

• 1. Антитромбин-III'— важнейший первичный антикоагулянт, его также называют ко-фактором гепарина I. Антитромбин-Ш является гликопротеином с молекулярной массой около 58 000 дальтон, синтезируется гепатоцитами, мегакариоцитами и эндотелиоцитами. Антитромбин-Ш постоянно циркулирует в плазме крови, ингибирует следующие факторы свертывания, являющиеся сериновыми протеазами —факторы IXa, Xa, XIa, ХПа и тромбин. Скорость нейтрализации сериновых протеаз (факторов IXa, Xa, XIa, ХИа и тромбина) антитромбином-Ш резко возрастает в присутствии гепарина. Связывание гепарина с антитромбином-Ш ускоряет образование комплекса тромбин + антитромбин-Ш + гепарин, что способствует быстрейшей инактивации тромбина. Далее гепарин диссоциирует из комплекса и связывается с другой молекулой антитромбина-Ш, участвуя в инактивации следующих молекул свертывающих факторов протеаз. Без гепарина антитромбин-Ш инактивирует тромбин очень медленно. Антитромбин-Ш является плазменным кофактором гепарина, и без антитромбина-III гепарин почти не проявляет антикоагулянтного эффекта. Антитромбин-Ш ингибирует также плазмин и калликреин. Период полужизни антитромбина-III составляет около 70 ч. Таким образом, антитромбин-Ш играет жизненно важную роль в своеобразном «мониторировании» свертывающей, фибринолитической, калликреин-кининовой системы и системы комплемента.
• 2. 2. Гепарин — сульфатированный полисахарид, вырабатывается тучными клетками, в большом количестве содержится в печени и легких. Гепарин образует комплекс с антитромбином-Ш, превращая его в антикоагулянт немедленного действия. С другой стороны, антитромбин-Ш необходим для проявления антикоагулянтного эффекта гепарина. Антитромбин-Ш и гепарин взаимно способствуют действию друг друга. Гепарин соединяется с антитромбином-Ш, при этом происходят конформационные изменения молекулы антитромбина-III, что облегчает связь его активного аргининового центра с сериновым центром тромбина, фактора Ха и других факторов свертывания — сериновых протеаз — и их инактивацию.

3. Протеины С и S играют важнейшую роль в функционировании первичной антикоагулянтной системы. Протеин С и его кофактор протеин S являются К-витаминзависимыми гликопротеинами, оба протеина синтезируются в печени. Протеин С циркулирует в крови в неактивной форме, с помощью кальциевых мостиков связывается с поверхностью эндотелиальных клеток. Протеин С активируется небольшим количеством тромбина, протеином S и тромбомодулином.

Тромбомодулин — поверхностный белок эндотелиоцитов, который связывается с тромбином. Взаимодействие тромбина и тромбомодулина опосредовано белком витронектином. Тромбин в комплексе с тромбомодулином активирует протеин С.

Активированный протеин С в комплексе с протеином S является ингибитором активных факторов свертывания Va и VIII. Протеин С существует в плазме в свободной форме, а протеин S —как в активной, свободной форме, так и в неактивной, комплементе связанной форме. Активация протеина С происходит на поверхности эндотелиальных клеток под влиянием тромбина в присутствии ионов кальция и тромбомодулина.

Гемостаз: лабораторные исследования нарушения.

Исследование сосудисто-тромбоцитарного гемостаза начинают с общих тестов:

• — времени кровотечения (показатель функции тромбоцитов) и
• — подсчета числа тромбоцитов.

Определение ломкости микрососудов с помощью пробы манжеточной компрессии (проба Кончаловского-Румпель-Лееде); определение времени кровотечения из микрососудов без дополнительной компрессии (проба Дьюка с проколом уха и др.), либо на фоне венозного стаза (сдавление плеча манжетой до 40 мм.рт.ст. с проколами или надрезами кожи предплечья) — пробы Айви и Борхгревинка и др.

Количество тромбоцитов в крови Нормальные значения: 170−350×109/л СНИЖЕНИЕ ЧИСЛА тромбоцитов (<170*109/л):

• · острый ДВС-синдром;
• · острый лейкоз и миелодиспластические синдромы;
• · гипои апластические анемии;
• · нарушение образования в организме тромбоцитопоэтина;
• · химиотерапия и лучевая терапия;
• · тромботическая тромбоцитопеническая пурпура и гемолитико-уремический синдром;
• · спленомегалия и гепатолиенальный синдром;
• · гепарин-индуцированная тромбоцитопения;
• · эклампсия и преэклампсия;
• · экстракорпоральное кровообращение;
• · гемодиализ у больных с хронической почечной недостаточностью, гемосорбция;
• · интенсивная трансфузионная терапия;
• · пароксизмальная ночная гемоглобинурия;
• · иммунные формы патологии (СКВ и др. коллагенозы, АФС, иммунная тромбоцитопеническая пурпура);
• · дефекты при получении крови для исследования — псевдотромбоцитопения в случае использования ЭДТА в качестве стабилизатора крови.

ПОВЫШЕНИЕ ЧИСЛА тромбоцитов (>350*109/л):

• · мегакариоцитарные и миелолейкозы, эритремия;
• · вторичный, реактивный тромбоцитоз в случае спленэктомии (через 1−3 недели), внутриполостные кровоизлияния после оперативных вмешательств, спустя 7−10 дней от начала подострого токсико-инфекционного ДВС-синдрома, после перенесенного острого кровотечения, при злокачественных новообразованиях (предвестник опухоли легкого, поджелудочной железы) и других причинах хронического ДВС-синдома.

Индуцированная агрегация тромбоцитов При исследовании функций тромбоцитов индуктор агрегации добавляется к плазме, обогащенной тромбоцитами. Для исследования индуцированной агрегации тромбоцитов используют физиологические индукторы, такие как тромбин, адреналин, АДФ, коллаген. Кроме того, существуют специальные индукторы, такие как ристоцетин (ристомицин). Этот индуктор инициирует связывание фактора Виллебранда с мембранным рецептором Ib-IX тромбоцитов и таким образом вызывает их агрегацию.

Для диагностики большинства наследственных и приобретенных тромбоцитопатий достаточно исследования функциональных параметров тромбоцитов с использованием четырех агонистов. Ими являются индукторы АДФ, адреналин, коллаген и ристомицин. Исследование агрегации на стекле менее чувствительно, чем с использованием агрегометра, однако быстро выполняется и используется при скрининге для отбора пациентов с грубыми нарушениями тромбоцитарного гемостаза (выраженной тромбоцитопенией или тромбоцитопатией) в группу риска для профилактики, например, интраи послеоперационных кровотечений.

Методы определения агрегации тромбоцитов:

• · с АДФ
• · с адреналином
• · с коллагеном
• · с арахидоновой кислотой
• · с тромбином
• · с ристомицином (ристоцетином)

Большие преимущества имеет графическая регистрация процесса на агрегометре, однако выполнение исследований требует большого количества плазмы и затрат времени. Агрегометры подразделяются на оптические (турбодиметрические), регистрирующие агрегацию в богатой тромбоцитами плазме по изменению её оптической плотности, и кондуктометрические, определяющие агрегацию в цельной крови по изменению электропроводности.

Исследование плазменного (коагуляционного) гемостаза Состояние коагуляционного гемостаза можно быстро оценить с помощью нескольких простых показателей — АЧТВ, ПВ, тромбинового времени и концентрации фибриногена.

Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) АЧТВ используется как скрининговый тест для оценки внутреннего каскада свертывания плазмы, скрининговой диагностики волчаночного антикоагулянта и слежения за антикоагулянтным действием гепаринов. АПТВ — более значимый тест для первичного выявления патологии, чем протромбиновое время, так как выявляет относительно часто встречающуюся гемофилию, А и В (дефицит факторов VIII и IX соответственно) и наличие волчаночного антикоагулянта.

Нормальные значения АЧТВ: 28,6−33,6 с УКОРОЧЕНИЕ АЧТВ:

• · активация внутреннего механизма свертывания при тромбозах, тромбоэмболиях. Это может быть связано с резистентностью фактора V к активированному протеину С, повышенным уровнем фактора VIII или активированных факторов свертывания;
• · при ДВС-синдроме (гиперкаогуляционная фаза);
• · возможно при нормально протекающей беременности.

УДЛИНЕНИЕ АЧТВ:

• · дефицит факторов внутреннего пути свертывания (VIII — гемофилия А, IX — гемофилия В, XI, XII) при нормальных результатах протромбинового теста;
• · дефицит факторов II, V, X в случае сопутствующей гипокоагуляции в протромбиновом тесте;
• · дефицит фактора Виллебранда;
• · гепаринотерапия обычным, нефракционированным гепарином (НГ) (тест выявляет сравнительно низкие концентрации антикоагулянта, приблизительно от 0,05 МЕ/мл крови);
• · лечение антикоагулянтами непрямого действия (АНД);
• · ДВС-синдром (потребление факторов свертывания в фазу гипокоагуляции);
• · на фоне переливаний реополиглюкина, препаратов гидроксиэтилкрахмала (инфукол, валекам, НЕS);
• · наличие волчаночного антикоагулянта;
• · мутация фактора IX;
• · дефекты при получении крови для исследования (гемолиз, передозировка цитрата натрия, забор крови из гепаринизированного катетера).

Протромбиновое время (ПВ) — широко используемый скрининговый тест для оценки внешнего каскада свертывания плазмы. ПВ обычно используется для определения активности ф. VII, контроля за лечением непрямыми антикоагулянтами, при скрининге системы гемостаза, а также для количественного определения фибриногена в автоматических коагулометрах. Результаты определения протромбинового времени могут быть представлены в различной форме.

Нормальные значения ПВ: 9,2−12,2 с УКОРОЧЕНИЕ ПВ:

• · активация внешнего механизма свертывания при различных видах внутрисосудистого свертывания крови;
• · последние недели беременности, прием пероральных контрацептивов;
• · лечение концентратами факторов протромбинового комплекса («Фейба», «НовоСевен» и др.).

УДЛИНЕНИЕ ПВ:

• · дефицит или аномалия факторов протромбинового комплекса (VII, X, V, II) в случаях приема антикоагулянтов непрямого действия (варфарин, синкумар, пелентан и др.);
• · болезни печени и желчевыводящей системы;
• · лечение нефракционированным гепарином (тест реагирует лишь на сравнительно высокие концентрации антикоагулянта, примерно от 0,5 МЕ/мл крови и выше);
• · ДВС-синдром (потребление факторов свертывания в переходную фазу и фазу гипокоагуляции);
• · на фоне переливаний реополиглюкина, препаратов гидроксиэтилкрахмала (инфукол, валекам, НЕS);
• · наличие в крови волчаночного антикоагулянта (возможно);
• · дефекты при получении крови для исследования (гемолиз, передозировка цитрата натрия, забор крови из гепаринизированного катетера).

МНО (Международное нормализованное отношение), латинская аббревиатура INR (International Normalized Ratio) — дополнительный способ представления результатов протромбинового теста, рекомендованный для контроля терапии непрямыми антикоагулянтами комитетом экспертов ВОЗ, Международным комитетом по изучению тромбозов и гемостаза и Международным комитетом по стандартизации в гематологии. МНО рассчитывается по формуле:

где ISI (International Sensitivity Index of thromboplastin), он же МИЧ (международный индекс чувствительности) — показатель чувствительности тромбопластина, стандартизующий его относительно международного стандарта. МНО — математическая коррекция, при помощи которой производится стандартизация протромбинового времени, что позволяет сравнивать результаты, полученные в разных лабораториях.

Рекомендуемые уровни гипокоагуляции при приеме варфарина:

• · высокий МНО от 2,5 до 3,0;
• · средний МНО от 2,0 до 3,0;
• · низкий МНО от 1,6 до 2,0.

Тромбиновое время Тромбиновое время (ТВ) — определение тромбинового времени является третьим по значимости базисным скрининговым тестом. Тест характеризует конечный этап процесса свертывания — превращение фибриногена в фибрин под действием тромбина, на него влияет концентрация фибриногена в плазме и наличие продуктов деградации фибрина.

Нормальные значения ТВ: 18−24 с УКОРОЧЕНИЕ ТВ:

• · гиперфибриногенемия (фибриноген 6,0 г/л и выше);
• · начальная (гиперкоагуляционная) фаза острого и подострого ДВС-синдрома.

УДЛИНЕНИЕ ТВ:

• · гепаринотерапия обычным гепарином (тест реагирует на сравнительно низкие концентрации антикоагулянта, приблизительно от 0,05 МЕ/мл крови)
• · гипофибриногенемия (фибриноген ниже 1,0 г/л) в случаях развития острого ДВС-синдрома и при тромболитической терапии (стрептокиназа, актилизе и др.). В последнем случае конечный этап свертывания крови ингибируется продуктами деградации фибриногена и фибрина (фрагментами D и D-димеров)
• · влияние других ингибиторов полимеризации фибрин-мономера (парапротеины, миеломные белки и др.)
• · дефекты при получении крови для исследования (гемолиз, передозировка цитрата натрия, забор крови из гепаринизированного катетера)

Концентрация фибриногена в плазме Количественное определение фибриногена по методу Клаусса является базисным тестом исследования гемостаза. Образование фибрина и его стабилизация представляют собой финальный этап формирования тромба, при котором растворимый фибриноген превращается в нерастворимый фибрин под действием тромбина и фактора XIII.

Фибриноген — острофазный белок. Печень синтезирует 2−5 г фибриногена в день, время полувыведения фибриногена из крови составляет около 4 дней. Концентрация его может превышать 10 г/л при тяжелых бактериальных инфекциях, при травме и тромбозе. Повышение уровня фибриногена в острой фазе воспаления, как правило, имеет транзиторный характер. У курящих людей уровень фибриногена в плазме крови несколько выше, чем у некурящих. К значительному росту фибриногена приводят заболевания почек (пиелонефрит, гломерулонефрит, гемолитико-уремический синдром), коллагенозы (ревматоидный артрит, узелковый периартериит), пароксизмальная ночная гемоглобинурия, новообразования (рак легкого). При атеросклерозе наблюдается устойчивое увеличение уровня фибриногена, трудно корригируемое лекарственными препаратами. В результате риск сердечно-сосудистых заболеваний повышается с возрастанием исходного содержания фибриногена в интервале 3,0−4,5 г/л. Обнаружено, что повышение уровня фибриногена в плазме крови больных сердечно-сосудистыми заболеваниями предшествует развитию инфаркта миокарда и инсульта. Корреляция между уровнем фибриногена и развитием этих осложнений особенно четко прослеживается у пациентов молодого и среднего возраста. Определение уровня фибриногена — наиболее чувствительный тест для выявления бессимптомных стадий заболевания периферических артериальных сосудов.

Нормальные значения фибриногена: 2,75- 3,65 г/л СНИЖЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ФИБРИНОГЕНА:

• · острый ДВС-синдром;
• · дисфибриногенемии.

ПОВЫШЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ФИБРИНОГЕНА:

• · инфекционные, воспалительные и аутоиммунные процессы;
• · подострый и хронический ДВС-синдром;
• · нормально протекающая беременность.

Методы определения физиологических антикоагулянтов Протеин С Для определения протеина С разработано несколько методов: иммунохимический метод, метод с хромогенным субстратом и коагуляционный. Протеин С только в комплексе с протеином S инактивирует Vа и VIII, поэтому желательно параллельно исследовать и протеин С и протеин S.

Определение протеина С с использованием хромогенного субстрата. Этот метод прост, специфичен, легко автоматизируется. Так как протеин С — витамин-К-зависимый гликопротеин, то при лечении непрямыми антикоагулянтами (антагонистами витамина К) появляются формы протеина С, которые не обладают антикоагулянтной активностью, но определяются методами с хромогенными субстратами (так называемые PIVKA-формы). Поэтому у больных, принимающих непрямые антикоагулянты, могут быть завышенными результаты определения протеина С хромогенными методами.

Определение протеина С коагуляционным методом. Метод легко автоматизируется. Коагуляционный метод оценивает активность протеина С, фиксирующегося карбоксилированной частью на фосфолипидах. РIVKAформы не функционируют в этой системе, и тест не дает ложных результатов у пациентов, принимающих непрямые антикоагулянты или имеющих дефицит витамина К.

Исказить результаты теста могут такие факторы, как наличие мутации фактора V Лейден, присутствие в плазме волчаночного антикоагулянта, терапия гепарином. Для получения достоверных результатов очень важно качество используемой протеин-С-дефицитной плазмы.

У некоторых пациентов, принимающих непрямые антикоагулянты, выявляются чрезвычайно низкие цифры содержания протеина С. Эти результаты могут быть связаны не только с истинным дефицитом протеина С, но и с развитием резистентности фактора Vа к активированному протеину С (АПС).

Определение протеина С иммунохимическим методом. Иммунохимическое определение протеина С применяется реже, чем функциональные методы. Это объясняется тем, что данный способ выявляет только классическое снижение концентрации протеина С и не определяет его функциональную неполноценность.

В некоторых случаях при лечении больных с дефицитом протеина С непрямыми антикоагулянтами у них могут возникнуть некрозы кожи в результате рикошетных тромбозов. Если антикоагулянты назначаются в высокой дозе без поддержки гепарином, то возникает состояние, при котором протеин С очень быстро снижается (в норме время его полужизни в системе циркуляции 4−6 ч). В то же время витамин-К-зависимые факторы свертывания, в том числе протромбин, остаются еще в пределах нормы (у них период полужизни 16−20 ч). Эта ситуация может усугубляться тем, что непрямые антикоагулянты начинают назначать в случае развития тромбозов или угрожающей ситуации по тромбообразованию, когда система прокоагулянтов активирована. Быстрое снижение протеина С провоцирует в этом случае массивное тромбообразование, проявляющееся вплоть до некрозов кожи. Активность протеина С следует определять до начала лечения антикоагулянтами непрямого действия и контролировать во время лечения.

Нормальные значения протеина С: 94−124%.

ПОВЫШЕНИЕ протеина С отмечается во время беременности.

СНИЖЕНИЕ протеина С:

• · врожденный (наследственный) дефицит или аномалии протеина С;
• · геморрагическая болезнь новорожденных;
• · заболевания печени с нарушением ее функции;
• · ДВС-синдром;
• · нефротический синдром;
• · синдром острой дыхательной недостаточности;
• · менингококковый сепсис;
• · гемодиализ;
• · лечении L-аспарагиназой;
• · лечении пероральными (непрямыми) антикоагулянтами (дефицит витамина К);
• · послеродовый и послеоперационный период.

Протеин S.

Протеин S — витамин-К-зависимый белок, который является кофактором активированного протеина С. Это функция положена в основу всех известных коммерческих тест-систем определения протеина S. Описаны случаи как функционального, так и количественного дефицита протеина S. При проведении тестов важно помнить, что протеин S присутствует в плазме частично в свободном состоянии, частично в комплексе с С4-связывающим протеином (С4-СП), но активна только свободная форма протеина S.

Определение протеина S коагуляционным методом. Для определения протеина S необходимо использовать тест-систему, содержащую очищенный активный протеин С, его субстрат — фактор Vа и дефицитную по протеину S плазму. Специфичность метода относительная, так как фактор V Лейден, высокий уровень ф. VIII и волчаночный антикоагулянт могут существенно влиять на результаты теста, а именно: с этими факторами часто проводят дифференциальную диагностику, определяя протеин S.

Так как коагуляционный метод подвержен действию многих интерферирующих факторов и не стандартизирован, то предпочитают использовать иммунохимический метод.

Определение протеина S иммунохимическим методом. Иммунохимический метод достаточно широко распространен. Наборы последних разработок позволяют определять «свободный протеин S» прямо без предварительной обработки. Недостатком иммунохимического метода является то, что он выявляет протеолитически неактивные формы протеина S, которые иногда появляются в плазме.

Нормальные значения протеина S: 81−111%.

УМЕНЬШЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ (активности) протеина S:

• · врожденный (наследственный) дефицит;
• · врожденное (наследственное) уменьшение свободной фракции протеина S;
• · заболевания печени с нарушением ее функции;
• · ДВС-синдром;
• · нефротический синдром;
• · системная красная волчанка;
• · лечение L-аспарагиназой;
• · лечение пероральными (непрямыми) антикоагулянтами;
• · прием эстрогенов (пероральных контрацептивов);
• · беременность, послеродовый период;
• · наличие аутоантител к протеину S.

Антитромбин III.

Для определения активности антитромбина III (АТ) чаще всего используют метод с хромогенным субстратом. Антитромбин расщепляет субстрат, в результате чего образуется окрашенный продукт, количество которого зависит от исходной активности антитромбина III. Существуют также иммунохимические (турбидиметрия, нефелометрия) и коагуляционные методы.

Тест может применяться для мониторинга лечения гепарином. Длительная гепаринотерапия может приводить к снижению активности АТ в плазме. Лечение высокими дозами гепарина, особенно нефракционированным гепарином, приводит к транзиторному снижению АТ по механизму потребления, особенно у больных с тяжелой патологией, при критических состояниях, при ДВС-синдроме, сепсисе, злокачественных опухолях.

У новорожденных уровень АТ составляет около 50% и достигает уровня взрослых к 6 мес. Небольшое снижение АТ наблюдается в середине менструального цикла, в преди послеродовом периоде, при токсикозах второй половины беременности, в послеоперационном периоде. Эти сдвиги более выражены у пациентов с группой крови, А (II), а также у пожилых.

Нормальные значения АТ: 86 — 116%.

СНИЖЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ (активности) АТ:

• · врожденный (наследственный) дефицит или аномалии АТ (снижение активности или чувствительности к гепарину);
• · заболевания печени (опухоли, цирроз, алкогольный гепатит);
• · нефротический синдром (протеинурия свыше 5 г/л);
• · карцинома легких;
• · ДВС-синдром;
• · множественные травмы, тяжелые роды, поздние гестозы;
• · прием эстрогенов (пероральных контрацептивов), кортикостероидов;
• · лечение L-аспарагиназой.

УВЕЛИЧЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ (активности) АТ:

• · во время менструации;
• · острый вирусный гепатит, холестаз;
• · лечение пероральными (непрямыми) антикоагулянтами.

Используемая литература.

• 1. Окороков Н. А. том 5 «Диагностика болезней внутренних органов», 2005 год
• 2. Баркаган З. С., Момот А. П. «Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза.» — М.: «Ньюдиамед-АО», 2008.