Получение иммуноферментных препаратов для экспресс-диагностики туберкулёза

ПОЛУЧЕНИЕ ИММУНОПЕРОКСИДАЗНОГО КОНЪЮГАТА

Иммуноферментный анализ является наиболее перспективным при иммунодиагностике возбудителя туберкулёза у человека и животных. Однако внедрение его в широкую практику сдерживается значительным количеством ложноположительных результатов, обусловленных атипичными сапрофитными микобактериями и низкой чувствительностью при использовании туберкулиновых антигенов (Лопаткин О.Н., Кронгауз И. В., 1993).

Нами проведены исследования по получению высококачественных иммунопероксидазных конъюгатов для выявления микобактерий туберкулёза.

Для конструирования иммуноферментных диагностикумов использо-ваны водорастворимые антигены микобактерий туберкулёза и гипериммунные сыворотки, полученные на их основе. Так как наблюдались перекрёстные реакции туберкулёзных сывороток с нетуберкулёзными микобактериями и сапрофитами, проведена их сорбция по технологии, представленной в главе 3. Иммуноглобулины из гипериммунных сывороток выделяли с помощью каприловой кислоты (Steibuch G., Andran R., 1969).

Для ковалентного связывания фермента — пероксидазы хрена («Сиг-ма» США) с иммуноглобулинами выбран метод перйодатного окисления (Nakane P.K., Kawaoi A., 1974). Конъюгацию пероксидазы хрена с иммуноглобулинами осуществляли в два этапа: сначала получали активированное производное пероксидазы, содержащее альдегидные группы, далее проводили диализ. На втором этапе альдегидная группа пероксидазы, взаимодействуя с аминогруппой антител, образовывала конъюгат, формируя азометиновую связь.

Краткое изложение биотехнологии получения конъюгата выглядит следующим образом: пероксидазу в количестве 5 мг растворяли в 1 мл 0,3 М раствора натрия углекислого. Добавляли 0,025 мл 0,32% раствора формалина, перемешивали на магнитной мешалке в течение 30 минут, затем вносили 1 мл 0,04 М раствора перйодата натрия и перемешивали. По истечении времени инкубации добавляли 1 мл 0,16 М раствора этиленгликоля и перемешивали 1 час. Все перечисленные операции проводили при температуре (22+4) 0С. Затем раствор диализовали против 0,01 М КББ раствора рH 9,5 при 4 0С в течение 18 часов. Раствор переносили во флакон, добавляли 1 мл туберкулёзных иммуноглобулинов с концентрацией от 2,5 до 10 мг/мл, перемешивали 2 часа при температуре (22+4) 0С и вносили 5 мг боргидрида натрия, оставляя без перемешивания на 2 часа при 4 0С. Раствор диализо-вали против 0,1 М ФСБ рН 7,2 в течение 18 часов при 4 0С.

Очистку конъюгата от несвязавшегося фермента осуществляли мето-дом гель-фильтрации с использованием сефадекса G-100 на установке LKB-2137 (Швеция). В качестве элюата применяли 0,1 М ФСБ рН 7,2−7,4. Фракции собирали в объеме 3,0 мл и исследовали светопоглощение каждой из них при длинах волн 280 нм и 403 нм. Фракции, имеющие Rz (соотношение экс-тинций при длинах волн 403 и 280 нм — области максимального поглощения пероксидазы хрена и белка), равное 0,4 — 0,6, объединяли. Во фракции добавляли бычий сывороточный альбумин из расчета 10 мг на 1 мл. Фракции разливали в ампулы по 0,1 мл и лиофилизировали. В результате контроля активности установлено, что для иммобилизации достаточной является концентрация белка 5 мг/мл, так как при использовании 10 мг/мл показатель соотношения экстинции пероксидазы хрена и белка, а также активность препарата оставались на том же уровне при большем расходе белка (таблица 5).

Конъюгат лиофилизировали на лиофильной установке LZ-9C. Препа-рат был стабилен без потери активности в течение 1 года и соответствовал всем необходимым медико-биологическим требованиям.

Примечание: Rz — показатель соотношения экстинции при спектрофотомет-рии пероксидазы хрена при длине волны 403 нм и белка при 280 нм.

Полученные конъюгаты исследовали на активность, специфичность и чувствительность. Рабочий титр и специфическую активность конъюгатов определяли по методике M. Clark и A. Adams (1977) в «сэндвич» -варианте ИФА, оптимизируя некоторые параметры. В работе использовали полистироловые планшеты для иммунологических реакций Красноярского завода.

Планшеты сенсибилизировали туберкулёзными иммуноглобулинами в концентрации 100 мкг/мл в объеме 0,1 мл КББ рН 9,5, инкубировали 3 часа при температуре 37 0C. Несорбированные иммуноглобулины удаляли, в лунки вносили по 0,1 мл туберкулёзного водорастворимого антигена с концентрацией белка 0,1 мг/мл, инкубировали 1 час при температуре 37 0С.

Несвязавшиеся антигены удаляли, планшеты промывали 5-кратно по 34 мин 0,05% раствором твин-20 в ФСБ и просушивали. Затем вносили по 0,1 мл разведенного пероксидазного конъюгата от 1:100 до 1:800, инкубировали 1 час при температуре 37 0С. После промывки добавляли по 0,1 мл свежеприготовленного субстрат-индикаторного раствора (0,1 М раствор лимонной кислоты с 0,2 М раствором натрия фосфорнокислого однозамещенного рН 5,0 в присутствии 0,006% перекиси водорода и ортофенилендиамина в концентрации 0,4 мг/л) и инкубировали 10 мин при температуре.

(22 +4) 0С без доступа света. Для остановки реакции использовали 2 М раствор серной кислоты. Результаты реакции учитывали визуально и на фотометре ПЭО ФЭК при длине волны 492 нм путем определения оптической плотности (ОП) проб, находящихся в лунках планшета. Результаты считали положительными, если ОП исследуемого образца в 2 и более раз превосходила среднее значение ОП отрицательных контролей.

Рабочий титр разработанных нами иммунопероксидазных туберкулёзных конъюгатов всех изготовленных серий составил 1:400−1:800 с соответствующими штаммами. Чувствительность конъюгатов по водорастворимым антигенам — 50 — 100 нг/мл.

Все серии полученных конъюгатов для ИФА дали отрицательные ре-зультаты с гетерологичными штаммами (таблица 6), что свидетельствовало об их специфичности.

Кроме того, для оценки чувствительности и специфичности конъюга-тов в качестве тест-объектов использовали взвеси клеток туберкулёзных штаммов. За рабочее разведение конъюгата принимали такое максимальное разведение последнего, при котором в ИФА выявлялось минимальное количество клеток возбудителя при отсутствии окрашивания контроля. Чувствительность иммунопероксидазных конъюгатов по корпускулярным антигенам составила 5×104 — 1×105 м. к./мл (таблица 6).

Лабораторные испытания экспериментальных серий иммунопероксидазных конъюгатов показали, что они отвечают ОМБТ, предъявляемым к таким препаратам (таблица 7).

На основе полученных препаратов были сконструированы тестсистемы для экспресс-диагностики возбудителя туберкулёза, состоящие из 1 ампулы иммуноферментного конъюгата, 1 ампулы положительного контроля (взвесь туберкулёзного микроба) — 10 9 м.к./мл, 1 ампулы иммуноглобулинов туберкулёзных и необходимых ингредиентов для постановки ИФА (ФСБ, твин-20, БСА, 2 М раствора серной кислоты, ортофенилендиамина, таблетки гидроперита (перекись водорода).

На первом этапе конструирования иммуноферментного конъюгата провели подбор оптимальных условий получения препарата, в качестве ли-ганда используя иммуноглобулины туберкулёзные, полученные из адсорбированной сыворотки. Второй этап работы — оптимизация постановки анализа. Третий этап — конструирование тест-систем для экспресс-диагностики.

Одной ампулы с препаратом в объеме 0,1 мл с активностью-1:600 достаточно для проведения 300 иммуноферментных анализов с дубликатом.

Таким образом, в результате проведённых исследований получены высокоактивные (до 1:800), специфичные (отсутствуют перекрёстные реакции с гетерологичными штаммами) иммуноферментные конъюгаты, позволяющие выявлять МТБ от 5×10 4 — 1×10 5 м. к./мл.